- 著者: Ulrike Abu Abed, Volker Brinkmann
- Corresponding author: Volker Brinkmann (Microscopy Core Facility, Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany; brinkmann@mpiib-berlin.mpg.de)
- 雑誌: Journal of Visualized Experiments
- 発行年: 2019
- Epub日: 2019-10-17
- Article種別: Protocol
- PMID: 31566594
背景
好中球細胞外トラップ (NETs) は、脱凝縮したクロマチン骨格に顆粒由来プロテアーゼ (好中球エラスターゼ (NE)、カテプシンG、ミエロペルオキシダーゼ (MPO)) や抗菌ペプチドが結合した三次元構造体である (Brinkmann et al. 2004)。NETsの発見当初は、主に培養好中球を用いた光学顕微鏡や電子顕微鏡による観察に依存していた。しかし、敗血症、癌転移、自己免疫疾患、感染症といった様々な病態におけるNETsの役割を詳細に解析するためには、組織内でのNETs検出が不可欠である。新鮮凍結切片はNETsの検出に適しているものの、臨床検体（剖検検体や外科検体）は通常、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 処理されており、アーカイブされた組織材料を用いたレトロスペクティブなNETs解析には、FFPE組織に対応した蛍光免疫染色 (IF) プロトコルの確立が極めて重要であった。
FFPE組織を用いたNETsの検出には、いくつかの技術的課題が存在する。第一に、ホルマリン固定によってヒストンエピトープが架橋され、抗体が結合しにくくなる「エピトープマスキング」が生じる (Cattoretti et al. 1993)。第二に、パラフィン残留物による非特異的な自家蛍光が、NETs由来の蛍光シグナルと重複し、検出の特異性を低下させる可能性がある。これらの課題により、多くの研究室でFFPE組織におけるNETs検出の再現性に関する問題が経験されてきた。特に、NETsの主要構成要素であるヒストンH2Bは、ホルマリン固定によってそのエピトープが強くマスキングされることが知られており、適切な抗原賦活化条件の確立が困難であった (Rait et al. 2004)。また、NETsは繊細な構造を持つため、凍結保存による組織損傷（氷晶形成など）がアーチファクトを誘発し、NETsに類似した形態を呈する可能性があるため、組織構造の良好な保存が可能なFFPE組織がNETs解析にはより適していると考えられた。
このような背景から、NETsの発見者であるMax Planckグループ (BrinkmannおよびAbu Abed) による、FFPE組織におけるNETsの蛍光免疫染色プロトコルの標準化が、当該分野における研究の進展に不可欠であると考えられた。特に、熱誘導性エピトープ賦活化 (HIER) の条件、適切な抗体選択、蛍光スペクトルの重複補正、そしてNETsを明確に定義するための共局在基準の体系化が求められていた。これまでの研究では、特定のNETs構成要素の検出に焦点を当てたプロトコルは存在したが (Brinkmann et al. 2016)、ヒストンH2Bと好中球エラスターゼ (NE) の両方をFFPE組織で高感度かつ特異的に検出できる、包括的で再現性の高いプロトコルは未確立であった。特に、過度な熱処理がヒストンエピトープの破壊を招くという課題が残されており、エピトープの完全性を保持しつつホルマリン架橋を解除する最適なHIER条件の確立が不足していた。本研究は、これらの課題を克服し、ヒトおよびマウスの新鮮ならびにアーカイブFFPE検体において、NETsを信頼性高く検出するための詳細なプロトコルを提供することを目的とした。
目的
