- 著者: Kai Kudo, Yoshimi Miki, Joaquim Carreras, Shunya Nakayama, Yasushi Nakamoto, Masatoshi Ito, Etsuko Nagashima, Kei Yamamoto, Hiroshi Higuchi, Shin-ya Morita, Asuka Inoue, Junken Aoki, Kiyoshi Ando, Naoya Nakamura, Makoto Murakami, Ai Kotani
- Corresponding author: Makoto Murakami (University of Tokyo); Ai Kotani (Tokai University)
- 雑誌: Cell Metabolism
- 発行年: 2022
- Epub日: 2022-03-15
- Article種別: Original Article
- PMID: 35294862
背景
細胞外小胞 (EV) は、細胞間コミュニケーションにおいて、タンパク質やマイクロRNA (miRNA) などの様々なカーゴを伝達する媒体として広く研究されてきた (Alvarez-Erviti et al. 2011)。腫瘍由来EVは、がん細胞から間質細胞へのタンパク質、mRNA、miRNAの移動を促進することで、腫瘍の発生と転移をサポートすることが知られている (Hoshino et al. 2015; Kosaka et al. 2013)。特に、Epstein-Barrウイルス (EBV) はB細胞に強い親和性を持つヒトγヘルペスウイルスであり、細胞の不死化と異常増殖を誘導し、リンパ腫の発生につながる (Tsurumi et al. 1993; Wang et al. 1988; Young and Rickinson 2004)。臨床的には、EBV陽性リンパ腫は、ホジキンリンパ腫やびまん性大細胞型B細胞リンパ腫 (DLBCL) においてEBV陰性リンパ腫よりも予後が不良であることが報告されている (Oyama et al. 2003)。EBV誘発リンパ腫形成においては、ウイルスmiRNA (例: BART [BamHI fragment A rightward transcript]) を含むEVが食細胞に取り込まれ、リンパ腫の増殖に有利な組織微小環境を促進することが示されている (Higuchi et al. 2018; Pegtel et al. 2010)。しかし、EVの主要構成要素である脂質が腫瘍発生に果たす役割については、これまで十分に理解されていなかった。この領域には知識のギャップが存在し、EVの脂質に関する研究は不足していた。
EV膜はスフィンゴ脂質、コレステロール、ホスファチジルコリン (PC) を豊富に含み (Llorente et al. 2013; Trajkovic et al. 2008)、ホスファチジルエタノールアミン (PE) やホスファチジルセリン (PS) の表面露出はEVの受容細胞への取り込みに重要であることが知られている (Higuchi et al. 2018)。また、EVはプラズマローゲンも豊富に含み、その放出と膜剛性に影響を与える可能性がある (Phuyal et al. 2015)。しかし、EVの不均一性、純度、および多数の脂質種を定量する技術的限界のため、EVにおける脂質の特性と機能に関する一般的な理解は依然として不足している。
脂質メディエーターは、様々な生物学的応答の重要な調節因子である。これには、プロまたは抗炎症作用を発揮するω-6アラキドン酸 (AA; C20:4) 由来エイコサノイド (例: プロスタグランジン [PG]、ロイコトリエン [LT]) (Samuelsson et al. 1987)、炎症の解消を促進するω-3多価不飽和脂肪酸 (PUFA) 由来の特殊化プロレゾルビング脂質メディエーター (SPM) (例: レゾルビン、マレシン、プロテクチン) (Serhan and Levy 2018)、および発生、炎症、がんに関与するリゾリン脂質メディエーター (例: リゾホスファチジン酸 [LPA]) (Aikawa et al. 2015; Uwamizu et al. 2015) が含まれる。EVにはPGやLT、およびそれらの生合成酵素が含まれることが報告されているが (Deng et al. 2013; Esser et al. 2010; Majumdar et al. 2016; Subra et al. 2010)、脂質メディエーターがEV内に実際に貯蔵または生成されるのか、そしてそれがEV依存性の生物学的イベント (炎症や腫瘍形成など) に影響を与えるのかは未解明であった。
