- 著者: Zhong-ning He, Qi Huang, Yi Li, Jia-qi Hu, Tong-tong Liu, Yu-wei Zhao, Xiao-ling Ren, Shu-lin He, Yue Li, Bo-lun Shi, Rui Liu, Qiu-jun Guo, Xing Zhang, Zhan Shi, Jie He, Run-zhi Qi, Bao-jin Hua, et al.
- Corresponding author: Zhan Shi, Jie He, Run-zhi Qi, Bao-jin Hua (Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing)
- 雑誌: Chinese Medicine
- 発行年: 2026
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- PMID: 42092980
背景
肺がんは世界で最も多い悪性腫瘍であり、がん関連死亡の首位を占める。2022年には約250万件の新規症例と180万件以上の死亡例が報告され、全がん診断の12.4%・全がん死亡の18.7%に相当する (Bray et al. 2024)。非小細胞肺がん (NSCLC) に対してはPD-1/PD-L1軸を標的とする免疫チェックポイント阻害薬 (ICI) が治療革命をもたらしたが (Zhou et al. 2021)、持続的奏効を示す患者は一部に限られる (Garon et al. 2019)。主要な障壁として免疫抑制性腫瘍微小環境 (TME) が挙げられ、T細胞疲弊の誘導が抗腫瘍免疫を著しく障害することが知られている (Lahiri et al. 2023)。
T細胞疲弊は、慢性感染症や腫瘍の進行中に生じるT細胞機能不全の状態であり、複数の抑制性受容体の発現亢進とエフェクターT細胞の細胞傷害活性の低下を特徴とする (Wherry et al. 2015)。この疲弊状態は、T細胞の抗腫瘍免疫機能を弱め、ICIを含む他の免疫療法の有効性を制限する (Chow et al. 2022)。この免疫抑制性環境の主要な調節因子の一つが骨髄由来抑制細胞 (MDSC) である。MDSCはがんで拡大する未熟骨髄系細胞集団であり、アルギナーゼ1 (Arg-1)・誘導型一酸化窒素合成酵素 (iNOS)・インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ (IDO) を発現してCD8+ T細胞機能を抑制する (Wu et al. 2022)。さらにMDSCはPD-1・TIM-3・LAG-3などの抑制受容体の発現を誘導してT細胞疲弊を促し、PD-L1・Galectin-9 (Gal-9) を発現してT細胞の阻害を増幅する (Antonios et al. 2017)。こうしたMDSCを介した免疫抑制機構はICIの有効性を制限する重要因子であり、MDSC標的化が免疫療法耐性克服の戦略として注目されている (Pico de Coaña et al. 2013)。
双参顆粒 (Shuangshen granules, SSG) は中国伝統医学 (TCM) の処方であり、Panax quinquefolium (西洋ニンジン)・Panax notoginseng (田七ニンジン)・Cordyceps sinensis (冬虫夏草) を1:6:1の重量比で配合したものである。Guang’anmen病院で開発され特許を取得 (特許番号: 201310091864.4) している。臨床的にはNSCLC患者の生活の質改善と生存期間延長の効果が示されており (Tomonaga et al. 2008; Zhou et al. 2008)、SSGが骨髄系細胞のMDSC分化を阻害して肺がん転移を抑制するという先行研究もある (Wei et al. 2021)。しかし、SSGがMDSC依存性T細胞疲弊に与える影響と、抗PD-1療法との相互作用の分子機序は十分に解明されておらず、この知識のギャップを埋めることが、SSGのより広範な臨床応用を促進するために不足していた。
目的
本研究は、双参顆粒 (SSG) が肺腺がん (LUAD) モデルにおいて腫瘍増殖、骨髄由来抑制細胞 (MDSC) の機能、T細胞疲弊、および腫瘍免疫微小環境に与える影響を詳細に評価することを目的とした。さらに、SSGと抗PD-1療法の併用による相乗的な抗腫瘍免疫機序を、ネットワーク薬理学的手法と分子ドッキングを用いて解析し、その予測されるメカニズムを分子生物学的に検証することも目的とした。これにより、SSGがMDSC誘発T細胞疲弊を軽減し、抗PD-1療法の有効性を増強する新たなメカニズム的洞察と、伝統中国医学 (TCM) と現代免疫療法の組み合わせに対する臨床的意義を提供することを目指した。
結果
