- 著者: Shuang Wang, Feng Li, Tong Ye, Jianghua Wang, Chengliang Lyu, Shuang Qing, Zhaowen Ding, Xiaoyong Gao, Rongrong Jia, Di Yu, Jun Ren, Wei Wei, Guanghui Ma
- Corresponding author: Guanghui Ma (ghma@ipe.ac.cn) (State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China); Wei Wei (weiwei@ipe.ac.cn) (State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China)
- 雑誌: Science Translational Medicine
- 発行年: 2021
- Epub日: 2021-10-13
- Article種別: Original Article
- PMID: 34644149
背景
固形腫瘍に対するがん免疫療法は、腫瘍特異的エフェクターT細胞を大量に産生するものの、腫瘍微小環境 (TME) の強力な免疫抑制により、その浸潤効率、生存、および機能が低下するため、臨床効果が限定的であるという課題に直面している。TMEにおける免疫抑制は、腫瘍関連マクロファージ (TAM) や制御性T細胞 (Treg)が産生するインターロイキン-10 (IL-10) や形質転換成長因子-β (TGF-β) などの免疫抑制性サイトカインによって引き起こされることが知られている Gordon et al. Nature 2017。このため、T細胞の腫瘍内浸潤能力、生存率、および細胞傷害性機能が著しく阻害される。
近年、ナノサイズの分泌小胞であるエクソソームが治療薬として注目されている。特に、M1マクロファージ由来のエクソソームは、リンパ節 (LN) における免疫活性化を誘導し、免疫抑制的なM2マクロファージをM1マクロファージに再分極させる能力を持つことが報告されている。また、がん細胞やがん細胞成分を含むナノ治療薬が腫瘍ホーミング能を示すことも明らかになっている。しかし、これらの特性を統合し、T細胞産生増強とTME免疫抑制解除を同時に達成できる単一のナノ治療剤はこれまで存在せず、この点が大きな知識ギャップとして残されていた。
従来の免疫療法は、T細胞の活性化に焦点を当ててきたが、TMEの免疫抑制を十分に克服できないため、その効果は限定的であった。例えば、養子細胞移入療法やがんワクチンは、強力なT細胞応答を誘導するものの、腫瘍内でのT細胞の機能不全や排除が問題となる。このような背景から、がん特異的T細胞の産生を増加させると同時に、免疫抑制的なTMEを効果的に調節できる新しい戦略が強く求められていた。特に、複数の腫瘍抗原を効率的に提示し、かつTMEを改善するアプローチは未解明な部分が多く、この領域の開拓が重要である。本研究は、この未開拓な領域に対し、マクロファージと腫瘍細胞の特性を融合させたキメラエクソソームという新規アプローチで挑むものである。
目的
本研究の目的は、活性化M1マクロファージに腫瘍細胞核を取り込ませて作製したキメラエクソソーム (aMT-exos: activated macrophage-tumor chimeric exosomes) の多面的な抗腫瘍効果を前臨床モデルで実証することである。具体的には、以下の5つの主要な目的を掲げた。
- リンパ節への蓄積とT細胞活性化経路の解明: aMT-exosがリンパ節に効率的に蓄積し、抗原提示細胞 (APC) 活性化経路と直接的なT細胞刺激経路の両方を介してT細胞を活性化するメカニズムを明らかにすること。
- 腫瘍内TME改善効果の評価: aMT-exosが腫瘍微小環境 (TME) 内の免疫抑制を改善し、M1マクロファージの割合増加、CD8+ T細胞浸潤の促進、および制御性T細胞 (Treg)の減少を誘導することを示すこと。
