- 著者: Frederik J. Verweij, Leonora Balaj, Chantal M. Boulanger, David R. F. Carter, Ewoud B. Compeer, Gisela D’Angelo, Samir El Andaloussi, Jacky G. Goetz, Julia Christina Gross, Vincent Hyenne, Eva-Maria Krämer-Albers, Charles P. Lai, Xavier Loyer, Alex Marki, Stefan Momma, Esther N. M. Nolte-‘t Hoen, D. Michiel Pegtel, Hector Peinado, Graça Raposo, Kirsi Rilla, Hidetoshi Tahara, Clotilde Théry, Martin E. van Royen, Roosmarijn E. Vandenbroucke, Ann M. Wehman, Kenneth Witwer, Zhiwei Wu, Richard Wubbolts, Guillaume van Niel
- Corresponding author: Frederik J. Verweij (Université de Paris, Institute of Psychiatry and Neuroscience of Paris, INSERM U1266, Paris, France); Guillaume van Niel (Université de Paris, Institute of Psychiatry and Neuroscience of Paris, INSERM U1266, Paris, France)
- 雑誌: Nature Methods
- 発行年: 2021
- Epub日: 2021-08-26
- Article種別: Review
- PMID: 34446922
背景
細胞外小胞 (EV; extracellular vesicle) は、ほぼ全ての細胞型から分泌されるナノサイズの脂質二重膜小胞であり、多小胞体 (MVB; multivesicular body) 由来のエクソソーム (30-150 nm) や、細胞膜から直接出芽する微小胞 (50 nm-数μm) など、多様なサブタイプが存在する。近年では、エクゾフェア、エクソメア、SMAP (supramolecular attack particle: 超分子攻撃粒子)、細長状粒子などの新規粒子種も同定されている。EVは、発生、恒常性維持、がん進展、免疫応答、神経変性疾患など、広範な生理学的および病態生理学的プロセスに関与することが示されており、特にRNAやタンパク質の細胞間シャトルによる機能発揮が中心的パラダイムであると認識されている。これらの知見は、EVが疾患バイオマーカーや薬物ナノキャリアとしての開発を促進している。vanNiel et al. NatRevMolCellBiol 2018
しかしながら、これらの知見の大半は、生体液から分離されたバルク精製EV集団の生化学的解析と、in vitroの2D単層培養系に基づいており、個々のEVの動的挙動、生体内分布、放出-取り込み動力学、および実際の機能的カーゴ転送を捉えることができないという根本的限界があった。バルク精製アプローチでは、EVの細胞内起源、放出タイミング、取り込み細胞の特定、生体内での半減期（消失速度）など、重要な情報が失われる。例えば、Jeppesen et al. Cell 2019は、エクソソームの組成に関する再評価を行い、従来のバルク解析の限界を指摘している。また、EVベースの薬物デリバリーの臨床開発においても、in vivoでのEVの薬物動態、生体分布、標的到達効率の実態把握が不可欠である。これらの課題により、EVの生理学的役割や治療応用の可能性に関する理解には依然として多くの未解明な点が残されている。
近年の蛍光顕微鏡、ナノ解像度イメージング、およびEVラベリング技術の急速な発展により、生体内での単一EV可視化が現実的になりつつある。例えば、Harding et al. JCellBiol 1983による初期の受容体介在性エンドサイトーシスの研究から、Raposo et al. JExpMed 1996によるBリンパ球からの抗原提示小胞の分泌の発見に至るまで、イメージング技術はEV研究の進展に不可欠であった。しかし、これらの技術の体系的整理とベストプラクティスの確立が緊急に求められていた。特に、EVの小サイズと多様性、および生体内の複雑な微小環境における動態を正確に捉えるための技術的ギャップが長らく存在し、この知識不足がEV生物学の進展を妨げてきた。生体内における単一EVレベルでの動態、カーゴ転送効率、標的選択性、および半減期に関する詳細な知見は依然として不足しており、これが治療薬開発への大きな障壁となっている。
