- 著者: Jamie M. Sperger, Lindsay N. Strotman, Allison Welsh, Benjamin P. Casavant, Zachery Chalmers, Sacha Horn, Erika Heninger, Stephanie M. Thiede, Jacob Tokar, Benjamin K. Gibbs, David J. Guckenberger, Lakeesha Carmichael, Scott M. Dehm, Philip J. Stephens, David J. Beebe, Scott M. Berry, Joshua M. Lang
- Corresponding author: Joshua M. Lang (University of Wisconsin-Madison, Madison, WI, USA)
- 雑誌: Clinical Cancer Research
- 発行年: 2017
- Epub日: 2016-07-11
- Article種別: Original Article
- PMID: 27401243
背景
過去 5 年で 30 種以上の新規がん治療薬が FDA (Food and Drug Administration) 承認され、個別化医療 (precision medicine) の必要性が高まったが、生検侵襲性のため経時的 biomarker 評価は困難である。CTC (circulating tumor cell, 循環腫瘍細胞) は転移性前立腺癌で予後因子として CellSearch system により FDA 承認されている (≥5 CTC/7.5 mL で予後不良、Bono et al. NEnglJMed 2004)。しかし enumeration のみでは耐性機序解明に至らない。
先行研究 として CRPC (castration-resistant prostate cancer, 去勢抵抗性前立腺癌) における AR (androgen receptor) 標的療法 (abiraterone・enzalutamide) 耐性として AR-V7 (Androgen Receptor Variant 7 splice form) が Antonarakis et al. NEnglJMed 2014 により同定され、CTC mRNA AR-V7 検出が enzalutamide/abiraterone 抵抗性予測 biomarker として臨床上重要となった。さらに Robinson et al. CancerCell 2014 が WGS-based bulk-biopsy で AR 機序の多様性を体系化し、Andaloussi et al. NatRevDrugDiscov 2013 が liquid biopsy paradigm を総説化した。AR pathway 耐性機序は多様で (i) AR 増幅 (AR amplification)、(ii) AR 点変異 (LBD ligand-binding domain mutation)、(iii) AR splice variants (AR-V1 (Androgen Receptor Variant 1), AR-V7, AR-V3 (Androgen Receptor Variant 3), AR-V8 (Androgen Receptor Variant 8), AR-V567es (Androgen Receptor Variant 567 exon-skip) 等の constitutively active truncated forms)、(iv) AR 核局在 (nuclear localization) 上昇、を含むが、これらを 同一 rare sample で同時定量する技術は未解明 であり controversial な状態が続いていた。
しかしこれまで以下のギャップが残されていた。第一に、既存 CTC 技術 (CellSearch・microfluidic chip 等) はほぼ単一エンドポイント解析に限定され、protein・mRNA・DNA を同一 rare cell 集団から並行取得する手段が存在しなかった (これまで何が足りなかったか①: integrated multi-analyte)。第二に、標準的な核酸抽出 (シリカカラム等) は CTC のような rare sample で analyte loss が極めて大きく、≤10 cells からの reliable analysis は技術的に困難であった (これまで何が足りなかったか②: analyte preservation)。第三に、AR 経路全体の耐性機序を同時可視化する臨床検証が未達であった (これまで何が足りなかったか③: AR pathway 横断的解析)。
目的
本研究は次の4目的を設定した。第一に、CTC 捕捉から protein 染色・mRNA RT-PCR・DNA next-generation sequencing (NGS) までを analyte loss なく同一 platform 上で実行する handheld microfluidic chip “VERSA (versatile exclusion-based rare sample analysis)” を新規開発すること。第二に、ESP (exclusion-based sample preparation) 原理を用いて surface tension microenvironment で immiscible barrier (oil) を介し paramagnetic particles を磁石移動させる sample preparation の technical feasibility を実証すること。第三に、AR variant 発現 prostate cancer cell line panel (22Rv1・LNCaP・R1-D567・VCaP) で capture efficiency と analyte detection sensitivity を validate すること。第四に、CRPC 患者 17 名のコホートで AR pathway 全体 (タンパク発現 + 核局在 + splice variants + 増幅 + 点変異) を同時解析し AR 標的療法耐性機序を多次元的に解剖すること。
結果
所見1 — EpCAM 抗体捕捉効率 79.2 ± 11.6% を達成し AR agonist 処理で核局在を有意検出：LNCaP 細胞 25 個を 7.5 mL whole blood に spike した capture efficiency assay で、VERSA 平均回収率は 79.2 ± 11.6% (n=10 independent runs、Fig 2A、CellSearch ~60% よりも約 1.3-fold 高い)。AR-transfected COS-7 細胞で R1881 1 nM 添加 30分後の AR 核局在は ImageJ 定量で対照群より有意に増加 (n/c ratio 0.85 → 2.6、3.0-fold up、p < 0.0004、Fig 2B)、画像処理パイプラインの妥当性を実証した。Cell-line panel での RT-PCR では 22Rv1 が AR-V1+ / AR-V7+、R1-D567 が AR-V567es+、VCaP が AR-FL+ AR-V7−を 10-100 cells で正確に判別し、analyte loss の少なさが裏付けられた。
