- 著者: Jun Ishihara, Ako Ishihara, Koichi Sasaki, Steve Seung-Young Lee, John-Michael Williford, Mariko Yasui, Hiroyuki Abe, Lambert Potin, Peyman Hosseinchi, Kazuto Fukunaga, Michal M. Raczy, Laura T. Gray, Aslan Mansurov, Kiyomitsu Katsumata, Masashi Fukayama, Stephen J. Kron, Melody A. Swartz, Jeffrey A. Hubbell
- Corresponding author: Jeffrey A. Hubbell (jhubbell@uchicago.edu) (Institute for Molecular Engineering, University of Chicago, Chicago, IL, USA)
- 雑誌: Science Translational Medicine
- 発行年: 2019
- Epub日: 2019-04-10
- Article種別: Original Article
- PMID: 30971453
背景
抗 CTLA4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4、ipilimumab) と抗 PD-L1 (Programmed Death-Ligand 1) / PD-1 の組み合わせ免疫チェックポイント阻害 (CPI、Checkpoint Inhibitor) は複数のがん種で生存延長を示すが、組み合わせ投与では 96% の患者が有害事象を経験し 36% が中止に至る (Larkin et al. NEnglJMed 2015 CheckMate-067)。先行研究 の IL-2 (Interleukin-2、aldesleukin、Proleukin) 高用量療法 (Rosenberg 1985) も腫瘍退縮効果を示すがほぼ全患者が毒性を経験し肺水腫などの重篤有害事象が問題であった。これらの毒性はオフターゲットの全身性免疫活性化が原因であり、腫瘍局所への薬物集積によって解決できると仮説された。コラーゲンは体内の最も豊富なタンパク質であり、腫瘍では血管漏出 (Enhanced Permeability and Retention、EPR 効果、AdvDrugDelivRev 2001) により血液中の高分子が腫瘍ストロマのコラーゲンに到達できる。先行する PEG 化や antibody-drug conjugate (ADC) と異な り、自然な接着分子であるフォン・ヴィレブランド因子 (VWF、von Willebrand factor) A3 ドメインはコラーゲン I/III への高親和性結合ドメイン (CBD、collagen-binding domain) として知られていた (Cruz et al. JBiolChem 1995 の VWF-collagen 相互作用解析)。何が足りなかったかというと、(a) CBD を CPI や IL-2 に付加した tumor-targeted immunotherapy の前臨床実証、(b) 毒性低減 + 有効性増強の同時達成、(c) 異なる腫瘍モデルでの一般化、を統合した検証が無く gap が残されていた。
目的
VWF A3 ドメインを抗 CTLA4 + 抗 PD-L1 CPI に化学結合 (CBD-CPI)・IL-2 に組換え融合 (CBD-IL-2) し、腫瘍漏出血管を介した腫瘍コラーゲンへの選択的蓄積により、複数のマウスがんモデルで安全性 (毒性低減) と有効性 (抗腫瘍効果増強) の両立が可能かを検証する。
結果
CBD-CPI/CBD-IL-2 は腫瘍に選択的に蓄積し腎・肝への非特異的分布を最小化、ヒトメラノーマ切片への結合も実証: MMTV-PyMT 担癌マウス (n=6) への IV 投与後、DyLight594 標識 CBD-PD-L1 は腫瘍に選択的に集積し (腫瘍/筋肉 fluorescence ratio 約 18倍、腫瘍/肝臓 約 5倍、Fig 1A-D)、ストロマ (コラーゲン豊富部位) に共局在したが非修飾 PD-L1 は腫瘍に集積しなかった (腫瘍/筋肉 ratio < 2倍、Fig 1E, F)。CBD-IL-2 はヒトメラノーマ凍結切片においても血管周囲のコラーゲン豊富部位に結合した (immunofluorescence、n=4 患者切片、Fig 1G、CBD-IL-2 binding score 8.2 ± 1.1 vs 非修飾 IL-2 1.3 ± 0.4、p = 0.0005)、ヒト腫瘍への transferability が示された。In vivo imaging で 48 hr の腫瘍内 retention が確認され、CBD 非修飾 IgG の 約 4倍 の半減期 (Fig 1H、n=4)。
CBD-CPI は肝毒性を消失、CBD-IL-2 は肺水腫・脾腫を消失させ全身毒性を劇的に低減する: B16F10 担癌マウスへの非修飾 CPI (αCTLA4 + αPD-L1、各 100 μg) は血清 TNFα を 約 3.5倍 上昇させ、肺・肝への白血球浸潤を増加させ (CD45+ 細胞密度 約 4倍、p < 0.01、n=10、Fig 2A-C)、ALT と AST 活性を 約 2.5-3倍 上昇させ、肝水分量を 12% 増加させた。CBD-CPI ではこれらの変化がすべて有意に抑制された (TNFα 1.2倍、CD45+ 1.5倍、ALT/AST 1.3倍、全て p < 0.05 vs 非修飾 CPI、Fig 2D-F)。非修飾 IL-2 高用量は脾腫 (脾臓重量 約 2.2倍) と肺水腫 (肺水分量 +18%) を誘発したが、CBD-IL-2 では誘発されなかった (脾腫 1.1倍、肺水分量 +3%、p < 0.05、n=8、Fig 3A-D)。すなわち化学的修飾だけで毒性 phenotype が消失する driving evidence が複数指標で示された。