脂質メディエーターの生合成は、ホスホリパーゼA2 (PLA2) 媒介リン脂質加水分解によって開始される。分泌型PLA2 (sPLA2) ファミリーは、11種のアイソフォームを持つ細胞外リポ分解酵素群であり、それぞれ異なる分布と基質特異性を持つ (Lambeau and Gelb 2008)。個々のsPLA2は、微小環境のシグナルに応答して、異なる脂質経路を介して幅広い病態生理学的イベントを調節する (Murakami et al. 2015, 2016)。sPLA2-IIA、-V、-Xは、in vitroでマイクロパーティクルのリン脂質を加水分解する能力を持つことが報告されているが (Barry et al. 1997; Boudreau et al. 2014; Duchez et al. 2015; Norling et al. 2011; Rousseau et al. 2015)、in vivo条件下でどの細胞外膜構造物がsPLA2の加水分解プラットフォームとして機能するかは不明であった。特に、X群分泌型ホスホリパーゼA2 (sPLA2-X; PLA2G10) はEpstein-Barrウイルス (EBV) 誘発B細胞リンパ腫で誘導されることが示されていたが、EVリン脂質加水分解とリンパ腫形成における役割は未解明であった。
目的
本研究の目的は、EBV誘発B細胞リンパ腫におけるsPLA2-X駆動の腫瘍由来EV加水分解がリンパ腫形成に果たす役割を解明し、EV脂質の腫瘍発生における非古典的機構を明らかにすることである。具体的には、sPLA2-XがEVの脂質組成、形態、および機能にどのように影響し、それがマクロファージの応答とリンパ腫の進行にどのように寄与するかを詳細に調査する。さらに、sPLA2阻害剤がin vivoでリンパ腫の増殖を抑制する可能性を評価し、ヒトDLBCL患者におけるsPLA2-X発現と予後の関連性を検証することで、sPLA2-EV軸ががん治療の新たな標的となりうるかを検討する。
結果
EBV感染腫瘍組織でのsPLA2-X誘導: EBV感染ヒト化マウスの腫瘍組織において、sPLA2アイソフォームのうちPLA2G10 (sPLA2-X) およびPLA2G2Dが非感染組織と比較して有意に高発現した (Fig 1A, S2A)。免疫組織化学的解析では、sPLA2-XはEBV感染腫瘍内のCD163+ M2様マクロファージ (TAM) に発現し、クロドロネートリポソームによるマクロファージ枯渇によりsPLA2-Xシグナルが消失した (Fig 6G, S5C, S5D)。これは、sPLA2-Xが腫瘍関連マクロファージから分泌されることを示唆する。この結果は、n=3 miceのEBV感染群と非感染群の比較から得られた。
sPLA2-XによるEV脂質プロファイルの包括的改変: Akata LCL由来PS+ EVsを組換えsPLA2-Xで処理すると、DPA > DHA > AAの順で遊離PUFAが用量依存的に放出された (Fig 1B)。また、リゾリン脂質 (LPC、LPE、プラズマローゲン型、LysoPS、LPI) も用量依存的に増加した (Fig 1C)。EV上のオートタキシンにより、産生されたLPCがLPAに逐次変換されることが確認された (Fig 1E)。sPLA2-X処理EVでは、DHA由来の抗炎症性SPMであるRvD2が特に増加した (Fig 1K, 1L)。EVは123種のPUFA代謝物のうち40種を豊富に含み、その多くはEVに結合していた (Fig 1G-1J)。sPLA2-IIDはEVからの脂質放出をほとんど起こさなかったが、sPLA2-IIFはPUFAとLPEを優先的に放出した (Fig 1B-1D, S3E, S3F)。sPLA2-X処理により、RvD2のレベルは未処理EVと比較して有意に増加し (p<0.0001)、これはn=10 replicatesの実験で確認された。