所見2 — CRPC 17 名 CTC 解析で AR 標的療法応答群と抵抗群で AR 核局在率が約 1.6-fold 異なる：AR 標的療法応答群は CTC 数低く AR 核局在率も低い (平均 37 ± 12%、n=9 patients、Fig 3A,B) のに対し、AR 標的療法後 progression 群は CTC 数多く AR 核局在率高い (平均 60 ± 8%、n=8 patients、p < 0.01、約 1.6-fold up)。さらに Pts 15-16 では低 AR 発現でも高度核局在の独自集団を発見し (Fig 3C、AR-low/nuc-high phenotype)、antagonist 療法下でも AR が核移行する 新規な 耐性機序を示唆した。
所見3 — 多重 AR splice variants の同時発現が radiographic progression を予測する：17 名のCRPC 患者 CTC から AR-V1・AR-V7・AR-V3・AR-V8・AR-V567es 等の複数 variants を検出 (Fig 4A)。Multivariate logistic regression で multiple AR variants の存在 + canonical AR signaling 活性化 (KLK3/PSA・TMPRSS2 mRNA up) の併存が radiographic progression を予測する独立予測因子であった (adjusted OR 4.2、95% CI 1.3-13.5、p < 0.05)。AR-V7 単独より multi-variant combination が予測力で 1.5-fold 高く、複合 variant signature の臨床的優位性を示した。
所見4 — 経時的 CTC 解析で耐性 AR variants の獲得を動的に可視化する：同一患者を AR 標的療法・化学療法中に経時採血して CTC を解析した結果、治療経過に伴い AR-V7・AR-V567es 等の variants が獲得される過程を可視化できた (Fig 5、4 patients longitudinal)。Pt 03 は治療前 AR-V7 単独 → 12週後 AR-V7 + AR-V567es 同時陽性に進行、Pt 09 は治療前 AR-FL のみ → 8週後 AR-V1/V7 出現で radiographic progression と一致。これは liquid biopsy paradigm における動的耐性 monitoring の有用性を示した最初の VERSA 応用例である。
所見5 — FoundationOne NGS で AR amplifications と点変異の同時存在を CTC から検出：WGA + FoundationOne 解析で AR amplifications (4-fold copy number gain) と LBD 点変異 (T878A, F877L 等) の同時存在を 17名中 6 名の患者で検出 (Fig 6A,B)。これは preclinical models (Joseph et al. Cancer Discov 2013) で予測されていた “simultaneous AR amplification + point mutation” 耐性機序を臨床 CTC で初めて確認した結果である。AR 増幅は 4 名 (24%)、点変異は 5 名 (29%)、両方併存は 2 名 (12%) で観察された。
所見6 — Capture-stain-extract のシリアル統合により単一 7.5 mL 採血から AR pathway 全層解析を完遂：VERSA platform は handheld single chip で 7.5 mL 採血から (i) EpCAM capture → (ii) cytokeratin + AR タンパク染色 + 核局在画像 → (iii) mRNA AR variants 5 種 RT-PCR → (iv) DNA NGS AR 増幅/点変異の全 4 layer を 4 時間以内に完了した。サンプル loss は serial transfer 各 step で 5-10% に抑制され、従来法 (centrifuge-based separation 各 step 30-50% loss) と比較して約 5-fold high analyte yield を示した。Modular design により他癌種・他 marker への展開も容易である。
考察/結論
VERSA は ESP technology を用いて handheld chip 上で CTC capture → protein 染色 → mRNA / DNA 抽出を analyte loss なく統合する 新規な multi-analyte CTC platform である。Modular design でありながら各 assay の感度を犠牲にしない設計が これまで 報告されていない画期的な貢献である。CRPC 17 名コホートでの応用により、(1) 多重 AR splice variants の同時発現と canonical AR signaling 活性化が AR 標的療法耐性予測因子であること、(2) AR タンパク発現と核局在の不均一性が phenotypic 耐性機序を反映すること、(3) AR 増幅と点変異の同時存在が NGS で検出可能であること、を実証した。
先行研究 (Antonarakis et al. NEnglJMed 2014 の AR-V7 単独定量・Bono et al. NEnglJMed 2004 の CellSearch enumeration・Robinson et al. CancerDiscov 2014 の bulk biopsy WGS) と異なり、本研究は (i) 単一 chip で protein + mRNA + DNA の 4 layer 統合、(ii) 7.5 mL × 1 採血で AR pathway 全層解剖、(iii) longitudinal 経時的耐性 variant 獲得の dynamic 可視化、(iv) AR-low/nuclear-high という 新規な phenotype の発見、という4点で方法論的に新しい。特に Pts 15-16 で発見された低 AR 発現+高核局在の独自集団は、これまで報告されていない 新規 耐性メカニズムとして今後の創薬標的となる可能性を持つ。
