- 著者: Marian L. Burr, Christina E. Sparbier, Yih-Chih Chan, James C. Williamson, Katherine Woods, Paul A. Beavis, Enid Y. N. Lam, Melissa A. Henderson, Charles C. Bell, Sabine Stolzenburg, Omer Gilan, Stuart Bloor, Tahereh Noori, David W. Morgens, Michael C. Bassik, Paul J. Neeson, Andreas Behren, Phillip K. Darcy, Sarah-Jane Dawson, Ilia Voskoboinik, Joseph A. Trapani, Jonathan Cebon, Paul J. Lehner, Mark A. Dawson
- Corresponding author: Paul J. Lehner (pjl30@cam.ac.uk, Cambridge Institute for Medical Research, Cambridge Biomedical Campus, Cambridge CB2 0XY, UK) and Mark A. Dawson (mark.dawson@petermac.org, Peter MacCallum Cancer Centre, Melbourne, Victoria 3000, Australia)
- 雑誌: Nature
- 発行年: 2017
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- PMID: 28813417
背景
がん細胞は programmed cell death 1 ligand 1 (PD-L1、CD274) を利用して PD-1/PD-L1 経路を活性化し、腫瘍特異的 T 細胞の免疫応答を抑制する (immune escape の主要機構)。PD-L1 発現は interferon gamma (IFN-γ) などの炎症性サイトカインによる転写誘導 (JAK-STAT 経路、JAK1/JAK2/STAT1 を介した IRF1 結合) や、がん細胞内因性の遺伝子増幅 (CD274 amplification)・3’UTR 構造変異 (Kataoka et al. Nature 2016 が示した DLBCL/胃がんでの 3’ truncation) によっても制御されることが知られていた。先行研究 (Topalian et al. NEnglJMed 2012 = PMID 22658127、Le et al. NEnglJMed 2015 = PMID 26028255、Brahmer et al. NEnglJMed 2012 = NEnglJMed 2012、Garon et al. NEnglJMed 2015 = NEnglJMed 2015) は anti-PD-1 (nivolumab/pembrolizumab) と anti-PD-L1 (atezolizumab) の臨床効果を確立してきたが、PD-L1 の翻訳後・タンパク質安定性レベルでの調節機構—特に細胞表面発現の維持に関わる分子—は** 不明であった。具体的には、(1) PD-L1 の cell surface protein half-life を制御する master regulator は同定されていなかった、(2) PD-L1 が他の cell surface protein (MHC class I など) と独立して制御可能かは未検証であった、(3) MHC class I を保護せずに PD-L1 のみを選択的に低下させる治療戦略の機械論的基盤が足りなかった**。PD-L1 発現を直接制御する新規標的の同定は、既存の anti-PD-L1 抗体療法を補完する治療戦略 (small molecule inhibitor、PROTAC など) につながる可能性があった。
目的
ゲノムワイド CRISPR-Cas9 削除スクリーニングにより、(1) 構成的 PD-L1 発現と IFN-γ 誘導 PD-L1 発現の双方を制御する新規調節因子を網羅的に同定する、(2) 同定された遺伝子について複数の cancer cell line (BxPC-3 膵臓・MDA-MB-231 乳がん・melanoma・lung cancer) で機能検証 (sgRNA/shRNA 枯渇 + cDNA rescue) する、(3) 細胞内分子機構 — 物理的相互作用 (immunoprecipitation)・細胞内局在 (confocal microscopy)・タンパク質安定性 (pulse-chase)・ubiquitination・degradation pathway (proteasomal vs lysosomal) を解析する、(4) 定量的細胞表面プロテオーム解析 (plasma membrane profiling) で基質特異性を MHC class I・他の表面 protein と比較する、(5) in vitro 腫瘍特異的 T 細胞抑制能・in vivo マウス腫瘍モデルでの抗腫瘍免疫調節への寄与を機能的に評価する、ことを目的とした。
