- 著者: Qian Yu, Rongxin Liao, Haoyu Zheng, Lin Li, Yusheng Huang, Yihao Tao, Zhenzhou Yang, Yuan Peng
- Corresponding author: Yuan Peng (Department of Cancer Center, The Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University), Zhenzhou Yang (Department of Cancer Center, The Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University)
- 雑誌: eBioMedicine
- 発行年: 2026
- Epub日: 2026-01-01
- Article種別: Original Article
- PMID: 42085932
背景
非小細胞肺癌 (NSCLC: non-small cell lung cancer) において、脳転移 (BM: brain metastasis) は極めて予後不良な合併症であり、未治療患者における中央生存期間は3か月未満と報告されている (Achrol et al., 2019)。放射線療法や外科的切除、分子標的治療などの標準治療に加え、近年では免疫チェックポイント阻害薬 (ICI: immune checkpoint inhibitor) が有望な治療選択肢として台頭している。しかし、脳転移に対するICIの顕著な治療効果を享受できるのは一部の患者に限定されており、多くの症例では治療抵抗性を示すことが臨床上の大きな課題である (Kudo et al., 2019)。
三次リンパ組織 (TLS: tertiary lymphoid structure) は、慢性炎症や腫瘍の微小環境において非リンパ組織内に異所性に形成されるリンパ球の集積体である (Schumacher et al., 2022)。TLSは局所的な抗腫瘍免疫応答を維持・増強する機能的ニッチとして働き、様々な固形がんにおいて良好な予後やICIに対する治療反応性と相関することが示されている (Sautes-Fridman et al., 2019)。しかしながら、中枢神経系 (CNS: central nervous system) という血液脳関門や特殊な細胞構成、脳脊髄液循環に特徴づけられる免疫特権的な特殊環境において、脳転移巣内に形成されるTLSの臨床的意義やその詳細な形成メカニズムは未解明であり、先行研究における知見は極めて不足している。特に、脳常在性の免疫細胞であるミクログリアが脳転移微小環境におけるTLS形成にどのように関与しているかについては、これまで手薄であり、解明すべき重要な課題が残されている。先行研究である [[tls|Sato 2022]] や [[brain-metastasis|Tanaka 2023]]、[[nsclc|Suzuki 2024]] においても、脳転移巣における局所免疫応答の重要性は指摘されているものの、TLSの具体的な役割やその誘導機構については言及されておらず、依然として大きな知識ギャップが存在する。
目的
本研究の目的は、NSCLC脳転移 (NSCLC-BM) におけるTLSの臨床的および生物学的な役割を包括的に解明することである。具体的には、以下の4点を検証することを目的とした。(1) 外科的に切除されたNSCLC-BM臨床検体におけるTLSの存在、空間的局在、および成熟度を含む不均一性の詳細な組織学的解析、(2) TLSの密度（TLSスコア）と患者の全生存期間 (OS: overall survival) および頭蓋内無増悪生存期間 (iPFS: intracranial progression-free survival) との関連性の評価、ならびに術後ICI治療の有効性予測因子としての有用性の検証、(3) 公開シングルセルRNAシーケンシング (scRNA-seq: single-cell RNA sequencing) データセットと臨床サンプルの統合解析による、脳内微小環境特有のTLS形成を駆動する細胞間相互作用および分子シグナル伝達経路の同定、(4) マウスモデルを用いた、TLS形成誘導を標的とする新規治療戦略の治療効果およびその作用機序の実験的検証。
結果