sPLA2-XによるEV形態の劇的変化: 透過型電子顕微鏡 (TEM) およびクライオ電子顕微鏡 (cryo-EM) 解析により、sPLA2-X処理されたLCL由来PS+ EVsは、未処理EVと比較して有意に小型化した (Fig 2A)。定量分析では、EVの直径が約75%縮小し、EV面積が約4.0×10¹² nm²から約1.0×10¹² nm²に減少した (Fig 2B)。qNanoおよびNanoSightによる解析でも、EVのサイズ分布が左にシフトすることが確認された (Fig 2C, 2D)。クライオ電子顕微鏡では、脂質二重膜の非対称膜構造、不規則形状、膜部分消失、凝集、融合、ルロー形成など、特徴的な形態変化が観察された (Fig 2E)。このサイズ減少は、n=118 EVsの画像解析に基づき、統計的に有意であった (p<0.0001)。
sPLA2-X処理EVによるマクロファージ取り込み促進とサイトカイン発現増加: 蛍光標識EVを用いたフローサイトメトリーにより、sPLA2-X処理EVのTHP-1マクロファージへの取り込みが6時間で1.8-fold増加した (Fig 2G)。タイムラプス共焦点顕微鏡でも2～6時間での取り込み増加が確認され (Fig 2H)、この増加はsPLA2阻害剤varespladibにより阻害されたことから、sPLA2触媒活性への依存が示された (Fig 2I)。sPLA2-X処理EVは、THP-1細胞においてIL-10およびTNFの発現を2時間以内に著明に増加させた (Fig 2M)。PBMCでも同様の結果が得られ (Fig 2N, 2O)、EBV感染細胞由来のEVがsPLA2-X処理によりマクロファージのサイトカイン発現を増強することが示された。THP-1細胞におけるIL-10発現の増加は、未処理EVと比較して約2.5-foldであり (p<0.001)、n=3 replicatesの実験で確認された。
生理活性脂質 (RvD2・LPA) による機能増強とGPCR経路の同定: RvD2はEVとの共添加により、THP-1へのEV取り込みとIL-10発現を相乗的に増強した (Fig 3B, 3C)。LPAもEVとの共添加でEV取り込みとIL-10・TNF発現を増強した (Fig 3D, 3E)。TGFαシェディングアッセイによる包括的GPCR解析では、sPLA2-X処理EVがTHP-1細胞でGPCRシグナルをより強く活性化し (Fig 3G)、この活性化はLPA受容体アンタゴニスト (AM966、Ki4625、TCLPA54) により用量依存的に抑制されたが、GPR18アンタゴニスト (PSB-CB5) では抑制されなかった (Fig 3H)。これは、LPAシグナリングが主要な経路であることを示唆する。LPA受容体アンタゴニストによるGPCR活性の抑制は、最大で約60%の減少を示した (p<0.0001)。
in vivoでのsPLA2-X処理EVによる免疫抑制・腫瘍促進: LPS誘発炎症モデルにおいて、sPLA2-X処理EV投与は血清IL-10およびTNFαレベルを著明に増加させ (Fig 4B)、脾臓胚中心形成を減少させた (Fig 4D, 4E)。LPS誘発肺傷害モデルでは、sPLA2-X処理EV投与が好中球浸潤と肺傷害スコアを改善しつつIL-10を増加させた (Fig 4H, 4I)。EBV (B95-8株) 感染ヒト化マウスにsPLA2-X処理EVを投与した群は数日以内に死亡し (Fig 5B)、sPLA2(-) EV群は3週間生存期間が延長され、対照群は実験期間中生存したことから、sPLA2-X処理EVが腫瘍形成を著明に加速することが示された。sPLA2(+) EV投与群では、脾臓の腫大、EBER+腫瘍細胞の浸潤、CD68+およびCD163+マクロファージの増加が顕著であった (Fig 5C-5F)。sPLA2(+) EV投与群の生存期間は、sPLA2(-) EV群と比較して有意に短縮された (p=0.000409, n=8 mice/group)。