- 原発腫瘍、転移、術後再発に対する抗腫瘍効果の検証: マウスモデルにおいて、aMT-exosが原発腫瘍の退縮、遠隔転移の抑制、および術後再発の防止に有効であることを実証すること。
- 抗PD-1抗体との相乗効果の評価: aMT-exosと抗PD-1抗体との併用療法が、単独療法と比較してより強力な抗腫瘍効果、特に転移および術後再発モデルにおいて相乗効果を示すことを確認すること。
- ヒト応用可能性の検証: ヒト由来の細胞を用いたin vitroモデルにおいて、aMT-exosの作製可能性と免疫調節効果を評価し、個別化免疫療法剤としての将来的な臨床応用への道筋を示すこと。
これらの目的を達成することで、aMT-exosが空間的・時間的に免疫応答を調節し、固形腫瘍に対する新たな個別化免疫療法戦略となる可能性を提示する。
結果
aMT-exosの合成と特性評価：腫瘍抗原とM1マクロファージ機能の統合: マクロファージへの腫瘍核取り込み効率は、核:マクロファージ=2:1の比率でマクロファージの生存率が95%に維持され、取り込み率が90%に達した (Fig. 1A)。作製されたaMT-exosは、TEMおよびNTAにより30～150 nmの典型的なエクソソーム形態を示し (Fig. 1E)、エクソソームマーカーであるTSG101、ALIX、CD9に加え、免疫活性化マーカーであるCD86、MHC I、MHC II、および腫瘍関連抗原であるEpCAM、TRP1 (tyrosinase-related protein 1) を発現していることがウェスタンブロットで確認された (Fig. 1F)。特に、OVA-MHC I複合体の発現は、aMT-exosでMT-exos (inactivated macrophage-tumor hybrid cell exosomes) よりも高かった (Fig. 1G)。エンドトキシン含量は0.19 EU/ml未満であり、医薬品基準 (0.25 EU/ml以下) を満たしていた。タンパク質1μgあたり約1.23×10⁸粒子という一貫した粒子/タンパク質比が確認された。ルミネックス多項目サイトカイン解析では、aMT-exosにおいてGRO-α、MCP-1、MIP-1α、MIP-2、RANTESなどのケモカインおよびIFN-γ、IL-1、IL-12、IL-6、TNF-αなどの免疫活性サイトカインがMT-exosと比較して有意に増加していることが示された (p<0.01) (Fig. 1H)。これらの結果は、aMT-exosが腫瘍抗原とM1マクロファージの免疫活性化特性を統合していることを強く示唆する。
生体内デュアル蓄積：リンパ節と腫瘍への同時局在: DiR標識aMT-exosをE.G7腫瘍担癌マウス (n=3 mice) に皮下投与した結果、48時間後に鼠径リンパ節と腫瘍の両方に最大の蛍光シグナル蓄積が確認された (Fig. 2A, B)。LNに蓄積した細胞をフローサイトメトリーで解析すると、F4/80+CD11c+マクロファージ/DC、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞にDiR+細胞が検出され、複数種の免疫細胞がaMT-exosを取り込んでいることが示された (Fig. 3B)。腫瘍への蓄積は、腫瘍核由来の「ホーミング」能によるものと解釈された。ナノサイズの特性がLNへの受動的ターゲティングに寄与し、腫瘍成分が腫瘍へのホーミング活性に寄与することが示された。例えば、aMT-exosはaM-exosと比較して腫瘍への濃縮が有意に高かった (p<0.001) (Fig. 2G)。また、異種B16核由来のaMT(B16)-exosやbEnd.3核由来のaMB-exosでは、E.G7腫瘍組織への蓄積がaMT-exosと比較して有意に低かった (p<0.01) (Fig. 2G, H)。これは、特異的な腫瘍能動的ターゲティング能力と、同種aMT-exosとの間に正の相関があることを裏付けている。