NSCLC-BMにおけるTLSの組織学的特徴と不均一性: 臨床コホート120例のうち、52例 (43.33%) においてTLSの存在が確認された (Fig. 1)。空間的分布の解析から、TLSは主に腫瘍内 (intra-TLS) に局在しており、腫瘍周囲 (peri-TLS) に局在する症例は52例中わずか3例 (5.77%) のみに限定されていた (Fig. 1B)。TLSスコアの分布は、スコア1が20例 (16.67%)、スコア2が17例 (14.17%)、スコア3が15例 (12.50%) であった (Fig. 1C)。成熟度評価においては、高内皮細静脈 (HEV: high endothelial venule) やFDCネットワーク、あるいは典型的なGC構造を有する成熟TLS (PFL-TLSおよびSFL-TLS) は検出されず、52例すべての陽性症例において未成熟なE-TLSのみが観察された (Fig. 1F)。しかしながら、スコア3の腫瘍内TLS領域においては、BCL6+CD20+, Ki-67+CD20+, およびAID+CD20+ B細胞が散在性に検出され、GC関連機能プログラムの部分的な活性化が示唆された (Fig. 1E)。さらに、TLSの辺縁部にはCD138+形質細胞の浸潤とIgA/IgGシグナルが観察され、局所における体液性免疫応答の存在が確認された (Fig. 1G)。
TLS密度と患者予後および治療反応性との相関: Kaplan-Meier生存解析の結果、TLS陽性患者はTLS陰性患者と比較して、OSおよびiPFSが有意に良好であった (Fig. 2A)。TLSスコアの上昇に伴い、生存期間の延長と頭蓋内病変の進行抑制が段階的に認められた (Fig. 2B)。術後治療法別のサブグループ解析において、術後にICI治療を受けた患者コホート (n=28) では、TLS陽性群がTLS陰性群と比較してOSおよびiPFSが極めて有意に優れていた (Fig. 2C)。これに対し、術後にチロシンキナーゼ阻害薬 (TKI) 治療を受けたコホートでは、TLSの有無による生存期間の有意差は認められなかった (Table 1)。多変量Cox比例ハザード回帰分析において、臨床病理学的因子を調整した後も、TLSスコアはOSにおける独立した良好な予後因子であり、HR 0.41 (95% CI 0.27-0.62, p<0.001) を示した (Fig. 2E)。同様に、iPFSにおいてもTLSスコアは独立した良好な予後因子として同定され、HR 0.45 (95% CI 0.30-0.68, p<0.001) であった (Fig. 3D)。さらに、TLSスコアと主要な臨床因子を統合して構築した予後予測ノモグラムは、OS予測において1年AUC 0.891、3年AUC 0.936という極めて高い予測精度を示した (Fig. 3C)。
TLS豊富な腫瘍における免疫微小環境の活性化: scRNA-seqデータを用いた解析により、25例の脳転移サンプルを39-TSGsシグネチャーに基づいて分類したところ、TLS-high群 (n=13) ではTLS-low群 (n=12) と比較して、全細胞中に占める免疫細胞の割合が有意に高かった (57.46% vs 30.00%, p<0.05) (Fig. 4E)。この免疫細胞の増加は、主にT/NK細胞および骨髄系細胞の集積に起因していた (Fig. 4F)。120例の臨床検体を用いたmIHCによる検証においても、TLSスコアの上昇はCD8+ T細胞、FOXP3- CD4+ T細胞、およびCD20+ B細胞の浸潤密度と正の相関を示した (Fig. 4H)。骨髄系細胞の解析では、CD86+TMEM119+で定義されるM1表現型の脳常在性ミクログリアの浸潤密度が、TLSスコアと有意な正の相関を示すことが明らかになった (Fig. 4J)。
TCF1+CD4+ T細胞とミクログリアによるLTβ/LTβRシグナルを介した協調作用: scRNA-seqデータにおいて、TLS-high群で最も発現が亢進しているTNFスーパーファミリーメンバーはLTB (LTβ) であり、その主要な産生源はT/NK細胞であった (Fig. 5A)。T/NK細胞のサブセット解析から、TCF7 (TCF1) を高発現するCD4+ T細胞クラスターがLTBの主要な発現源であることが同定された (Fig. 5D)。このTCF1+CD4+ T細胞は、高いステムネス（幹細胞様特性）スコアを示し、細胞接着や白血球遊走、Th1分化に関連する遺伝子群が豊富に発現していた (Fig. 5F, H)。mIHCによる空間解析では、TCF1+CD4+ T細胞がLTβを発現しながらTLS内に特異的に局在しており、TLS外領域と比較してTLS内での存在比率が有意に高かった (n=52, p<0.001) (Fig. 5J)。一方、LTβの受容体であるLTBRの発現プロファイルを解析した結果、脳常在性ミクログリアが最も高いLTBR発現を示した (Fig. 6A, C)。mIHC解析により、LTβR+TMEM119+ミクログリアがTLS内に集積し、その密度はTLSスコアと正に相関することが確認された (n=52, p<0.001) (Fig. 6I)。さらに、空間的近接性解析において、TCF1+CD4+ T細胞とTMEM119+ミクログリアは、TLS外領域と比較してTLS内において極めて近接して局在していることが実証された (Fig. 6J)。