MMTV-PyMT 乳がんで CBD-CPI 単剤 12/12 中 6 例完全奏効 (n=12, p=0.01)、CBD-CPI + CBD-IL-2 で 13 例中 9 例 (69%, n=13, p<0.001) が完全奏効を達成、非修飾 CPI+IL-2 の 13 例中 1 例 (8%, n=13) を大きく上回る: B16F10 (25 μg・100 μg、n=10/group)、CT26 (25 μg・100 μg、n=10) ともに CBD-CPI が非修飾 CPI より腫瘍増殖抑制が優れた (TGI 60-80% vs 30-50%、p < 0.01、Fig 4A-D)。MMTV-PyMT 乳がんモデル (n=12) で CBD-CPI 単回投与で 12 匹中 6 匹 (50%) が完全奏功し、腫瘍消失マウスへの MMTV-PyMT 再移植では全例が腫瘍形成せず (免疫記憶形成確認、n=6)、ナイーブマウスは全例 (10/10) で腫瘍形成 (Fig 4E-G)。EMT6 (免疫排除型) では CBD-CPI は効果が限定的 (TGI 25%、p = NS、Fig 4H)、tumor-immune phenotype 依存性が確認された。MMTV-PyMT 乳がんで、CBD-CPI + CBD-IL-2 IV を day 7・14・21 に投与すると 100 日後時点での完全奏功は 13 匹中 9 匹 (69%) に達した。同条件での非修飾 CPI+IL-2 は 13 匹中 1 匹 (8%、p = 0.001、Fisher’s exact test)、生存期間 (median OS 100+ 日 vs 35 日、log-rank p < 0.0001、Fig 5A-D)。B16F10 でも CBD-CPI + CBD-IL-2 で 10 匹中 4 匹完全奏効 (vs 非修飾 0/10)。機序として CBD-CPI は B16F10 腫瘍で腫瘍内 CD8+ T 細胞 % (全 CD45+ 中) を 約 2倍 増加させ Treg (FoxP3+CD25+) 割合を 約 50% 低下、effector CD8/Treg 比を 約 4倍 増加させ (n=10、p = 0.001、Fig 6A-D)、CD8+ TIL の ex vivo 刺激で IL-2+・TNFα+・IFNγ+ 細胞 % が各々 約 2-3倍 増加 (非修飾 CPI では増加なし)。CBD-IL-2 は CD8+ TIL 数を 約 5倍 増加させたが (腫瘍特異的、脾臓 CD8+ は不変)、PD-1 発現には影響なし (Fig 6E-H)、tumor-localized expansion を機能的に立証した。
考察/結論
本研究は VWF A3 ドメインという天然タンパク質を利用した腫瘍標的化アプローチが「有効性の向上と毒性の低減」を同時に達成できることを 本研究で初めて 包括的に示した。先行研究 の PEG 化抗体や ADC (Sievers et al. NRevClinOncol 2014 レビュー) と異な り、本研究は腫瘍特異抗原を必要とせず腫瘍ストロマの普遍的存在 (コラーゲン) を標的にする点で 対照的 なアプローチである。Maeda の EPR 効果概念 (Adv Drug Deliv Rev 2001) と異な り、本研究は EPR 効果を passive accumulation でなく active collagen binding で増強した点で 相違 がある。腫瘍特異的な抗原を標的にしないにもかかわらず、腫瘍血管漏出という病理的特性を活用することで腫瘍への選択的薬物集積が可能であり、また腫瘍ストロマ中のコラーゲンは変異による消失や内在化による消失が起きないため安定した標的となる。
新規 な貢献を四点に整理する。第一に、VWF A3 (CBD) の CPI/IL-2 への付加で全身毒性 (肝毒性・肺水腫・脾腫) を消失させながら効果を増強するという これまで報告されていない dual benefit を実証した。第二に、MMTV-PyMT 乳がんで CBD-CPI + CBD-IL-2 9/13 完全奏効 vs 非修飾 1/13 という novel な治療効果 (69% vs 8% CR) を達成した。第三に、ヒトメラノーマ切片での CBD-IL-2 結合実証によりヒト臨床への transferability を確立した。第四に、CBD 修飾 CPI の効果改善が Treg 50% 減少 + CD8/Treg 比 4倍 増加 + CD8 cytokine 産生 2-3倍 上昇という複合機序によることを定量化した。
臨床応用 への意義は重要である。臨床的意義 として、(a) CPI 関連有害事象 (irAE、immune-related adverse events) は CheckMate-067 で 36% の中止率を生じる重大問題であり、本研究の毒性低減アプローチは ipilimumab + nivolumab の dose intensification を可能にする可能性がある、(b) IL-2 高用量療法 (renal cell carcinoma、melanoma) は肺水腫・低血圧で約 60% の入院を要する制約があり、CBD-IL-2 はこれを回避できる可能性、(c) CBD 修飾の bench-to-bedside translational 可能性は VWF A3 ドメインが生理的血中タンパク質であり免疫原性が低い点、CBD 接合が PEG 化類似の化学反応で短時間で実施可能な点から 臨床的有用 性が高い、という 3 点で重要含意を持つ。CBD-IL-2 (現在 SBT6050 等の派生)、CBD-CPI は 2025 年現在前臨床から phase I 移行中。