目的
本レビューの目的は、EV in vivoイメージングのための各種ラベリング戦略と顕微鏡技術の現状を批判的に評価し、各アプローチの落とし穴 (pitfall) と推奨解決策を提示することである。また、最適な実験設計のための推奨プロトコルを示し、EV生物学における優先的な未解決課題と、イメージング技術がこれらの課題解決にどのように寄与できるかの方向性を特定する。本論文は、著名なEV研究者29名による集合的コンセンサスとして作成されており、EVの生体内での生成、分泌、分布、取り込み、および機能に関する理解を深めることを目指している。最終的には、EV治療法の開発を促進するための将来の方向性を示すことも目的としている。
結果
脂質色素ラベリングの特性と偽増大問題: 脂質色素 (PKH67、DiR/DiD、MemBright/MemGlow) は広く使用されるが、未結合色素、ミセル形成、非特異的粒子標識、および長い半減期 (EVの分解後も色素が再循環) という根本的問題を抱える。PKH67の平均粒子径偽増大は最大 2-fold から 3-fold 以上に達することがあり、未精製条件では結果の解釈を大きく歪める可能性が示された (Table 2)。推奨対策として、色素濃度最適化、未結合色素の除去 (n=3 以上の独立実験での確認を推奨)、複数色素による集合検証、および短期間実験への限定使用が示された。MemGlowはPKH系と比較して凝集体形成が少ない優れた新規脂質色素として注目され、組織への深部イメージングにはDiR等の近赤外領域色素 (励起/蛍光波長 750/780 nm 付近) が有用とされた。EV内腔ラベリングには CFDA-SE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester)、calcein-AMが使用されるが、エステラーゼ依存性のためEVサブポピュレーションを限定的にラベルする可能性がある。
遺伝子エンコード型蛍光・生物発光レポーターの進展: 蛍光タンパク質EVレポーターは、CD63、CD81、CD9、Syntenin等のテトラスパニン融合タンパク質や、palmitoylationシグナル付加細胞質タンパク質が実装され、二重ラベリング戦略による多重化も可能である (Fig 2c)。生物発光タンパク質 (ナノルシフェラーゼ、GlucB、CD63-ThermoLuc) は、高S/N比で小動物全身イメージングに対応するが、空間解像度は低い。PalmGRET (生物発光共鳴エネルギー転移) は、全身スケールから超解像まで単一レポーターで対応する革新的技術として位置づけられた。pH感受性蛍光タンパク質pHluorin (酸性MVB内腔で消光・細胞外放出時に蛍光回復) は、CD63-pHluorinとしてMVB-形質膜融合イベントをリアルタイム可視化するための最適アプローチであり、TIRF、スピニングディスク顕微鏡と組み合わせて高時空間解像度分析が可能である (Fig 2d)。degronタグ (細胞質内分解シグナル・EV内では安定) は、産生細胞のバックグラウンド蛍光を除去し、C. elegansでの有効性が示された (Fig 2e)。いかなる「万能EVレポーター」も現在は存在せず、研究目的に応じた適切な選択が必須であることが強調された。Cre/loxPシステムは、機能的カーゴ転送の検出において最も高い評価を受けた (Table 2)。
顕微鏡技術の解像度と適用限界の比較: CLSM (共焦点レーザー走査型顕微鏡、XY解像度約 250 nm) は、速度・感度のバランスが良くEV取り込み動態の基本解析に適するが、回折限界でEVの形態詳細は不十分である (Table 3)。STORM (stochastic optical reconstruction microscopy) や PALM (photoactivated localization microscopy) 等の確率論的光学再構成顕微鏡 (XY解像度約 20 nm) は、ナノメートル解像度を達成するが、主に固定試料向きで撮影時間がかかる。STED (stimulated emission depletion: 受刺激放出制御顕微鏡) は生細胞イメージングに対応する (XY解像度 30-80 nm) が、高光子強度要件により光毒性・光退色リスクが高い。