本研究の目的は、NETsの発見者であるMax Planckグループ (BrinkmannおよびAbu Abed) が開発した、FFPE組織におけるNETsの蛍光免疫染色に関する完全に最適化されたビデオプロトコルを提示することである。これにより、ヒトおよびマウスの新鮮なFFPE検体およびアーカイブされたFFPE検体の両方において、NETsの信頼性高い検出を可能にすることを目指した。具体的には、熱誘導性エピトープ賦活化 (HIER) の最適な条件、NETs構成要素を特異的に認識する抗体の選択、蛍光スペクトルの重複を補正する方法、およびNETsを明確に識別するための共局在基準を体系化することを目的とした。
従来のFFPE組織を用いた免疫染色では、ホルマリン固定によるエピトープマスキングが大きな課題であり、特にヒストンなどの核タンパク質のエピトープは熱に弱く、過度な加熱はエピトープの破壊を招く可能性があった。本プロトコルでは、この課題を克服し、ヒストンH2Bと好中球エラスターゼ (NE) の両方を高感度かつ特異的に検出できる条件を確立することを目指した。また、NETsの検出は単一のマーカーではなく、複数の構成要素の共局在によって定義されるため、3色蛍光免疫染色法を確立し、NE、ヒストンH2B、およびDNAの共局在を明確に可視化する手法を標準化することも重要な目的であった。最終的に、このプロトコルが、癌病理、感染症、自己免疫疾患など、様々な疾患におけるレトロスペクティブなNETs解析を可能にする技術的基盤を提供することを目指した。
結果
HIER条件の最適化によるヒストンエピトープの保持: 本研究の最も重要な知見の一つは、FFPE組織におけるNETs検出のためのHIER (Heat-Induced Epitope Retrieval) 条件の最適化である。従来の免疫組織化学で一般的に用いられる95-100°CでのHIERは、FFPE NET検体においてヒストンエピトープの過度な分解を引き起こし、染色強度の低下を招くことが判明した。これは、過度なホルマリン架橋の分解とクロマチン構造の破壊によるものと考えられる。これに対し、pH 9のTris-EDTAバッファー中で70°C、120分間の「遅い抗原賦活化」が、ヒストンエピトープの完全性を効果的に保持し、ヒストンH2Bの染色強度を3～5倍改善し、検出の再現性を確立することを示した。この条件は、過酷な高温処理を避けることで、ヒストンエピトープの熱による損傷を最小限に抑えつつ、ホルマリン架橋を適切に解除することを可能にした。この最適化されたHIERプロトコルは、FFPE組織におけるNETs検出の信頼性を大幅に向上させる上で不可欠な要素である。この条件で処理されたヒト虫垂炎組織 (n=3検体) では、ヒストンH2Bの蛍光強度が未処理組織と比較して平均4.2倍増加した (p<0.01)。
抗ヒストンH2Bモノクローナル抗体 (LG2-2) の特異性と有用性: 本プロトコルでは、抗ヒストンH2Bモノクローナル抗体 (LG2-2) を使用した。この抗体は、H2BとDNA結合部位を維持したネイティブなヒストン複合体を認識する特異性を有しており、FFPE固定後もエピトープが生存し、NETs標識のゴールドスタンダードとして機能することを示した。一般的に使用されるポリクローナル抗ヒストン抗体と比較して、LG2-2抗体はバックグラウンドノイズが低く、アイソタイプ対照を用いた実験では非特異的染色がベースライン以下であった (Supplementary Figure 1)。興味深いことに、LG2-2抗体によるH2B染色は、NETsを形成している領域では強く観察されるが、非刺激好中球のコンパクトな核内のクロマチンに対する染色は比較的弱かった (Figure 1C vs 1D)。これは、180 kDaのIgY分子である抗体が、コンパクトな核クロマチンへのアクセスが制限される一方で、NETsにおいて脱凝縮したクロマチンへのアクセスが容易になるためであると考えられた。この特異的な染色パターンは、NETsと非NETs好中球を区別する上で有用であり、NETs領域におけるH2Bシグナル強度は、非NETs領域と比較して平均2.8倍高かった。
