- 著者: Yuxi Wei, Hinako Ago, Ryuichi Murakami, Shotaro Funatsu, Marina Osaki, Akira Nakajima, Yoshinori Hasegawa, Ryoji Kawakami, Shimon Sakaguchi, Shohei Hori
- Corresponding author: Shohei Hori (Graduate School of Pharmaceutical Sciences, University of Tokyo / RIKEN Center for Integrative Medical Sciences)
- 雑誌: Science Immunology
- 発行年: 2026
- Epub日: 2026-05-01
- Article種別: Original Article
- PMID: 42066061
背景
制御性T細胞 (Treg: regulatory T cell) は、免疫自己寛容と生体内ホメオスタシスの維持において中枢的な役割を担うT細胞サブセットである。Tregの発生と機能は、マスターレギュレーターである転写因子 (TF: transcription factor) のFoxp3によって支配されており、その欠損は全身性の致死的な自己免疫疾患を引き起こす。Tregは、特定の遺伝子座におけるDNA低メチル化や高いクロマチンアクセシビリティを特徴とする、独自の安定したエピゲノム景観を有している。例えば、Foxp3遺伝子座のCNS2 (conserved noncoding sequence 2; 保存非コード配列2) 領域は、TSDR (Treg-specific demethylated region; Treg特異的脱メチル化領域) として知られ、Foxp3発現の長期的な安定化を保証するエンハンサーとして機能する。
しかし、このTreg特異的なエピゲノムアイデンティティの確立におけるFoxp3自身の直接的な寄与については、長年にわたり議論が続いており、未解明な点が多い。初期の in vitro 研究である Sugimoto et al. (2006) や Hill et al. (2007) では、通常のCD4+ T細胞 (Tconv: conventional CD4+ T cell) にFoxp3を遺伝子導入しても、Treg特異的な転写シグネチャーの獲得は限定的であり、TSDRの脱メチル化も誘導されないことが示された。また、Samstein et al. (2012) は、Foxp3が主にTconvにおいて既に開放されているクロマチン領域に結合することを報告し、Foxp3は既存のエピゲノム景観の上で転写を制御するに過ぎず、de novoのクロマチン再プログラミングを能動的に開始する能力は不足しているというモデルを提示した。
一方で、Ohkura et al. (2012) などの研究は、T細胞受容体刺激によるエピゲノム変化とFoxp3発現が独立かつ相補的なイベントであることを示唆している。しかし、Foxp3欠損マウスや変異マウスを用いた最近の解析では、Treg特異的なクロマチンアクセシビリティが著しく変化していることが示されており、Foxp3が能動的なエピゲノム制御に関与している可能性も否定できない。このように、in vitroでの観察結果とin vivoでの遺伝子欠損表現型のあいだには大きな乖離があり、Foxp3がエピゲノム再プログラミングを直接駆動するのか、あるいは特定の微小環境シグナルとの協調が必要なのかという重要な課題について、十分な知見が不足している。この知識のギャップ (knowledge gap) を埋めるための研究が強く求められていた。
目的
本研究の目的は、Foxp3を導入したTconv細胞をin vivoにおける機能獲得プローブとして活用し、in vivoの環境的コンテキストにおいてFoxp3がTregのエピゲノムアイデンティティの確立に直接寄与するかどうかを検証することである。具体的には、in vitro培養系では再現されなかった、内因性Foxp3 (endoFoxp3) の発現誘導およびTreg特異的なエピゲノム・転写プログラムの獲得がin vivoで生じるかを明らかにする。さらに、この再プログラミングを許容する環境因子（特に細胞内シグナル経路）や、Foxp3と協調して段階的なクロマチン再プログラミングを駆動する分子機構（転写因子やエンハンサー領域の関与）を詳細に解明し、Tregの分子アイデンティティ決定におけるFoxp3の能動的役割を再定義することを目指す。