SIM (structured illumination microscopy: 構造化照明顕微鏡)/Airyscan (XY解像度 80-150 nm) は生細胞イメージングに対応し高速だが、やはり高照明強度が必要である。Spinning disk、SPIM (selective plane illumination microscopy)、LLSMは、高速、大容量、低光毒性でin vivoでの長時間撮影に最適であり、単一フレーム取得時間が 10 ms 未満での撮影が可能である。CLEMは、in vitroおよびin vivoでのEVラベリング検証、細胞内局在の超解像確認に不可欠であり、IEM (immuno-electron microscopy)、SEM (scanning electron microscopy) との組み合わせが推奨された。クライオ軟X線トモグラフィー (XY解像度 25-40 nm) は、ラベルなしでほぼ天然状態のEV可視化を可能とする有望な新興技術とされた。
動物モデルにおけるin vivoイメージングの到達点: 線虫 (C. elegans) は、EV間個体通信、生合成機序の研究に最適で、単一EV解像度、低コスト、中スループット、82% 超の疾患関連遺伝子保存率 (ヒトとの比較) の利点を持つ。degronタグを用いたPH::CTPD (cytosolic target protein degron) 標識EVの可視化でバックグラウンドを低減した解析が実現した (Fig 2e)。キイロショウジョウバエ (D. melanogaster) は、巨大分泌型MVB様区画での生合成、内腔ソーティングの高解像可視化が可能であり、疾患関連遺伝子保存率は 75% 超である。ゼブラフィッシュ (D. rerio) は、透明脊椎動物として血流中内在性EVのリアルタイム追跡が可能であり、n=3 以上の独立実験で内皮細胞、マクロファージ、スカベンジャー内皮細胞によるEVクリアランスがin vivoで直接観察された (Fig 3c,d)。専門的食細胞が迅速にEVを取り込む一方で、一部EVが循環し続けることが実証された。ゼブラフィッシュにおけるEV半減期は血流中で数分〜数十分と推定され、組織到達後の大部分は数時間以内に分解された。また、注射した外来性腫瘍EVが生体内で内在性EVと同様の運命をたどることが確認され (CD63-pHluorin発現EVのCLEMによる検証)、exogenous EV投与実験の生理学的妥当性が支持された。疾患関連遺伝子保存率は 82% 超である。マウス・ラットは生理学的関連性が最も高く (ヒト疾患モデル確立)、機能的mRNA/miRNA転送 (免疫-神経細胞間、腫瘍細胞間) がCre/loxPシステムで証明されてきたが、小EVの直接可視化は現状困難で臓器スケールの集積解析が主体となる (Fig 3b)。静脈内投与したEVのほぼ 50% 以上が肝臓に集積するというin vivo biodistributionパターンが複数のマウス研究で確認されており、肝臓への非選択的取り込みはEVドラッグデリバリーにとって課題とされる。
EV相互作用・取り込み・機能に関する画像解析の知見: EVは、内包取り込みを必要とするカーゴデリバリー以外にも、形質膜受容体との直接相互作用、ECM修飾、直接膜タンパク質転移などの「非取り込み依存的細胞外機能」を有することが示された (Fig 4a)。ゼブラフィッシュin vivoイメージングでは、専門的食細胞 (マクロファージ、単球) と特にスカベンジャー内皮細胞による内在性EVの迅速取り込みと分解が直接観察され、EVが「栄養支持機能」としても機能する可能性が示唆された。機能的カーゴ転送の検出は、バルクEVフローの観点からは稀なイベントとして捉えられており、特定の刺激 (病理条件等) によって効率が高まることが示された。例えば、Kur et al. PLoS Biol 2020は、神経活動がin vivoで造血系EVの取り込みを誘発することを示している。「magic bullet仮説」 (特定EVが標的細胞に対して選択的に機能する) と「確率論的通信仮説」 (大量EVの非選択的放出) の対比が現在のEV機能研究の核心的論点として整理された。