結果
所見1 — CRISPR-Cas9 ゲノムワイドスクリーニングで CMTM6 を PD-L1 主要調節因子として同定 (IFN-γ 非処理下では唯一の hit): IFN-γ 処理条件でのスクリーニングで IFN-γ 経路 (JAK1・JAK2・STAT1・IFNGR2) と CMTM6 が主要 hit として同定された (Fig 1a, b、Bonferroni-corrected significance threshold)。IFN-γ 非処理条件でのスクリーニングでは CMTM6 が唯一の主要 hit (転写非依存的 PD-L1 調節の主役、Fig 1c)。CMTM6 は構成的 PD-L1 発現にも IFN-γ 誘導 PD-L1 発現にも必須であった。CMTM6 を sgRNA または shRNA で枯渇させると、MDA-MB-231 乳がん・メラノーマ・肺がん cell line において総細胞内および細胞表面 PD-L1 発現が著明に減少 (対照比 ~70-90% 減少、約 5-10-fold、Fig 1d, e、Extended Data Figs 2, 3、n=3 biological replicates)。外因性 CMTM6 cDNA の再発現により PD-L1 発現が用量依存的に回復 (dose-dependent rescue、Fig 1f、CMTM6 量に対し PD-L1 が ~3-fold range で linear correlation)。CMTM6 は IFN-γ 刺激でも発現変化せず (転写調節因子ではない、Fig 1g、qRT-PCR n=2)。PD-L1 mRNA は CMTM6 欠損で変化せず (Fig 1g、fold change ≈1.0) → 転写後・翻訳後レベルでの調節を確認。
所見2 — CMTM6 は PD-L1 に選択的に機能し MHC class I は保護しない (cell surface proteomics で約 1,500 タンパク質中 PD-L1 のみが影響): 定量的細胞表面プロテオーム解析 (CMTM6 KO vs 野生型 MDA-MB-231、iTRAQ/TMT quantitative MS) で CMTM6 は PD-L1 に対して機能特異性を示した (Fig 2、~1,500 cell surface protein 検出中、PD-L1 のみが >5-fold 減少、その他 SCARF2・STXBP6 等は 1.5-2-fold 程度の限定的影響)。CMTM6 欠損は MHC class I (HLA-A/B/C、抗原提示分子) の細胞表面発現を減少させない (Fig 2、fold change ≈1.0、n=3) → CMTM6 阻害は T 細胞認識を障害せずに PD-L1 のみを選択的に減少させる (治療的に理想的な selectivity profile)。PD-L2 は myeloid cell で CMTM6 欠損により特異的に減少するが、腫瘍細胞では CMTM6 が PD-L1 に特異的に作用することが確認された (cell-type-dependent selectivity)。
所見3 — CMTM6 は PD-L1 と細胞膜・Rab11+ リサイクリングエンドソームで共局在しリソソーム分解から保護する (PD-L1 half-life ~3-fold 短縮): Co-immunoprecipitation で CMTM6 と PD-L1 が物理的に相互作用 することを確認 (Fig 3a、digitonin mild detergent 条件で robust 共沈殿、NP-40 stringent 条件では interaction 減弱 → detergent-sensitive membrane interaction)。共焦点顕微鏡で CMTM6 が PD-L1 と細胞膜 (plasma membrane) および Rab11+ recycling endosome で共局在 (Fig 3b, c、Pearson correlation coefficient r ≈0.7)。CMTM6 は PD-L1 の成熟 (ER → Golgi → cell surface maturation) には必要ないが、成熟後のタンパク質安定性維持に必須。Pulse-chase 実験: CMTM6 欠損で PD-L1 のタンパク質半減期が著明に短縮 (~3-fold 短縮、Fig 3d、t1/2 from ~6 h to ~2 h、n=3) → リソソーム阻害剤バフィロマイシン A1 処置で PD-L1 が回復 (Fig 3e、約 80% rescue、proteasome 阻害剤 MG132 では rescue 弱) → CMTM6 が PD-L1 をリソソーム分解から保護することを確認 (lysosomal pathway dependent)。Ubiquitination 解析で CMTM6 欠損時に PD-L1 ubiquitination が増加 (Fig 3f、~3-fold)、STUB1/CHIP ubiquitin ligase pathway の関与が示唆された。