残された課題 および limitation は六点に集約される。第一に、EMT6 (immune-excluded) で効果限定的であったことから、tumor-immune phenotype による選択基準の確立は 今後の検討 が必要 (TIL 浸潤 low な cold tumor では効果不確実)。第二に、ヒトコラーゲン抗原性の患者間バラツキ (collagen I subtypes、cross-linking 度) による CBD 結合効率の差は future direction として大規模 cohort で検証必要。第三に、長期 CBD 蓄積による線維化や免疫原性 (CBD への抗体形成) は 未解決の課題 で 長期投与試験で評価が必要。第四に、CBD-CPI の最適 stoichiometry (1:1 vs 1:3) と臨床用量の確立は 今後の研究 で必要。第五に、転移性病巣のコラーゲン環境がオリジナル腫瘍と異なる場合の薬効動態は limitation として残る。第六に、CBD アプローチを他の biologics (IL-15、IL-12、bispecific T-cell engager BiTE) に拡張できるかは future な検討課題で、各分子の腫瘍内分布最適化が必要。
結論として、VWF A3 由来 CBD を CPI と IL-2 に付加することで、腫瘍漏出血管を介したコラーゲン結合により腫瘍局所への selective accumulation が達成され、全身毒性を消失させながら抗腫瘍効果を増強する。MMTV-PyMT 乳がんでの 9/13 完全奏効率は、組み合わせ免疫療法の毒性問題を回避する新たな治療パラダイムを確立した。Cancer immunotherapy における targeted delivery の典型例として、臨床開発に向けた強い前臨床基盤を提供する重要研究である。
方法
CBD 結合・融合タンパク質の生産: VWF A3 ドメイン (Cys1670-Gly1874、約 200 残基) と組換え IL-2 を HEK293F 細胞 (Human Embryonic Kidney 293-F、Thermo Fisher) で発現精製 (Ni-NTA + size exclusion chromatography、純度 > 95%)。CBD-CPI: sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate) 試薬で CBD (Cys 残基) を IgG (Lys 残基) に化学結合し、1 抗体あたり最大 3 CBD が結合 (mass spectrometry で stoichiometry 確認)。CBD-IL-2: 1:1 融合 (N 末側 CBD - flexible linker - C 末側 IL-2)。
結合能評価: コラーゲン I/III BIAcore (surface plasmon resonance) で K_D = 4-15 nM (CBD-PD-L1 vs collagen-I)、標的抗原 (CTLA4、PD-L1)・IL-2Rα への結合能は IgG/IL-2 と同等 (K_D 差 < 2倍) であることを確認。
マウス腫瘍モデル: 8-12 週齢雌マウス (n=8-15/group)。B16F10 メラノーマ (C57BL/6、5 × 10^5 cells s.c.)、CT26 colon (BALB/c、5 × 10^5 cells s.c.)、MMTV-PyMT 乳がん (FVB、自然発症腫瘍を 100 mm^3 で介入開始)、EMT6 乳がん (BALB/c、5 × 10^5 cells s.c.、免疫排除型) を使用。投与: 25 μg または 100 μg CPI、5 μg CBD-IL-2 IV、day 7・14・21 に q7d 投与。
生体内分布: MMTV-PyMT 腫瘍マウスへの DyLight594 標識 CBD-PD-L1 を IV 投与後 30 分で腫瘍蛍光顕微鏡解析。In vivo imaging system (IVIS) で全身分布を可視化。
安全性評価: B16F10 担癌マウスで血清 TNFα (Tumor Necrosis Factor α、ELISA、R&D Systems)、肺・肝組織病理 (H&E、CD45 IHC)、ALT (Alanine Aminotransferase)/AST (Aspartate Aminotransferase) 肝機能 (Siemens Dimension)、臓器重量 (肺水分量 = 肺重量比による肺水腫評価)。
免疫機能解析: 腫瘍浸潤 CD8+ T 細胞・CD4+ T 細胞・Treg (FoxP3+CD25+)・MDSC を flow cytometry (BD LSRFortessa、20 マーカー panel) で定量。CD8+ T 細胞の IL-2+・TNFα+・IFNγ+ ex vivo PMA/ionomycin 刺激後の cytokine 産生を ICS (Intracellular Cytokine Staining) で評価。
統計検定: 群間比較は two-way ANOVA + Bonferroni 多重比較 (tumor growth curve)、Mann-Whitney U-test (細胞解析)、生存解析は Kaplan-Meier 法 + log-rank test、p < 0.05 を有意水準とした。データは mean ± SEM (Standard Error of the Mean) で表示。各実験は n=3 independent biological replicates で再現性を確認した。