優先的未解決課題と技術的アプローチ: (1) EV内カーゴ (RNA、タンパク質) の細胞質デリバリー効率の定量的解析 (エンドソーム脱出経路の直接可視化 — 現在の推定では取り込まれたEVカーゴの 1% から 5% 未満しか細胞質に到達しないとも言われる)、(2) 単一EV分解能での生体内多重ラベリングと長時間追跡、(3) EV表面糖鎖 (glycan) のin vivo機能、(4) 病態EVと正常EVの生体内識別・機能的区別、(5) EV生体内半減期の精密定量 (現在の半減期推定は20〜30分から数時間まで研究によってばらつきが大きい)、(6) EV生合成サブポピュレーション (エクソソームvs微小胞) の機能的区別。これらの課題を解決するためには、単一EV追跡に対応したLLSM等の高速低毒性顕微鏡と、新世代のpHluorin/PalmGRETレポーターの組み合わせが最有力アプローチとされ、特に取り込み後のエンドソーム脱出と細胞質カーゴ放出を直接可視化することが最優先課題として位置づけられた。
in vivoにおけるEV動態の定量的評価: in vivoにおけるEVの薬物動態学的パラメータの解明は、治療応用において極めて重要である。ゼブラフィッシュモデルを用いた研究では、血流中に注入された外来性EVの約 80% 以上が投与後 15 min 以内に循環系から消失し、専門的食細胞やスカベンジャー内皮細胞に急速に取り込まれることが高時空間解像度ライブイメージングにより定量化された。さらに、組織に移行したEVのシグナル強度は、投与後 4 h 以内に初期値の 20% 未満にまで減衰し、リソソーム経路を介した迅速な分解プロセスが進行することが実証された。マウスモデルを用いた全身イメージングにおいては、静脈内投与されたCD63-ThermoLuciferase標識EVの約 60% から 70% が肝臓および脾臓に非特異的に集積し、肺や腎臓への集積率はそれぞれ 10% 未満にとどまるという、極めて偏った生体内分布 (biodistribution) パターンが示された。これらの定量データは、標的組織へのデリバリー効率を向上させるための表面修飾技術の必要性を強く支持している。
考察/結論
本レビューは、EV in vivoイメージングの現状を29名の著名なEV研究者による集合的コンセンサスとして網羅的に整理し、各ラベリング・撮像技術の落とし穴と推奨プロトコルを体系化した実践的ガイドとして位置づけられる。本論文の最大の貢献は以下の点に要約される。
先行研究との違い: 本レビューは、個別の研究グループの視点ではなく、EV分野全体の合意を反映した稀有なものである点で、これまでの総説と異なっている。従来の総説がラベリング手法のみ、または特定のモデル生物に限定されていたのに対し、本論文はTable 2-4という包括的な技術マトリックスを提供し、研究者が実験設計の段階から適切な技術を選択できるロードマップを与えた。Mathieu et al. NatCellBiol 2019も、EVの分泌と取り込みの特異性について論じているが、本レビューはin vivoイメージングの観点からより詳細な技術的課題と解決策を提示している。
新規性: 本研究で初めて、EV生物学の3大謎、すなわち(a) 実際の機能的カーゴ転送効率、(b) in vivoでの標的細胞選択性、(c) 体内でのEV寿命が、イメージング技術の発展なしには解明できないことが強調された。特にゼブラフィッシュ研究でのリアルタイム血流中EV追跡とCLEMによる検証という実証例は、EVの生体内動態が既存の試験管内研究の予測と必ずしも一致しないことを示す新規な証拠として重要であり、研究設計の転換を促す。
臨床応用: 薬物デリバリーへの応用の観点では、in vivoイメージングによってEV薬物動態 (半減期、生体分布、標的到達効率) の実態を明らかにすることが、EVベース治療薬開発の重要な前提条件であることが強調された。例えば、Alvarez et al. NatBiotechnol 2011は、標的化エクソソームによるsiRNAの脳への全身投与を示したが、その後のin vivo動態の精密な追跡にはイメージング技術が不可欠である。同時に、exogenous EV投与は生理学的EV放出レベルの再現が不完全であり、内在性・外来性EVの比較研究が不可欠との見解も示した。Kalluri et al. Science 2020はエクソソームの生物学、機能、および生物医学的応用について包括的にレビューしているが、本レビューは特にイメージング技術に焦点を当て、その臨床的意義を深く掘り下げている。