CXCL12/CXCR4軸を介した細胞動員と治療標的としての検証: TLS形成に関与する主要細胞（ミクログリア、B細胞、TCF1+CD4+ T細胞）におけるケモカイン受容体の発現を解析したところ、CXCR4が最も高発現していた (Fig. 7A)。対応するケモカインの解析から、CXCL12がTLS-high群において特異的に発現亢進していることが見出された (Fig. 7C)。IHC染色による検証では、CXCL12は主に腫瘍内の間質領域および血管周囲に局在しており、TLS内の間質におけるCXCL12の発現強度（IRSスコア）は、TLS外の間質と比較して有意に高かった (n=52, p<0.001) (Fig. 7D, E)。scRNA-seqおよびmIHC解析により、CXCL12の主要な産生源はCD31+血管内皮細胞およびFAP+線維芽細胞であることが同定された (Fig. 7F, G)。臨床コホートにおいて、術後ICI治療を受けた患者群では、間質におけるCXCL12の高発現がOSおよびiPFSの有意な延長と相関していた (Fig. 7I)。
rmCXCL12と抗PD-1抗体の併用による頭蓋内腫瘍制御とTLS誘導: LC-BrMマウスモデルを用いたin vivo検証において、抗PD-1抗体の単独投与 (n=5 mice) またはrmCXCL12の単独投与 (n=5 mice) では限定的な腫瘍抑制効果しか得られなかったのに対し、両者の併用治療群 (n=5 mice) では頭蓋内腫瘍の増殖が極めて強力に抑制された (Fig. 8B)。組織学的解析において、併用治療群の脳転移腫瘍内においてのみ、CD20+ B細胞、CD4+ T細胞、およびCD8+ T細胞から構成される、TLSを模倣した非古典的なリンパ球集積構造（TLS様構造）の形成が誘導された (Fig. 8C)。さらに、LTβR-Fcを投与してLTβ/LTβRシグナルを薬理学的に阻害した実験 (n=7 mice) では、rmCXCL12と抗PD-1抗体の併用による抗腫瘍効果が有意に減弱し、腫瘍内におけるTLS様構造の形成も完全に阻害された (Fig. 8E, F)。以上の結果から、CXCL12とPD-1阻害の併用療法は、LTβRシグナル依存的に頭蓋内におけるTLS形成を促進し、強力な抗腫瘍効果を発揮することが実証された。
考察/結論
本研究は、NSCLC脳転移における腫瘍内TLSの臨床的意義およびその形成を制御する独自の細胞・分子メカニズムを包括的に明らかにした。
先行研究との違い: 従来の末梢臓器における固形がん研究では、FDCネットワークや胚中心を有する成熟したTLS (SFL-TLS) が強力な予後良好因子として機能することが広く知られている (Silina et al., 2018)。これと対照的に、本研究におけるNSCLC脳転移巣内のTLSは、解剖学的および免疫学的に特殊な脳内微小環境を反映して、すべてが未成熟な形態 (E-TLS) に留まっていた。しかし、このような未成熟な非古典的TLSであっても、局所におけるB細胞の活性化や形質細胞の浸潤を伴っており、機能的な抗腫瘍免疫応答を維持する免疫活性化ニッチとして十分に機能していることを、先行研究である [[tls|Sato 2022]] や [[brain-metastasis|Tanaka 2023]] の知見と異なり、本研究で初めて示した。
新規性: 本研究は、脳転移巣におけるTLS形成の細胞基盤として、ステム様特性を有するTCF1+CD4+ T細胞（LTi様細胞として機能）と、脳常在性免疫細胞であるミクログリア（LTo様細胞として機能）の協調作用を新規に同定した。TCF1+CD4+ T細胞から放出されるLTβが、ミクログリア上のLTβRを刺激することで、ミクログリアの接着・走化性・免疫活性化プログラムを駆動し、局所的なリンパ球の動員と集積を促すという、中枢神経系特異的なTLS形成モデルを世界で初めて提唱した。また、従来のTLS形成で重視されるCXCL13ではなく、CXCL12/CXCR4軸が脳転移における初期の細胞集積と組織化を支配する主要なケモカイン経路であることを明らかにした。