SSGは用量依存的にLLC腫瘍増殖を抑制する: Lewis肺がん (LLC) 同種移植マウスモデルにおいて、SSG治療は腫瘍増殖を用量依存的に有意に抑制した。高用量SSG (54 mg/day) は21日間の治療で最も強力な腫瘍増殖抑制を示し、対照群と比較して腫瘍体積 (p<0.0001) および腫瘍重量 (p<0.01) が著明に減少した (Figure 2A-C)。IHC解析では、高用量SSG群の腫瘍組織において、血管新生マーカーCD34と増殖マーカーKi-67の発現が対照群と比較して著明に低下した (Figure 2F)。治療期間中、SSG投与群のn=5 miceは安定した体重を維持し、対照群との間に有意な体重差は認められなかった (Figure 2D)。これらの結果から、SSGはin vivoで抗腫瘍効果を発揮し、高用量SSGが腫瘍増殖と細胞増殖抑制に最も効果的であることが示されたため、以降の実験では高用量SSGを採用した。
SSG+抗PD-1の組み合わせが最強の腫瘍抑制効果を発揮する: SSGと抗PD-1抗体の併用療法は、SSG単独または抗PD-1単独のいずれと比較しても、有意に優れた腫瘍増殖抑制効果を示した (Figure 3A-C)。実験終了時、SSG+抗PD-1併用群は全n=8 mice群中で最も小さい腫瘍体積を示した (対照群と比較してp<0.0001)。IHC解析では、SSG+抗PD-1群でCD34およびKi-67の発現が最も低下した (Figure 3F)。さらに、腫瘍浸潤リンパ球におけるT細胞疲弊マーカー (PD-1、TIM-3、CTLA-4、LAG-3) の発現も、併用群で最も低値であった (Figure 3F)。H&E染色では、併用群の腫瘍細胞がより均一で規則的な形態を示した (Figure 3E)。これらのデータは、SSGが抗PD-1免疫療法の効果を増強し、単独療法よりも強力な腫瘍増殖抑制とより良好な腫瘍免疫微小環境をもたらすことを示唆する。
SSGはT細胞疲弊を軽減しTh1型サイトカイン産生を増強する: フローサイトメトリー解析により、SSG治療マウスの脾臓におけるCD8+ T細胞の割合が有意に増加した (対照群と比較してp<0.001) (Figure 4A)。SSG+抗PD-1併用群では、脾臓CD8+ T細胞上のPD-1およびTIM-3発現が、SSG単独または抗PD-1単独療法と比較して著明に低値であった (PD-1でp<0.01、TIM-3でp<0.001) (Figure 4B)。免疫蛍光染色でも、腫瘍浸潤PD-1+T細胞が併用群で著明に減少した (Figure 5A)。血清中のIL-2、TNF-α、IFN-γ濃度は、SSGおよびSSG+抗PD-1群で対照群よりも高値を示し、併用療法群で最も高いサイトカインレベルが検出された (IL-2でp<0.01、TNF-αでp<0.01、IFN-γでp<0.001) (Figure 4D)。これらの結果は、SSGがCD8+ T細胞プールの拡大、T細胞疲弊の軽減、および炎症性サイトカイン環境の促進により、in vivoで抗腫瘍免疫を増強することを示唆する。
SSGはMDSCの蓄積と免疫抑制機能を両面から抑制する: SSG治療により、脾臓における骨髄由来抑制細胞 (MDSC) (CD11b+Gr-1+細胞) の割合が対照群と比較して有意に低下した (p<0.05) (Figure 6A)。残存MDSCにおける免疫抑制エフェクター (アルギナーゼ1 (Arg-1)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ (IDO)、誘導型一酸化窒素合成酵素 (iNOS)) の発現はSSGによって低下し、SSG+抗PD-1併用群で最も低値となった (Figure 6C)。また、MDSC表面のPD-L1およびGalectin-9 (Gal-9) の発現もSSGによって有意に低下し、併用群で最も顕著な減少が認められた (PD-L1およびGal-9のMFI値でそれぞれp<0.01、p<0.001) (Figure 6B)。酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA) 測定では、血清中の免疫抑制サイトカインIL-10およびTGF-βが、SSG+抗PD-1併用群で最低値まで正常化された (IL-10でp<0.05、TGF-βでp<0.01) (Figure 6E)。 In vitro実験でも同様に、SSG含有ラット血清で処理したMDSC (n=8 replicates) は、Arg-1、IDO、iNOS、PD-L1、Gal-9の発現が低下し (Figure 8B, C)、IL-10およびTGF-β分泌が有意に減少した (p<0.0001) (Figure 8D)。SSG処理MDSCと共培養したCD8+ T細胞では、PD-1およびTIM-3発現の低下 (PD-1でp<0.05、TIM-3でp<0.01)、IL-2、IFN-γ、TNF-α産生の増加 (IL-2でp<0.05、IFN-γでp<0.0001、TNF-αでp<0.0001)、アポトーシス率の低下 (p<0.01)、およびCFSE希釈法による増殖能の向上が確認された (p<0.001) (Figure 9B, D, E, F)。これらのin vitro所見は、SSGがMDSC誘発T細胞抑制を軽減し、T細胞の増殖能力と生存を回復させることを示している。