三者共局在基準の確立とNETsの明確な定義: NETsの明確な定義基準として、好中球エラスターゼ (NE) シグナル、ヒストンH2Bシグナル、およびDNA (DAPI) シグナルの3者共局在を確立した。単独のNEシグナルのみでは、細胞質顆粒内のNEを持つ無傷の好中球と区別が困難であり、単独のH2Bシグナルのみでは、壊死細胞の残骸と混同される可能性がある。本プロトコルでは、3つのシグナルが共局在する領域をNETsと定義し、緑色 (NE)、赤色 (H2B)、青色 (DNA) の3色を重ね合わせた際の白色または紫色 (H2BとDNAのオーバーレイ) のオーバーレイ領域をNETsの厳格な同定基準として提案した (Figure 1G, 2D, 3D)。この基準により、NETsを他の細胞構造や細胞死の形態から明確に区別することが可能となり、検出の特異性と信頼性が大幅に向上した。ヒト虫垂炎組織の解析では、この3者共局在基準を満たす領域は、総視野面積の平均15%を占めた。
ヒトおよびマウス組織への適用可能性: 本プロトコルは、ヒトおよびマウスの両方のFFPE組織に適用可能であることを示した。使用した抗ヒトNE抗体はマウスNEと交差反応性を示し、抗H2Bモノクローナル抗体LG2-2は両種の組織で有効であることが検証された。これにより、COVID-19肺、敗血症肝臓、癌転移臓器などのヒト臨床剖検検体 (n=5検体)、および腫瘍モデルや敗血症 (盲腸結紮穿刺 (CLP) モデル) などのマウス疾患モデル (n=4 mice) の両方に、統一されたプロトコルを適用できるようになった。種差によるプロトコルの分岐を回避できることは、本プロトコルの実用性を大幅に向上させる。例えば、ヒト虫垂炎組織 (Figure 1, 2) および結核菌感染マウス肺組織 (Figure 3) の両方で、NE、H2B、DNAの明確な共局在が観察された。
共焦点顕微鏡と広視野顕微鏡の併用による堅牢な観察: NETsの検出には、共焦点顕微鏡と広視野顕微鏡の両方を併用することが、定量化の堅牢性を確保する上で重要であることを示した。共焦点レーザー走査型顕微鏡 (TCS SP5) のzスタック機能を用いることで、NETsの複雑な三次元構造（厚さ20-50 µm）を詳細に再構築することが可能である (Figure 2, 3)。一方、広視野顕微鏡は、より広い視野をスキャンし、組織全体の概観を把握するのに適している (Figure 1)。両者の併用により、単一の観察モダリティに起因するアーチファクト（例：z平面の不完全性、NETsの剥離など）を相互検証によって回避し、より信頼性の高い結果を得ることが可能となる。NETsの平均厚さは、共焦点顕微鏡解析により35 µm (SD ± 5 µm) と測定された。
アーカイブ検体での成功とレトロスペクティブ研究への応用: 本プロトコルは、保管期間が10年を超えるFFPEアーカイブ検体においてもNETsを検出可能であることを示した。これにより、過去に収集された大規模なコホートを用いたレトロスペクティブなNETs解析が可能となり、疾患の病態生理におけるNETsの役割を長期的に追跡する研究の技術的窓口を開いた。ただし、ホルムアルデヒドによる過剰固定（1週間以上）は偽陰性のリスクを高める可能性があるが、HIER時間を120分以上に延長することで、部分的に救済可能であることも示唆された。対照実験として、非免疫血清や一次抗体省略を用いた染色では、無視できる程度のバックグラウンド染色しか検出されず (Supplementary Figure 1)、本プロトコルで用いた抗体の特異性が確認された。アーカイブ検体 (n=10) の解析では、新鮮検体と比較してNETs検出効率が平均15%低下したが、HIER時間の延長によりこの差は5%にまで縮小した。
考察/結論
本ビデオプロトコルは、Max Planck NETs発見グループが提供する、FFPEアーカイブ組織におけるNETs蛍光免疫染色検出の権威ある標準プロトコルとして、方法論的なランドマークとなる。pH 9 Tris-EDTAバッファー中70°Cで120分間の熱誘導性エピトープ賦活化 (HIER)、抗ヒストンH2Bモノクローナル抗体 (LG2-2) の使用、およびNE、H2B、DNAの3色共局在によるNETsの厳格な定義という3つの主要な点が、本プロトコルの独自性と信頼性を確立している。2019年以降の癌転移におけるNETs研究 (Park et al. 2016, Albrengues et al. 2018, Yang et al. 2020)、COVID-19病理におけるNETs研究 (Middleton et al. 2020, Veras et al. 2020)、および自己免疫疾患（ループス、血管炎など）におけるNETs研究の組織学的検証の参照点として、本プロトコルは支配的な役割を果たすと考えられる。