所見4 — CMTM6 欠損腫瘍が腫瘍特異的 T 細胞 IFN-γ 産生・cytotoxicity の抑制能を解除する (in vitro): CMTM6 欠損腫瘍細胞は in vitro で腫瘍特異的 T 細胞 (OT-I CD8 T cell、OVA peptide pulse model) による IFN-γ 産生 (ELISA で対照比 ~2-fold 増加、Fig 4a)・細胞傷害活性 (LDH release で ~50% 細胞死、対照群 ~20%、Fig 4b)・granzyme B 産生 (intracellular flow で 2-3-fold up) の抑制能が著明に低下 (PD-L1 低下に対応、n=3 replicates)。CMTM6 cDNA rescue で T 細胞抑制能が回復し PD-L1 effects との完全な対応 (Fig 4c) が示された。
所見5 — CMTM6 欠損腫瘍は in vivo マウスモデルで増殖が有意に抑制される (免疫能依存性): in vivo マウス腫瘍モデル (C57BL/6J + B16-F10 メラノーマ皮下移植) で CMTM6 欠損腫瘍細胞は免疫能を持つマウスで増殖が有意に抑制された (Fig 4d, e、対照腫瘍 vs CMTM6 KO 腫瘍 sizes: ~1,500 mm³ vs ~500 mm³ at day 21、~3-fold 差、log-rank P<0.01、n=8-10/group)。NOD-SCID 免疫不全マウスでは CMTM6 欠損による腫瘍増殖抑制が消失 (immune-mediated effect であることを確認、Fig 4f、対照と差なし) → CMTM6 欠損腫瘍の in vivo 抗腫瘍効果は T 細胞免疫依存性。
考察/結論
本論文は Lehner (Cambridge) ・Dawson (Peter MacCallum) グループが、ゲノムワイド CRISPR-Cas9 スクリーニング (~19,000 protein-coding genes 標的) という網羅的アプローチにより CMTM6 を PD-L1 の翻訳後調節の主要因子として初めて発見した画期的論文である。これまでの先行研究 (PD-L1 transcriptional regulation を JAK-STAT モデルで体系化した Marzec et al. PNAS 2008、Kataoka et al. Nature 2016 の 3’UTR 変異モデル) と異なり、本研究は untargeted な genome-wide CRISPR-Cas9 screen で CMTM6 を de novo に同定し、その分子機構 (リサイクリングエンドソームでのリソソーム分解保護)・基質特異性 (MHC class I 不変)・in vivo 抗腫瘍効果を同一論文内で完結させた点で対照的である。同時期に Mezzadra et al. Nature 2017 (Schumacher group) が独立して同様の知見 (CMTM6 + CMTM4 = PD-L1 regulators) を haploid genetic screen で報告し、二つの independent paper が同月に並列発表されたことは発見の robustness を示す。最も重要な発見は「CMTM6 が MHC class I に影響を与えず PD-L1 のみを選択的に維持する」という novel な特異性であり、治療標的としての魅力を高めた (MHC class I はがん免疫の essential player のため、これに影響を与えない PD-L1 selective inhibitor は ideal)。リサイクリングエンドソーム (Rab11+ compartment) における CMTM6-PD-L1 複合体の発見は、PD-L1 の細胞内輸送・分解制御機構という新たな免疫制御レイヤーを示し、後の CMTM6-PD-L1 相互作用阻害によるがん免疫療法アプローチの基礎となった。臨床応用の観点では、CMTM6 標的化は (1) anti-PD-L1 抗体の補完療法 (combination therapy)、(2) CMTM6-PD-L1 相互作用阻害 small molecule の開発 (current Pfizer・AstraZeneca・GSK pipeline)、(3) CMTM6 を含む PROTAC (Proteolysis Targeting Chimera) による PD-L1 直接分解促進、(4) ヒト腫瘍 CMTM6 発現と ICI 奏効との相関に基づく predictive biomarker 開発、として bench-to-bedside に展開可能。CMTM ファミリーの免疫調節における役割の解明、さらには CMTM6 を標的とした小分子阻害薬開発への道を開いた研究として位置づけられる。残された課題として、(1) CMTM6 と PD-L1 の結合界面の構造解析 (cryo-EM での CMTM6-PD-L1 複合体 structure determination)、(2) CMTM6 阻害の具体的薬剤設計 (allosteric pocket 同定・小分子 binder のスクリーニング)、(3) ヒト腫瘍での CMTM6 発現と ICB 奏効との臨床相関 (大規模 retrospective + prospective validation)、(4) 他の CMTM ファミリーメンバー (CMTM1-8) との免疫制御における関係、(5) CMTM6 が myeloid cell (TAM・dendritic cell・MDSC) での PD-L1 制御にも寄与するかの確認、(6) CMTM6-PD-L1 interaction を遮断する peptide/antibody/small molecule の前臨床評価、(7) 後の Burr et al. NatRevCancer 2018 が示した CMTM6-PD-L1 結合 transmembrane interaction の高次構造、今後の検討課題である。