ネットワーク薬理学でPI3K-Akt経路がSSGの主要機序として同定される: SSGの活性化合物 (Ginsenoside Rg1, Rb1, Rd, Notoginsenoside R1) の標的、免疫関連遺伝子、および肺腺がん (LUAD) 関連遺伝子の共通標的として11個の遺伝子が特定された (Figure 10A)。KEGG経路解析では、これらの共通標的がPI3K-Akt経路、HIF-1経路、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬耐性、および腫瘍におけるPD-L1発現とPD-1チェックポイント経路に高度に濃縮されていることが示された (Figure 10C)。タンパク質-タンパク質相互作用 (PPI) 解析から、IL2、STAT3、HSP90AA1、LGALS3、FGF2の5つのハブ標的が選定された (Figure 10E)。分子ドッキングシミュレーションでは、Ginsenoside Rg1がLGALS3に-7.0 kcal/molの結合自由エネルギーで強く結合すると予測された (Figure 10F)。ウェスタンブロットによる検証では、SSG含有血清処理群でHSP90AA1、LGALS3、FGF2タンパク質発現、およびp-PI3K、p-Aktのリン酸化レベルが有意に低下し (HSP90AA1でp<0.05、LGALS3でp<0.05、FGF2でp<0.05、p-PI3Kでp<0.05、p-Aktでp<0.01)、PI3K-Akt経路の抑制が確認された (Figure 11B, C)。これらの結果は、PI3K-Akt経路がSSGの免疫調節効果を媒介する潜在的なメカニズムであることを強く示唆する。
考察/結論
本研究は、中医薬処方SSGが肺腺がんモデルにおいて骨髄由来抑制細胞 (MDSC) を介したT細胞疲弊を抑制し、抗PD-1との相乗的抗腫瘍効果を発揮することを、in vivo、in vitro、ネットワーク薬理学の多角的手法で示した。
先行研究との違い: 先行研究ではSSGが非小細胞肺がん (NSCLC) 患者の生存を改善することの臨床的証拠と、MDSCの分化阻害による転移抑制が示されていた (Wei et al. 2021)。本研究はこれを発展させ、SSGがMDSCの「数」だけでなく「機能」(アルギナーゼ1 (Arg-1)・インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ (IDO)・誘導型一酸化窒素合成酵素 (iNOS)・PD-L1・Galectin-9 (Gal-9) の発現) を抑制し、結果的にT細胞疲弊を直接逆転させることを初めて系統的に示した点で、これまでの報告と異なる。
新規性: 本研究で初めて、SSGと抗PD-1療法の相乗効果を実証し、ネットワーク薬理学と分子ドッキングによるPI3K-Akt経路を中心とした分子メカニズムを提示したことは新規性がある。PI3K-Akt経路がMDSC機能、CD8+ T細胞浸潤、およびTCF-1+前駆疲弊T細胞 (Tpex) 産生の調節に関与するという背景知識と整合する結果である (Shi et al. 2021; Tian et al. 2023)。
臨床応用: MDSCの血中高値がNSCLCのICI低応答を予測することは先行研究で示されており (Koh et al. 2020)、SSGがMDSC数と機能を同時に抑制する本知見は、SSGがICI効果予測のバイオマーカー (MDSC頻度) を低下させることで治療層別化にも貢献しうることを示唆する。中医薬とICIの組み合わせという新たな統合医療戦略の科学的根拠として意義が大きく、臨床試験への展開が期待される。これらの知見は、肺腺がん治療におけるSSGの臨床応用を促進する可能性を秘めている。
残された課題: 今後の検討課題として、LLC同種移植モデルはヒト肺腺がん (LUAD) の不均一性を十分に再現できないため、患者由来異種移植 (PDX) モデルおよび3Dオルガノイド系での検証が必要である。高用量SSGによるわずかな体重減少の原因解明と、長期・高用量暴露の安全性評価が必要である。骨髄由来in vitro誘導MDSCと腫瘍浸潤MDSCの機能的差異、SSGのPI3K-Akt経路抑制とMDSC機能・T細胞疲弊軽減の因果関係の直接的検証、多成分処方における個々の有効成分の役割解明なども今後の重要課題として挙げられている。
方法