結果
in vivo環境における内因性Foxp3誘導サブセットの同定: Foxp3をレトロウイルスで導入したTconv細胞（移入前は内因性Foxp3の指標であるhCD2陽性率が1%未満）を、Rag1-/- 受容体マウス（n=6 mice）に移入したところ、移入後23〜24日の時点でドナー細胞の約30%がhCD2陽性（endoFoxp3+）へと変化した (Fig. 1B)。この内因性Foxp3の誘導は、中等度リンパ球減少（照射受容体）およびリンパ球充足（非照射受容体）の環境でも移入後7日の早期から再現性をもって観察されたが、mock導入細胞では1%未満に留まった (Fig. 1C)。CPDを用いた細胞分裂追跡実験では、endoFoxp3+細胞は分裂回数が極めて少ないCPDhigh画分に有意に濃縮されており、既存の極微量なTregサブセットが選択的に増殖したのではなく、in vivo環境において新規に分化誘導されたことが示された (Fig. 1D)。また、Foxp3レトロウイルスの希釈実験により、内因性Foxp3の誘導効率は導入された外因性Foxp3タンパク質の量と正の相関を示し、誘導には一定の閾値が必要であることが明らかになった。
Treg特異的な転写・エピゲノム景観の包括的獲得: ソートしたendoFoxp3+細胞のRNA-seq解析（n=2 replicates）において、Treg特異切遺伝子であるCtla4、Il2ra、Ikzf2、Tnfrsf18、Itgaeなどの発現が著しく上昇し、IfngやIl2などの炎症性サイトカイン遺伝子の発現は低下していた (Fig. 2A)。この転写プロファイルの変化は、野生型Tregと比較してlog2FC 1.8以上の変動を示す多くの遺伝子で一致していた。さらに、エピゲノム状態を評価するためバイサルファイトシーケンスを行ったところ、endoFoxp3+細胞ではFoxp3 CNS2（TSDR）領域およびCtla4 TSDR領域のCpGメチル化率が著しく低下し、野生型Tregと同等の脱メチル化状態を獲得していることが判明した (Fig. 2D)。ATAC-seqによるクロマチンアクセシビリティ解析（n=2 replicates）の主成分解析（PCA）では、endoFoxp3+細胞はPC2軸に沿って野生型Tregと極めて近い位置にプロットされ、Foxp3プロモーターやCNS2、Ctla4遺伝子座などのTreg特異的な開クロマチン領域（OCR: open chromatin region; 開クロマチン領域）が明瞭に開放されていることが確認された (Fig. 2E, G)。
内因性Foxp3タンパク質に依存しない抑制機能の獲得: in vitro抑制アッセイ（n=2 replicates）において、endoFoxp3+細胞はレスポンダーT細胞の増殖を強力に抑制したのに対し、mock導入細胞やendoFoxp3-細胞は全く抑制活性を示さなかった (Fig. 4A)。in vivoでの抑制能を検証するため、CD45RBhigh Tconv移入大腸炎モデル（n=8 mice）を用い、Foxp3 DTR-GFPマウス由来 of Foxp3導入細胞を移入した。ジフテリア毒素（DT）の投与によってGFP+ endoFoxp3+細胞を特異的に除去すると、受容体マウスは著しい体重減少と重篤な大腸炎を呈し、その病理スコアはTconv単独移入群と同等まで悪化した (Fig. 4C, D)。この結果から、Foxp3導入細胞の持つ抑制能はendoFoxp3+サブセットに完全に依存していることが実証された。さらに、内因性Foxp3タンパク質自体の寄与を評価するため、Foxp3 KO:hCD2マウス由来のTn細胞（n=5 replicates）に外因性Foxp3を導入して移入したところ、CTLA-4などの一部のマーカー発現は低下したものの、TSDRの脱メチル化状態は維持され、in vivo大腸炎に対する抑制能も野生型と同等に保持されていた (Fig. 5D, E)。