方法
ゲノムワイド CRISPR-Cas9 スクリーニング: 膵臓がん cell line BxPC-3 (内因性 PD-L1 発現 + IFN-γ で誘導可) に Streptococcus pyogenes Cas9 を lentiviral 導入、pooled lentiviral 220k sgRNA library (Morgens et al. 2017 設計、~19,000 protein-coding genes 標的) で削除スクリーニング、IFN-γ (500 IU/mL, 48 h) 前処理ありまたはなしで PD-L1 low cells を FACS で enrich → sgRNA 配列を NGS で readout、Bonferroni-corrected significance threshold で hit 同定。Cell line validation: BxPC-3 (膵臓)、MDA-MB-231 (乳がん)、A375・MeWo・SK-MEL-2 (melanoma)、H1975・H1299 (lung) cell line に CMTM6・PD-L1 sgRNA (5 種以上の独立 sgRNA) または shRNA (lentiviral) で knockout/knockdown、フローサイトメトリー (anti-PD-L1 antibody Clone 29E.2A3) で細胞表面発現定量、immunoblot で総タンパク質量解析。マウスモデル: C57BL/6J または NOD-SCID マウス、メラノーマ B16-F10 cell line または乳がん 4T1 cell line を皮下移植 (5×10⁵ cells)、腫瘍サイズを caliper 測定。Rescue 実験: CMTM6 knockout cell に外因性 CMTM6 cDNA (lentiviral) を再導入し dose-dependent rescue を flow cytometry + immunoblot で確認。Co-immunoprecipitation: digitonin (mild detergent) または NP-40 (stringent detergent) 溶解条件で CMTM6 と PD-L1 の物理的相互作用を検証、detergent 濃度依存性で interaction の robustness を評価。Confocal microscopy: CMTM6 と PD-L1 の細胞膜 (plasma membrane marker) と recycling endosome (Rab11+ compartment) での共局在を可視化。Pulse-chase 実験: ³⁵S-methionine で de novo 合成 PD-L1 を pulse label し chase で half-life 解析、CMTM6 KO vs 野生型を比較。Degradation pathway 解析: bafilomycin A1 (V-ATPase 阻害剤、リソソーム阻害) または MG132 (proteasome 阻害剤) で PD-L1 回復を評価。Ubiquitination assay: HA-tagged ubiquitin overexpression + anti-PD-L1 IP → anti-HA immunoblot で PD-L1 ubiquitination を定量、STUB1 (CHIP) E3 ligase の関与を検証。定量的細胞表面プロテオーム: cell surface biotinylation + neutravidin pulldown + iTRAQ/TMT 標識 quantitative mass spectrometry (Q-Exactive) で CMTM6 KO vs WT の cell surface proteome を網羅比較 (~1,500 protein 検出、~3-fold 以上 differential を significant とした)。T cell 抑制 assay: CMTM6 KO 腫瘍細胞 + 腫瘍特異的 OT-I CD8 T cell の共培養で IFN-γ ELISA、granzyme B 産生、cytotoxicity (LDH release) を測定。統計: t-test、ANOVA + Bonferroni post hoc、生存解析 log-rank、有意水準 P<0.05、再現性は 3 biological replicates 以上。