リンパ節免疫活性化：APC活性化経路と直接T細胞刺激経路の二重機構: aMT-exos処理されたLNは、PBS処理LNと比較してサイズが約4倍大きく (p<0.0001)、APC、マクロファージ、DCの数が約3倍増加していた (p<0.001) (Fig. 3A)。これらのAPCは傍皮質T細胞ゾーンに深く浸潤しており、T細胞活性化の可能性を示唆した。aMT-exosはマクロファージ/DCのCD40、CD80、CD86、MHC I、MHC II発現を著明に上昇させ、OT-I (CD8+) およびOT-II (CD4+) TCRトランスジェニックマウス由来のT細胞の抗原特異的増殖を誘導した (p<0.0001) (Fig. 3E, F)。これはAPC活性化経路を介した免疫刺激を示す。さらに、aMT-exosはAPC非存在下でもT細胞と直接接触し、T細胞増殖を誘導する「nano-APC」としての機能も有することが示された (Fig. 3G, H)。DC欠損マウス (Itgax-DTRマウスにジフテリア毒素投与) においても一部のLN T細胞増殖が維持され、nano-APCとしての直接機能が確認された (Fig. S10D-F)。ヒトPBMC由来のh-aMT-exosも、ヒトT細胞の増殖とMDA-MB-231細胞に対する腫瘍溶解活性を誘導した (p<0.0001) (Fig. 3K, S10I)。
腫瘍内TME改善：M1/M2比上昇・CD8+ T細胞浸潤増加・Treg減少: E.G7腫瘍内投与後の解析では、aMT-exos処理群においてM1様マクロファージ (F4/80+Ly-6C+)/M2様マクロファージ (F4/80+CD206+) 比が有意に上昇した (p<0.0001 vs M-exos) (Fig. 4B)。また、CD3+CD8+IFN-γ+およびCD3+CD8+Granzyme B+細胞傷害性T細胞の割合が増加し、CD8/Treg比およびCD4/Treg比も上昇した (p<0.05) (Fig. 4C, D)。RNAシーケンスによるKEGG転写解析では、JAK-STAT、TH17、MAPK、PI3K、VEGF経路などの免疫関連遺伝子の発現変化が認められた (Fig. 4E)。ヒト3D多細胞スフェロイドモデル (n=4 replicates) でも、h-aMT-exosがM2→M1分極 (CD163-CD86+ M1↑、CD163+CD206+ M2↓) とCD8+ T細胞浸潤増加を誘導し、腫瘍スフェロイドの増殖を有意に抑制した (p<0.0001) (Fig. 4H-J)。
原発腫瘍の治療効果：E.G7・4T1・B16の三モデルで有効: E.G7皮下腫瘍モデル (n=6 mice) では、aMT-exos投与群の4/6匹が実験終了前に完全腫瘍消滅を達成し、day 100生存率は66%であった。一方、PBS、M-exos、MT-exos、aM-exos、ワクチン (AS04)、ACT T細胞群はいずれも全例死亡した (Fig. 5B, C)。抗原非特異的aMT(B16)-exosでは有意に効果が低下し (p<0.001)、腫瘍特異的核使用の重要性が確認された。4T1担癌マウス (n=7 mice) およびB16担癌マウス (n=8 mice) でも、それぞれ4T1-aMT-exosおよびB16-aMT-exosにより有意な腫瘍増殖抑制効果が認められた (p<0.01 vs PBS) (Fig. 5D, E)。
転移モデルでの抗転移効果：抗PD-1との併用で最大効果: Luc-4T1 (ルシフェラーゼ発現4T1細胞) 肺転移モデルでは、aMT-exos単剤で有意な肺転移抑制効果が認められた。aMT-exosと抗PD-1抗体の併用療法では、PBS群の1/23 (p<0.0001)、aMT-exos単剤群の1/7 (p<0.0001) の転移foci数に減少し、CD8/Treg比とM1/M2比が組み合わせ群で最大に上昇した (Fig. 6E)。B16肺転移モデル (n=6 mice) でも同様に、組み合わせ療法によりCD8+ T細胞浸潤増加、M1/M2比上昇、転移foci数の有意な減少が認められた (p<0.0001) (Fig. 6G, H)。