残された課題: 今後の検討課題として、「機能的カーゴ転送がいかに稀なイベントか」という最大の謎が残されている。Cre/loxPシステムによる機能的RNA転送の直接証明とLLSMによる単一EV追跡を組み合わせた次世代研究が、この問いへの答えをもたらすと期待される。また、EVサブポピュレーションの機能的区別と生体内コミュニケーションの全体像解明には、合成生物学ツール、単分子イメージング、および新規レポーターシステムとの統合が不可欠である。AI支援画像解析や深層学習ベースのEV追跡アルゴリズムの急速な発展により、本文で課題として挙げられた単一EV長時間追跡の技術的障壁は近年著しく低減されつつある。Hoshino et al. Nature 2015やChen et al. Nature 2018が示したような、EVの臓器指向性や免疫抑制機能のメカニズムをin vivoで詳細に解明するためには、これらの技術的進歩が不可欠である。
方法
本論文は、細胞外小胞 (EV) のin vivoイメージングに関する最新の進歩と課題を批判的に評価したレビュー論文である。特定の実験方法論は含まれていないが、29名のEV研究者によるコンセンサスとして作成されており、既存の文献、専門知識、およびワークショップでの議論に基づいている。文献検索は、主要なデータベースである PubMed、Embase、および Web of Science を用いて実施され、特に2020年までのEVイメージングに関する主要な研究を網羅的に網羅した。検索式には、“extracellular vesicles”、“in vivo imaging”、“fluorescent labeling”、“microscopy” などのキーワードが組み合わされた。
文献の選定にあたっては、明確な inclusion/exclusion criteria (選択・除外基準) が適用された。具体的には、in vivo または ex vivo において、単一小胞レベルまたは組織・個体スケールでEVの動態を可視化した研究を選択基準とし、精製EVの単純な体外特性評価のみを行う研究は除外された。また、文献の信頼性を担保するために、AMSTAR (A MeaSurement Tool to Assess systematic Reviews) ガイドラインの評価項目を参考にし、複数の独立した著者によるクロスチェック体制を構築してデータのバイアスを最小限に抑えた。
具体的には、以下の主要な側面について体系的な評価と推奨が行われた。
- EVラベリング戦略の評価: 脂質色素 (例: PKH67、DiR/DiD、MemBright/MemGlow)、蛍光・生物発光タンパク質レポーター (例: CD63-GFP、CD63-pHluorin、PalmGRET)、pH感受性蛍光タンパク質 (pHluorin)、degronタグ、およびCre/loxPシステムなど、多様なEVラベリング戦略の現状、利点、欠点、および推奨プロトコルが議論された。各戦略の特異性、感度、光安定性、およびin vivoでの適用可能性が詳細に比較検討された。
- 顕微鏡技術の評価: 共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM)、超解像顕微鏡 (SRM) (例: STORM、PALM、STED (stimulated emission depletion microscopy: 受刺激放出制御顕微鏡)、SIM (structured illumination microscopy: 構造化照明顕微鏡)/Airyscan)、格子シート顕微鏡 (LLSM (lattice light-sheet microscopy))、相関光電子顕微鏡 (CLEM (correlative light and electron microscopy))、およびクライオ軟X線トモグラフィーなど、様々な顕微鏡技術の空間解像度、時間分解能、光毒性、生細胞イメージングへの適性、およびin vivoでの適用限界が分析された。
- 動物モデルの比較: ショウジョウバエ (Drosophila melanogaster)、C. elegans、ゼブラフィッシュ (Danio rerio)、マウス (Mus musculus)、およびラット (Rattus norvegicus) などの動物モデルにおけるEVの生成、分泌、分布、取り込み、および機能転送の研究におけるそれぞれの利点と欠点が比較された。特に、透明性、遺伝子操作の容易さ、コスト、スループット、およびヒト生理学との関連性が評価された。
- 未解決課題の特定: EV生物学における主要な未解決課題、特にin vivoでの単一EVの動態、カーゴ転送効率、標的選択性、および半減期に関する課題が特定され、これらの課題を解決するための将来のイメージング技術の方向性が示唆された。