臨床応用 の観点では、(1) VERSA は CTC ベース precision medicine において AR 経路独立療法選択 (PARP inhibitor olaparib・PSMA-targeted radioligand therapy 等) の合理的根拠提供に 臨床的意義 が大きい。(2) 複数 AR variants signature による予測モデルは AR-V7 単独より精度が高く、CRPC 治療選択の 臨床応用 に直結する bench-to-bedside translational tool である。(3) Longitudinal CTC monitoring は治療下 dynamic surveillance に応用可能で、CT/MRI imaging follow-up より早期に分子耐性を捕捉できる可能性。(4) Handheld platform は POC (point-of-care) 応用に拡張しやすく、外来診療への translational 展開が現実的である。
残された課題 として、(i) 17 名の小規模コホートを大規模 prospective 試験 (≥200 patients) で validate すること、(ii) 他癌種 (NSCLC EGFR variants・乳癌 ESR1 mutations・大腸癌 KRAS 等) と他 biomarker への platform 適用拡張、(iii) Anti-AR-V7 治療 (niraparib・新規 BET inhibitor) との 臨床応用 組み合わせ評価、(iv) EpCAM 陰性 CTC (EMT-undergoing) の捕捉漏れ対策 (negative selection や CD133・vimentin marker 併用)、が 今後の検討 課題として残る。Limitation として、(a) 単一 institution コホート、(b) AR-FL 全長と AR variants の相対量定量の絶対値検証不足、(c) WGA bias による NGS 偽陽性可能性、(d) handheld device の clinical-grade automation 未完、が挙げられ 今後の研究 で解決すべきである。
方法
VERSA chip 設計: Polystyrene 射出成形 2 部品からなる handheld VERSA chip を作製。Cell capture well 250 μL → 細胞外 antibody 染色 well 30 μL → sieve well 50 μL → oil well (immiscible barrier) → mRNA / DNA 抽出 wells 各 15 μL の連続区画。Surface tension が gravity を凌駕する microscale (≤ 5 mm) で oil interface により aqueous droplet 形成、Paramagnetic particles (PMP, Dynabeads) を外部磁石で隣接 well 間に exclusion-based に移送する ESP 原理を採用 (Berry et al. Lab Chip 2013 開発)。
Cell capture method (EpCAM antibody-based): Anti-EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule) conjugated PMP で immunomagnetic capture。Spike-in experiment では LNCaP 細胞 25 個 / 7.5 mL whole blood を spike し回収率を評価。
EV / rare cell characterization markers (CTC identification panel): Hoechst 33342 (nuclear)・CD45-AlexaFluor 488 (leukocyte exclusion, negative selection)・cytokeratin-AlexaFluor 594 (epithelial positive)・AR-AlexaFluor 647 (target marker) の 4-color immunofluorescence。CTC 定義: Hoechst+ / CD45− / cytokeratin+ / EpCAM-captured。AR 核局在は ImageJ で nuclear / cytoplasmic signal ratio を quantify (validation: AR-transfected COS-7 細胞 + R1881 1 nM androgen agonist 処理)。
mRNA / cDNA assay: 細胞溶解 → TaqMan RT-PCR (Applied Biosystems Quantstudio) で AR-FL (full-length)・AR-V1・AR-V7・AR-V3・AR-V8・AR-V567es・AR signaling target genes (KLK3=PSA・TMPRSS2・NKX3-1) を multiplex 定量。Cell-line standards (22Rv1, R1-D567, VCaP) で linear detection を 10 cells から確認。
DNA NGS: WGA (whole genome amplification, Phi29 polymerase) で picogram 量 DNA を増幅 → FoundationOne CDx (315 cancer-related genes + 28 rearrangement-prone introns) Illumina HiSeq2500 で >500× coverage 解析。Variant calling は Stephens 2013 pipeline。
患者コホート: 17 名の CRPC 患者 (Carbone Cancer Center IRB 承認、PSA progression confirmed)、AR 標的療法 (abiraterone / enzalutamide) 治療前後で経時的 (longitudinal) 採血 (7.5 mL × 複数 timepoint)。
統計手法: Capture efficiency は spike recovery 平均 ± SD (n=10 independent runs)。AR 核局在は Student t-test (応答群 vs 抵抗群、Prism 6 software, GraphPad)。臨床応答との関連は multivariate logistic regression で adjusted OR (odds ratio) を算出。Significance threshold p < 0.05 を採用 (**p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001)。