sPLA2阻害によるリンパ腫抑制効果と機序の確認: EBV (Akata株) 感染ヒト化マウスモデルにおいて、varespladibの脾臓内注射は生存を有意に延長した (Fig 6B)。varespladib処理群では、EBER+腫瘍細胞、Ki67+増殖細胞、CD68+・CD163+マクロファージ、IL-10発現が著明に減少した (Fig 6E, 6F)。sPLA2-X処理EV投与によりvarespladibの保護効果は消失し (Fig 6D)、varespladibの効果がEV膜加水分解阻害に依存することが確認された。脾臓リン脂質のω3/ω6 PUFA組成もvarespladib処理で対照に近づいた (Fig 6H)。varespladib処理群の生存率は、対照群と比較して有意に改善された (p=0.00153, n=10 mice/group)。
ヒト患者サンプルでの臨床的検証: CAEBVおよびEBV(+) DLBCL患者血清由来PS+ EVsは、健常者と比較して異なるタンパク組成を示した (Fig S6F, S6G)。sPLA2-X処理により、患者由来EVからは健常者由来EVよりも多くのPUFA (AA > DHA > DPA > EPA) およびリゾリン脂質が放出された (Fig 7A, 7B)。患者由来EVでは、RvD2、12-HETE、LXB4などのPUFA由来脂質メディエーターが増加する傾向を示した (Fig 7C, 7D)。sPLA2-X処理された患者由来PS+ EVsは、Jurkat T細胞においてGPCRシグナルを有意に活性化した (Fig 7E)。ヒトDLBCLにおいて、sPLA2-X高発現は患者生存と逆相関し (Fig 7G)、EBV陰性DLBCL患者ではsPLA2-X陽性マクロファージが血清LDHおよびsIL-2Rαレベルの有意な上昇と関連した (Fig 7H)。sPLA2-X高発現群のDLBCL患者の生存期間は、低発現群と比較して有意に短縮された (p=0.00138, n=86 patients)。
考察/結論
本研究は、EVが「インターセルラーコミュニケーターとしての情報伝達粒子」という従来概念を超え、「細胞外sPLA2加水分解の構造プラットフォーム」として機能するという新しい概念を確立した。先行研究と異なり、本研究はEVリン脂質の腫瘍発生における役割を体系的に解明し、sPLA2-XがEVリン脂質を細胞外で加水分解することで、(1) 遊離PUFA・リゾリン脂質・それらの代謝物 (RvD2、LPA) を産生し、(2) EV形態を変化させ (縮小・凝集)、(3) マクロファージへの取り込みを促進し、(4) サイトカイン発現増加を来たし、(5) 腫瘍発生を加速するという多段階的な腫瘍促進カスケードを明らかにした。
新規性として、本研究はEV脂質が独立した機能的重要性を持つことを体系的に示した点で画期的である。特に、sPLA2がEV膜外から作用して「リモート脂質編集 (remote lipid editing)」によりマクロファージ機能を制御するという新概念は、これまで報告されていない。このメカニズムは、EVが単にカーゴを運ぶだけでなく、細胞外環境で動的に修飾され、その機能が変化するという新しい視点を提供する。本研究で初めて、sPLA2-XがEVのサイズと形態を変化させ、その機能に影響を与えることをin vitroおよびin vivoで実証した。
臨床応用の観点から、本研究はsPLA2阻害剤varespladibがEBV関連B細胞リンパ腫のin vivoモデル (n=10 mice/group) でリンパ腫増殖を抑制することを示した。これは、varespladibのEBV関連B細胞リンパ腫への再目的化 (repurposing) の強力な根拠となる。また、sPLA2-X発現がヒトDLBCL (n=86 patients) の不良予後と相関するという知見は、sPLA2-XがDLBCLの予後バイオマーカーとして、あるいは新規治療標的として臨床的意義を持つ可能性を示唆する。