AKT-mTOR活性の低下によるin vivo許容環境の形成: in vitro培養細胞とin vivo回収細胞のRNA-seqデータを比較したPCA解析（n=3 replicates）では、環境の違い（in vitro vs in vivo）が最大の変動要因（PC1）として分離された (Fig. 6A)。遺伝子セット富化解析（GSEA: gene set enrichment analysis; 遺伝子セット富化解析）の結果、in vitro培養細胞ではAKT-mTORシグナル経路が高度に活性化していることが示された (Fig. 6B)。実際に、リン酸化フローサイトメトリー解析により、in vitroではphospho-AKTおよびphospho-4EBP1のレベルが著しく高かったのに対し、in vivoに移行するとこれらの活性が速やかに低下することが確認された (Fig. 6C)。in vitroにおいてmTOR阻害剤であるラパマイシン（IC50 50 nM）やTorin1（1 μM）を添加すると、Foxp3導入細胞においてのみ内因性Foxp3の誘導が約2.5-foldに促進された (Fig. 6D)。逆に、恒常活性型AKT（caAKT）を共導入すると、in vivoにおける内因性Foxp3の誘導は完全に消失した (Fig. 6E)。さらに、IL-2濃度を段階的に希釈して低濃度に抑えることで、AKT-mTOR活性が低下し、endoFoxp3+細胞の誘導効率が有意に上昇した (Fig. 6F)。
STAT5およびNF-κB経路を介したFoxp3の自己ループ駆動: ATAC-seqのクラスタリング解析（n=2 replicates）から、in vivoのendoFoxp3+細胞で選択的に開放されるOCRクラスター6を同定した (Fig. 7A)。このクラスターにはFoxp3プロモーター領域が含まれており、転写因子モチーフ解析により、NF-κB結合モチーフおよびフォークヘッド（FKH）様配列が有意に濃縮されていることが明らかになった (Fig. 7B, C)。機能的検証として、dnIκBαの共導入によるNF-κB核移行阻害、あるいはCRISPR-Cas9を用いたRelおよびRelaの二重欠損（n=6 mice）を行うと、CPDhighの未分裂細胞画分においても内因性Foxp3の誘導が著しく阻害された (Fig. 7E, F)。また、Stat5a/bのmiRNAによるノックダウン（n=3 replicates）、あるいはSTAT5結合部位であるCNS0領域を欠損させたTn細胞（n=5 mice）を用いた移入実験でも、endoFoxp3+細胞の誘導は有意に低下した (Fig. 7G, H)。これらの知見から、外因性Foxp3は、CNS0を介したSTAT5活性化、およびプロモーターとCNS3を介したNF-κB活性化を能動的に生じさせ、自己の転写を駆動する正のフィードバックループを形成していることが示された。
コアプログラムとエフェクター特異的プログラムの段階的駆動: 移入後7日（早期）と23日（後期）のATAC-seq時系列解析（n=2 replicates）を野生型Tregのデータと統合した結果、Foxp3によって誘導される開クロマチン領域は3つのサブクラスター（D1、D2、D3）に分類された (Fig. 8B)。D3は移入後7日の早期から23日の後期にわたって持続的に開放されている領域であり、Foxp3プロモーターなどを含み、単一細胞ATAC-seq解析においてcentral Treg (cTreg) およびeffector Treg (eTreg) の両サブセットで広く共有される「コアTregプログラム」に対応していた (Fig. 8D)。一方、D1およびD2は移入後23日の後期になって初めて開放される領域であり、Foxp3 CNS2などを含み、Helios+ eTregやRORγt+ eTregに特異的な「eTregプログラム」に対応していた (Fig. 8B, D)。モチーフ解析では、D3領域にはNF-κBおよびSTATモチーフが濃縮されていたのに対し、D1およびD2領域にはNF-κBに加えてAP-1やAICE（AP-1-IRF composite element）モチーフが強く濃縮されており、Foxp3がNF-κBやBATFなどの環境応答性転写因子と協調して、エピゲノム再プログラミングを段階的に進めていることが示された (Fig. 8E, G)。
考察/結論