術後再発予防：個別化aMT-exosと抗PD-1の組み合わせが最有効: Luc-4T1不完全切除モデル (n=6 mice) では、切除腫瘍核から作製した個別化aMT(4T1)-exosの皮下投与 (day 4, 7) により、day 14の再発率が66.7% (PBS群100%と比較) に低下し、生存率が有意に向上した (p<0.05) (Fig. 7D)。aMT-exosと抗PD-1抗体の併用療法では、再発率が16.7%にまで低下し (p<0.01)、6匹中4匹が100日以上生存した。術後の肺および骨転移も組み合わせ療法により消滅した。非個別化 (B16核使用) aMT-exosでは有意に効果が低下した (p<0.05)。B16不完全切除モデル (n=9 mice) でも、個別化B16-aMT-exosと抗PD-1の併用により、day 20の再発率が33.3% (PBS群100%と比較) に低下し、55.6%が100日以上生存した (p<0.01) (Fig. 7E)。
考察/結論
本研究は、M1マクロファージと腫瘍核を融合させたキメラエクソソーム (aMT-exos) が、リンパ節 (LN) における免疫活性化と腫瘍微小環境 (TME) における免疫抑制解除という、空間的・時間的な免疫調節を単一のナノ治療剤で実現する新規戦略を提示した。
先行研究との違い: これまでの免疫療法がT細胞活性化かTME調節のいずれか一方に焦点を当てていたのに対し、本研究は両者を同時に達成するアプローチを開発した点で対照的である。特に、aMT-exosがLNでAPC活性化と直接T細胞刺激という2つの補完的機序を介してT細胞を活性化する点は、これまでのエクソソーム研究では十分に報告されていなかった新規の知見である。また、腫瘍のホーミング能を利用してTME内のM1/M2比およびCD8/Treg比を改善する能力も、本研究の独自性である。
新規性: 本研究で初めて、マクロファージの貪食能を利用して腫瘍細胞核を取り込ませることで、複数の腫瘍抗原を提示するキメラエクソソームを効率的に作製する手法を確立した。この核ベースのハイブリダイゼーション戦略は、単一抗原に限定されがちな従来の遺伝子導入法と比較して、多様な腫瘍抗原に対するT細胞応答を誘導できる点で新規性が高い。これにより、腫瘍の免疫回避メカニズムを克服する上で有利であると考えられる。
臨床応用: 本知見は、患者由来の腫瘍組織から迅速かつ個別化された免疫療法剤を製造する可能性を示唆しており、臨床応用への大きな含意を持つ。特に、術後再発予防モデルにおいて、切除された腫瘍組織から作製された個別化aMT-exosが抗PD-1抗体との併用で優れた効果を示したことは、個別化エクソソーム療法が将来の臨床現場で重要な役割を果たす可能性を強く示唆する。エクソソームの安定性 (凍結保存可能、in vivoでの再分極抵抗性) は、CAR-T細胞などの細胞療法に対する優位点であり、実用化に向けた大きな利点となる。
残された課題: 今後の検討課題として、まずGMP準拠の製造プロセスの確立と、エクソソームの品質管理 (純度、均一性、長期保存) の最適化が挙げられる。また、最適な投与経路、スケジュール、および用量の決定も重要である。本研究では免疫不全マウスを用いた患者由来腫瘍異種移植モデルでの検証がLN欠損のため困難であったため、ヒト適用可能性はin vitro実験での支持に留まる点がlimitationである。将来的には、ヒト化マウスモデルや、より大規模な前臨床試験を通じて、aMT-exosの安全性と有効性をさらに検証する必要がある。さらに、腫瘍ホーミング能や腫瘍特異的変異抗原に関与する腫瘍細胞核の特定の成分を同定できれば、生検や切除組織なしでエクソソームを製造する可能性も開かれる。