残された課題として、RvD2は通常抗炎症性SPMとされるが、本研究ではIL-10増加など「免疫変調」的に機能しており、この文脈依存的作用の機序解明が今後の課題である。また、sPLA2-X処理EVによる腫瘍促進にはEBV miRNA BART13の移行増加が関与することが示されたが、脂質変化とmiRNA伝達の相対的寄与の定量的解析が必要である。さらに、PS+ EVsのsPLA2媒介加水分解に対する感受性が患者間で異なる理由や、sPLA2-Xが脾臓TAMで誘導されるメカニズムは不明であり、今後の研究で解明すべき点である。本研究で報告されたsPLA2-EV相互作用が、他のsPLA2アイソフォームや他のがん、あるいは炎症性疾患や代謝性疾患などの他の病態生理学的イベントに一般化できるかどうかも、さらなる調査を要する。本研究のlimitationとして、PS+ EV画分における他のエキソソーム、脂質体、リポタンパク質、および/または遊離脂質の存在とsPLA2作用への関与を完全に排除できなかった点が挙げられる。
方法
モデル系: EBV感染リンパ芽球細胞 (Akata LCL) とEBV感染ヒト化マウス (NOG mice、ヒト造血幹細胞移入) を主要モデルとして使用した。EBV非感染Jurkat T細胞を対照とした。ヒト化マウスは、2 GyのX線照射後、1 x 10⁵個のCD34+臍帯血細胞を静脈内投与することで作製された (Yahata et al. 2003)。
EV単離と品質評価: Akata LCL細胞からEVを単離するために、PS結合タンパク質Tim4を結合させたビーズによるPS捕捉法 (PS+ EVs)、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC-EVs)、および超遠心法 (UC-EVs) の3法を比較した。EVの純度評価は、MISEV (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles) 2018ガイドライン (Théry et al. 2018) に基づく包括的プロテオミクス分析により実施し、PS+ EVsがリボソーム汚染が最も少ない最高純度であることを確認した。粒子径は電子顕微鏡、qNano、およびNanoSightを用いて測定した。
脂質解析: EVおよび細胞からの脂質抽出はBligh and Dyer法 (Bligh and Dyer 1959) に従い、ESI-MS (Sciex 4000Q-TRAP) を用いて包括的脂質メタボロミクス分析を実施した。特に、123種のPUFA代謝物を解析し、組換えsPLA2-X処理後のEV脂質プロファイル変化を詳細に評価した。リン脂質の絶対定量は酵素蛍光法 (Tsuji et al. 2019) を用いて行った。
機能解析: 蛍光標識EV (ExoGlowプロテインEVラベリングキット) のフローサイトメトリーおよびタイムラプス共焦点顕微鏡によるTHP-1マクロファージへの取り込み解析を行った。GPCRシグナリングの評価には、TGFαシェディングアッセイ (Inoue et al. 2012) を用いた。sPLA2阻害剤varespladib (MedChemExpress) の投与実験をin vivoで実施し、EBV感染ヒト化マウスにおけるリンパ腫増殖への影響を評価した。varespladibは1 µg/g体重/日の用量で脾臓内注射した。
in vivo炎症モデル: C57BL/6J miceにLPSを投与し、sPLA2-X処理EVの免疫抑制効果を評価した。LPS誘発肺傷害モデルでは、気管内LPS投与後にsPLA2-X処理EVを静脈内注射し、好中球浸潤と肺傷害スコアを評価した。
臨床データ: ヒトDLBCL患者の腫瘍組織におけるsPLA2-X発現を免疫組織化学的に解析し、患者生存との相関を評価した。慢性活動性EBV感染 (CAEBV) およびEBV(+) DLBCL患者血清由来EVの脂質組成とsPLA2-Xによる加水分解感受性を健常者と比較した。統計解析にはEZRソフトウェア (Kanda 2013) を用いた。統計解析にはStudent’s t-test、log-rank testが用いられた。