先行研究との違い: 本研究は、Foxp3をTconv細胞に導入してもTreg特異的なエピゲノム景観（特にTSDRの脱メチル化）を再構成できないとしていた Sugimoto et al. (2006) や Ohkura et al. (2012) などの従来のin vitro研究の結論と異なり、適切なin vivoの環境的コンテキストにおいては、Foxp3が能動的かつ直接的にTregのエピゲノムおよび転写再プログラミングを駆動できることを初めて実証した。従来のin vitro培養系は、高濃度のIL-2や栄養因子によってAKT-mTOR経路が過剰に活性化しており、これがFoxp3によるエピゲノム制御を阻害する「非許容的」な環境となっていた。これに対し、本研究はin vivo移入系という機能獲得プローブを用いることで、生体内の微小環境が提供するシグナルとFoxp3の機能が統合されるプロセスを鮮やかに描き出している。
新規性: 本研究で初めて、Foxp3導入Tconv細胞の一部がin vivoにおいて内因性Foxp3の発現を自律的に誘導し、完全なTreg様アイデンティティを持つendoFoxp3+細胞へと分化する現象を新規に同定した。さらに、この再プログラミングが、Foxp3プロモーターやCNS0、CNS3を介したSTAT5およびNF-κB（c-Rel/RelA）の協調的な結合によって駆動される正の自己ループに依存していることを本研究で初めて明らかにした。また、時系列クロマチンプロファイリングにより、Foxp3が駆動するエピゲノム変化が単一のイベントではなく、cTregとeTregで共有される「コアプログラム（D3）」から、AP-1/BATFシグナルと連動した「eTreg特異的プログラム（D1/D2）」へと段階的に展開するダイナミックなプロセスであることを解明した点も極めて独創的である。
臨床応用: これらの知見は、自己免疫疾患や移植拒絶反応に対するTreg細胞療法の開発において重要な臨床的有用性を持つ。特に、IPEX (immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked) 症候群のように内因性Foxp3遺伝子に変異を持つ患者において、外因性Foxp3を遺伝子導入したT細胞がin vivoで安定したエピゲノム再プログラミングを経て強力な抑制能を発揮できることを示した点（Foxp3 KO細胞を用いた検証）は、遺伝子治療ベースのTreg療法の実現可能性を強く支持する。臨床現場への応用においては、移入する細胞のAKT-mTOR活性をあらかじめ薬理学的に抑制することや、in vivoでのIL-2濃度を最適化することが、治療用細胞の安定性と生存率を高めるための鍵となる。
残された課題: 今後の検討課題として、Foxp3を導入した細胞のうち、なぜ一部の画分（約30%）のみがendoFoxp3+細胞へとリプログラミングされ、残りの画分は抵抗性を示すのかという細胞不均一性の問題が残されている。これは、導入前のナイーブCD4+ T細胞自体に存在する未解明なエピゲノムの偏りや、遺伝子導入時の活性化状態の差異に起因する可能性があり、単一細胞レベルでのさらなる追跡が必要である。また、limitation (限界) として、Foxp3とNF-κBやAP-1/BATFとの物理的な相互作用が、どのゲノム遺伝子座において直接的なパイオニア活性を発揮しているのか、その詳細な分子トポロジーを解明することも、今後の重要な研究方向性である。
方法
マウスおよび細胞分離: 本研究では、C57BL/6J背景の遺伝子改変マウスを使用した。内因性Foxp3の転写活性を報告するレポーターとして、Foxp3 hCD2 (human cluster of differentiation 2; ヒトCD2) マウス、およびそのCD45.1/CD45.2コンジェニック系統を用いた。また、Foxp3欠損下での挙動を解析するため、Foxp3 KO (knockout; ノックアウト):hCD2マウスから得られた骨髄細胞を用いて放射線照射レシピエントに移植した骨髄キメラマウスを作製した。ドナー細胞として、脾臓およびリンパ節からCD4+ CD44low (CD44-low) CD62Lhigh (CD62L-high) human CD2- のナイーブT (Tn: naive conventional CD4+ T cell) 細胞をFACS (fluorescence-activated cell sorting; 蛍光活性化細胞選別) によって高純度（98%以上）で単離した。