動物実験： 雄C57BL/6Jマウス (4-5週齢) にLewis肺がん (LLC) 細胞 (5×10^6 cells、100 μL PBS中) を皮下接種し、腫瘍モデルを確立した。SSG用量最適化実験では、腫瘍担持マウスを4群 (対照・低用量18 mg/day・中用量36 mg/day・高用量54 mg/day、各n=5 mice) に無作為に分け、21日間経口投与した。SSGの低用量は、ヒト換算用量 (成人70 kgあたり約6 g) に基づき、体表面積換算係数 (マウス:ヒト比9.01) を用いて約18.0 mg/dayと設定した。中用量と高用量はそれぞれ低用量の2倍 (36.0 mg/day) と3倍 (54.0 mg/day) とした。用量確定後、組み合わせ療法実験では、別のLLC腫瘍担持マウスを対照・SSG単独・抗PD-1単独・SSG+抗PD-1の4群 (各n=8 mice) に無作為に割り付けた。SSG群には最適用量のSSGを21日間毎日経口投与した。抗PD-1群には抗マウスPD-1抗体 (クローンRMP1-14、200 μg/回) を腫瘍接種7日後から1日おきに計7回腹腔内投与した。対照群には対応するスケジュールで水と生理食塩水を投与した。実験終了時 (21日目) に、腫瘍組織、末梢血、脾臓を採取し、その後の解析に供した。すべての動物実験は、広安門病院中国中医科学院動物倫理委員会 (承認番号: IACUC-GAMH-2022-011) の承認を得て実施された。
評価系： 腫瘍体積はノギスで測定し、腫瘍体積 = (長さ × 幅^2) / 2 の式で算出した。腫瘍組織は4%中性緩衝ホルマリンで固定後、パラフィン包埋し、H&E染色および免疫組織化学 (IHC) 染色 (CD34、Ki-67、PD-1、TIM-3、CTLA-4、LAG-3) を実施した。免疫蛍光染色では、CD3、PD-1、CD11b、PD-L1に対する一次抗体を使用し、Alexa Fluor標識二次抗体とDAPIで核を対比染色した。フローサイトメトリーにより、脾臓細胞中の骨髄由来抑制細胞 (MDSC) (CD11b+Gr-1+細胞) およびT細胞 (CD3+CD8+細胞) の割合と、T細胞疲弊マーカー (PD-1、TIM-3、CTLA-4、BTLA、LAG-3) の発現を解析した。ウェスタンブロット法により、アルギナーゼ1 (Arg-1)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ (IDO)、誘導型一酸化窒素合成酵素 (iNOS)、PD-L1、Galectin-9 (Gal-9)、IL2、STAT3、HSP90AA1、LGALS3、FGF2、p-PI3K、p-Aktなどのタンパク質発現レベルを測定した。酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA) により、血清および細胞培養上清中のIL-10、TGF-β、IL-2、TNF-α、IFN-γ濃度を測定した。RT-qPCRにより、IL-2、IFN-γ、TNF-αのmRNA発現レベルを定量した。MDSCは、GM-CSF (100 ng/mL) とIL-6 (100 ng/mL) 刺激によりマウス骨髄細胞からin vitroで誘導し、純度98%以上であることを確認した。in vitro実験では、SSG含有ラット血清 (62.5 mg/kgを7日間経口投与したラットから採取) をMDSC処理に使用した。CD8+ T細胞はMACSxpress法で脾臓から単離し、TranswellシステムでMDSCと共培養した。CD8+ T細胞の増殖能はCFSE希釈法で、アポトーシスはAnnexin V-FITC/PI染色で評価した。
ネットワーク薬理学・分子ドッキング： SSGの主要ジンセノサイド (Rg1、Rb1、Rd、Notoginsenoside R1) のSMILES構造をPubChemデータベースから取得し、Swiss Target Prediction、Targetnet、SEAデータベースを用いて標的を予測した。免疫関連遺伝子はImmPortデータベースから、肺腺がん (LUAD) 関連遺伝子はOMIMおよびGeneCardsデータベースから収集した。これらの共通標的をVenny 2.1.0で特定し、Cytoscape v3.7.1を用いて薬物-標的-疾患ネットワークを構築した。共通標的のタンパク質-タンパク質相互作用 (PPI) ネットワークはSTRINGデータベース (信頼度スコア0.15) を用いて構築し、degreeアルゴリズムにより上位5つのハブ遺伝子 (IL2、STAT3、HSP90AA1、LGALS3、FGF2) を選定した。Gene Ontology (GO) およびKEGG経路解析を実施し、生物学的機能と経路の濃縮を評価した。分子ドッキングは、AutoDock Vina v1.5.6を用いて、主要活性化合物とハブ標的タンパク質の間で実施し、結合自由エネルギーが最も低い結合ポーズを解析した。
統計解析： 正規性と分散の均一性を評価した後、正規分布するデータは平均 ± 標準偏差で表し、一元配置分散分析 (ANOVA) とFalse Discovery Rateテストによる事後比較で解析した。非正規分布データは中央値 (四分位範囲) で表し、Kruskal-Wallis検定とDunnの事後比較で解析した。すべての統計解析はGraphPad Prism 8.0を用いて行い、両側p値<0.05を有意差ありとした。