方法
aMT-exos作製と特性評価: リポ多糖 (LPS) で活性化したマウス腹腔由来M1マクロファージに、E.G7 (OVA発現リンパ腫)、4T1 (乳癌)、B16 (黒色腫)、MDA-MB-231 (ヒト乳癌) 腫瘍細胞の核を核:マクロファージ=2:1の比率で取り込ませ、12時間培養してキメラ細胞を作製した。その後、細胞培養上清を段階的遠心分離および超遠心分離 (125,000gで2回) することでaMT-exosを採取した。作製されたaMT-exosは、透過型電子顕微鏡 (TEM)、ナノ粒子トラッキング解析 (NTA)、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、ルミネックス多項目サイトカイン解析、プロテオミクス解析、およびmiRNAシーケンスを用いて、その形態、サイズ、表面マーカー (TSG101, ALIX, CD9, CD86, MHC I, MHC II, EpCAM, TRP1)、サイトカイン組成、およびエンドトキシン含量 (<0.19 EU/ml) を詳細に特性評価した。
生体内分布評価: DiRまたはDiD蛍光色素で標識したaMT-exosをE.G7腫瘍担癌マウス (n=3) の背部に皮下投与し、48時間後の生体外蛍光イメージングおよびフローサイトメトリーにより、リンパ節 (LN) および腫瘍組織への蓄積を評価した。また、様々なサイズの細胞小胞 (ナノRBC、aMT微小胞、aMエクソソーム、Tエクソソームなど) と比較し、サイズおよび腫瘍成分が蓄積に与える影響を解析した。
LN免疫活性化メカニズム解析: aMT-exosがLN内で免疫応答を誘導するメカニズムを解明するため、オパール多重組織染色法を用いてLNの組織学的解析を行った。また、OT-I/OT-II TCRトランスジェニックマウス由来の脾臓細胞を用いたT細胞増殖アッセイを実施し、抗原特異的T細胞活性化を評価した。さらに、樹状細胞 (DC) 除去マウス (Itgax-DTRマウスにジフテリア毒素投与) およびマクロファージ除去マウス (Clophosome-A投与) を用いた実験により、APC活性化経路と直接的なT細胞刺激経路 (nano-APC経路) の寄与を検証した。
腫瘍内TME改善効果解析: E.G7腫瘍担癌マウス (n=4) にaMT-exosを腫瘍内投与 (day 7, 9, 11) し、day 14に腫瘍組織を採取してフローサイトメトリーによりM1/M2マクロファージ比、CD8+ T細胞浸潤、およびTregの割合を解析した。RNAシーケンスによるKEGG転写解析も行い、免疫関連遺伝子発現の変化を評価した。ヒト3D多細胞スフェロイドモデル (HLA-A2+ドナーPBMC由来マクロファージとMDA-MB-231腫瘍細胞) でも同様のTME調節効果を検証した。
抗腫瘍効果試験: E.G7 (n=6)、4T1 (n=7)、B16 (n=8) の皮下腫瘍モデル、Luc-4T1およびB16の肺転移モデル (n=各6-8)、ならびに4T1およびB16の不完全切除術後再発モデル (n=6-9) を用いて、aMT-exos単独療法および抗PD-1抗体との併用療法の抗腫瘍効果を評価した。腫瘍体積測定、生存曲線解析、生体発光イメージング、および転移巣数カウントにより効果を判定した。
ヒト応用検証: HLA-A2+ドナーPBMC由来マクロファージとMDA-MB-231腫瘍核から作製したヒトaMT-exos (h-aMT-exos) を用いて、HLA-A2+ドナーT細胞の増殖および3D多細胞スフェロイドにおけるTME調節効果をin vitroで評価した。
統計解析: 統計解析にはGraphPad Prism 9.0.0およびOrigin 9.0を用いた。2群間の比較には両側Studentのt検定、3群以上の比較には一元配置分散分析 (ANOVA)、生存期間の比較には両側ログランクMantel-Cox検定を用いた。p<0.05を有意差ありと判定した。