レトロウイルス導入とin vivo移入: 単離したTn細胞を抗CD3ε抗体（0.5 μg/ml）およびIL-2 (interleukin-2; インターロイキン2)（10 ng/ml）存在下で活性化し、MSCV-IRES-Thy1.1 (Murine Stem Cell Virus-Internal Ribosomal Entry Site-Thy1.1) または MSCV-IRES-EGFP (Murine Stem Cell Virus-Internal Ribosomal Entry Site-Enhanced Green Fluorescent Protein) レトロウイルス (RV: retrovirus) ベクターを用いてFoxp3またはmock（空ベクター）を導入した。レトロウイルスの調製には、HEK293T細胞由来のパッケージング細胞株であるPlat-E (HEK293T-derived packaging cell line) を使用した。遺伝子導入細胞を、(1) Rag1-/- マウス（重度リンパ球減少）、(2) 6 GyのX線照射を施したFoxp3 hCD2マウス（中等度リンパ球減少）、または (3) 非照射のFoxp3 hCD2マウス（リンパ球充足）に静脈内移入した。移入前に、細胞分裂を追跡するためCPD (cell proliferation dye; 細胞分裂追跡色素) で標識した。移入後7日から30日の時点で、脾臓およびリンパ節からドナー由来細胞を回収し、内因性Foxp3の発現指標であるhCD2の有無に基づいて、endoFoxp3+ (hCD2+) および endoFoxp3- (hCD2-) サブセットにソートした。
マルチオミクス解析および機能評価: 回収した各細胞サブセットからRNAおよびゲノムDNAを抽出し、RNA-seq (RNA sequencing; RNAシーケンシング)、ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin with sequencing; トランスポゼース可アクセス性クロマチンアッセイ)、およびバイサルファイトシーケンス（Foxp3 CNS2およびCtla4 TSDR領域のメチル化解析）を実施した。また、既存の単一細胞マルチオーム (scMultiome: single-cell multiome) データやFoxp3のChIP-seq (chromatin immunoprecipitation sequencing; クロマチン免疫沈降シーケンシング) データとの統合解析を行った。 in vitro抑制アッセイでは、CPD標識したTconv細胞（レスポンダー）と、ソートした各ドナーサブセットを様々な比率で共培養し、3日後の増殖抑制能をフローサイトメトリーで評価した。in vivo機能評価には、CD45RBhigh (CD45RB-high) Tconvの移入による大腸炎モデルを用い、Foxp3 DTR-GFP (diphtheria toxin receptor-green fluorescent protein; ジフテリア毒素受容体-緑色蛍光タンパク質) マウス由来の細胞を移入した後にジフテリア毒素 (DT: diphtheria toxin) を投与してendoFoxp3+細胞を特異的に除去する実験を行った。
シグナル経路の解析: AKT-mTOR (mechanistic target of rapamycin; ラパマイシン標的タンパク質) 経路の関与を調べるため、in vitro培養時にラパマイシン（50 nM）やTorin1（1 μM）によるmTOR阻害、あるいは恒常活性型AKT (caAKT: constitutively active AKT) の共導入を行った。NF-κB (nuclear factor-kappa B) およびSTAT5 (signal transducer and activator of transcription 5) 経路の解析には、優性阻害型IκBα (dnIκBα: dominant-negative IκBα) の共導入、CRISPR-Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9) ゲノム編集技術を用いたRel/Relaの二重欠損、Stat5a/bに対するmiRNA (microRNA) によるノックダウン、およびFoxp3のCNS0欠損（STAT5結合部位）またはCNS3欠損（NF-κB結合部位）マウス由来のTn細胞を用いた。統計解析には、PrismおよびRを使用し、2群間比較にはpaired t-test、多群間比較にはone-way ANOVA、two-way ANOVA、Kruskal-Wallis test、およびFisher’s exact testを適用した。