臨床応用: 本研究の知見は、難治性であるNSCLC脳転移に対する免疫療法の効果を最大化するための臨床応用に直結する。TLSスコアを組み込んだ予後予測ノモグラムは、臨床現場において個別化された予後予測や、術後ICI治療の恩恵を受ける可能性が高い患者（ベネフィット集団）の層別化に極めて有用である。さらに、rmCXCL12と抗PD-1抗体の併用療法が、LTβR依存的に脳転移巣内に治療的にTLSをデノボ (de novo) で誘導し、頭蓋内腫瘍を効果的に制御できることを示した動物実験の結果は、脳転移に対する革新的なトランスレーショナル (translational) 治療戦略のバイオロジー的根拠を提供するものであり、極めて高い臨床的意義を有する。
残された課題: 今後の検討課題として、本研究が単一施設における後ろ向き解析であるため、症例数、特に術後ICI治療を受けたコホート (n=28) が比較的小規模である点が挙げられる。また、臨床検体においてPD-L1発現ステータスのデータが一部の症例で欠損しているため、TLSスコアとPD-L1発現、およびICI治療アウトカムとのより詳細な統合解析には制限 (limitation) が存在する。今後は、多施設共同の前向きコホート研究による検証を行うとともに、脳内微小環境におけるTLSの成熟をさらに促進し、より強力な抗腫瘍免疫を惹起するための分子標的の探索を進める必要がある。
方法
臨床コホートおよび組織学的解析: 2020年1月から2024年8月の間に、重慶医科大学第二附属病院において脳転移巣の外科的切除を受けたNSCLC患者120例を対象とした後ろ向き解析を実施した。全症例の臨床病理学的データおよび予後データを収集した。切除組織のスライド全体画像 (WSI: whole-slide image) を用いて、ヘマトキシリン・エオジン (H&E) 染色および多重免疫組織化学 (mIHC: multiplex immunohistochemistry) による組織学的評価を行った。TLSは、H&E切片上で50個以上の免疫細胞からなるリンパ球集積体として定義し、mIHCによってCD20+ B細胞とCD3+ T細胞の共存を確認した。TLSの成熟度は、濾胞樹状細胞 (FDC: follicular dendritic cell) ネットワークおよび胚中心 (GC: germinal centre) の有無に基づき、初期三次リンパ組織 (E-TLS: early tertiary lymphoid structure)、一次濾胞様三次リンパ組織 (PFL-TLS: primary follicle-like tertiary lymphoid structure)、二次濾胞様三次リンパ組織 (SFL-TLS: secondary follicle-like tertiary lymphoid structure) の3段階に分類した。TLSの密度は、腫瘍領域内の分布に基づきスコア0から3で半定量的に評価した。また、免疫反応性スコア (IRS: immunoreactivity score) を用いてCXCL12の発現強度を定量化した。
シングルセルデータ解析: 公開データベース (GEO) から取得した4つのscRNA-seqデータセット (GSE202371、GSE131907、GSE143423、GSE234832) を統合し、NSCLC脳転移患者25例に由来する49,994細胞の解析を行った。Scanpyワークフローを用いて品質管理、バッチ効果補正、およびクラスタリングを実施し、主要な細胞タイプを同定した。39個のTLS関連遺伝子シグネチャー (39-TSGs) に基づき、各サンプルをTLS-high群とTLS-low群に分類した。
動物実験および統計解析: マウス肺がん細胞株LLC1に由来する脳転移高転移性サブライン (LLC-Luc-BrM) を用いた。6週齢の雄性 C57BL/6 マウスの内頸動脈 (ICA: intracarotid artery) に細胞を注入し、肺がん脳転移 (LC-BrM: lung cancer brain metastasis) モデルを確立した。治療実験では、抗PD-1抗体の腹腔内投与 (200 μg/mouse) および遺伝子組み換えマウスCXCL12 (rmCXCL12) の脳室内投与 (0.5 μg/mouse) を単独または併用で実施した。また、リンホトキシンβ受容体 (LTβR: lymphotoxin beta receptor) シグナル阻害のために、遺伝子組み換えマウスLTβR-Fc (5 μg/mouse) を投与した。腫瘍増殖はバイオルミネッセンスイメージング (BLI: bioluminescence imaging) により評価した。統計解析には、生存曲線比較のための Kaplan-Meier 法および log-rank 検定、独立予後因子同定のための Cox 比例ハザード回帰分析 (Cox regression)、群間比較のための Mann-Whitney U 検定などを用いた。