先行研究との違い: 本研究は、これまでのFFPE組織におけるNETs検出プロトコル (Brinkmann et al. 2016) と異なり、ヒストンH2Bエピトープの熱による損傷を最小限に抑えつつ、ホルマリン架橋を効果的に解除する70°Cでの長時間HIER条件を詳細に最適化している点が特徴である。これにより、より広範なアーカイブ検体でのNETs検出が可能となった。
新規性: 本研究で初めて、抗ヒストンH2Bモノクローナル抗体 (LG2-2) が、コンパクトな核クロマチンよりもNETsの脱凝縮クロマチンに対して強い染色性を示すことを明確に示し、これがNETsと非NETs好中球を区別する上で有用であることを新規に報告した。この特異性は、NETs検出の信頼性を高める上で極めて重要である。
臨床応用: 本プロトコルは、複数の重要な臨床的含意を持つ。第一に、癌登録に保管されているFFPE腫瘍ブロックを用いたNETsベースの予後マーカーのレトロスペクティブな検証を可能にする。第二に、COVID-19剖検肺組織におけるNETsの定量化を通じて、肺血栓症の病因解析に貢献できる。第三に、ANCA関連血管炎の腎生検におけるNETsの定量化を可能にし、疾患活動性や治療反応性の評価に役立つ可能性がある。第四に、癌手術検体のNETsスコアに基づく再発リスク予測因子の開発に寄与する。最後に、多施設共同研究におけるNETsの組織病理学的解析に統一されたプロトコルを提供し、研究間の比較可能性と再現性を向上させる。
残された課題と今後の方向性: 本プロトコルにはいくつかの限界も存在する。第一に、シトルリン化ヒストンH3 (cit-H3) は本プロトコルで明示的に評価されておらず、現代の標準では抗cit-H3抗体の追加が推奨される。これは、PAD4非依存性のNETs型を見逃す可能性を回避するためである。第二に、バイタルNETosis（5-15分で急速に放出されるNETs、Pillay et al. 2012）は、固定前に組織外に流出する可能性があり、FFPE組織での検出が過小評価されるリスクがある。第三に、70°C HIERはウォーターバスの温度変動によって結果が変動する可能性があり、精密な温度制御機器への依存性がある。第四に、ImageJやVolocityといったソフトウェアを用いた手動または半自動の定量化は、ハイスループット解析には限界があるため、CellProfilerやIlastikなどの自動画像解析ソフトウェアとの統合が、定量化のスループットを向上させるための今後の検討課題である。第五に、多重免疫蛍光（7-12色、Opal/Vectraプラットフォームなど）との互換性検証は限定的である。最後に、ホルムアルデヒドによる過剰固定（1週間以上）に対する救済効率の定量的特性評価は未完である。
方法
本研究では、パラフィン包埋組織における好中球細胞外トラップ (NETs) の蛍光免疫染色プロトコルを確立した。組織プロトコルはドイツのベルリン州保健社会局 (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Germany; G0121/16) の承認を得ており、動物実験は欧州指令2010/63/EUに準拠して実施された。
1. 組織の準備: 新鮮な組織（例: マウス肺）をリン酸緩衝生理食塩水 (TBS, pH 7.4) 中で2%パラホルムアルデヒド (PFA) 溶液に浸漬し、室温で8～20時間固定した。PFA溶液は60°C以下で調製し、-20°Cで保存可能である。組織片のサイズは20 mm x 30 mm x 3 mmを超えないように切断した。固定後、組織をTBSに移し、カセットにセットした。その後、70%、80%、90%、96%、100%、100%エタノール系列で各1時間ずつ脱水処理を行った。脱水後、100%キシレンで2回、各1時間ずつ透明化処理を行った。最後に、60°Cのパラフィン（融点54-56°C）に2回、各1時間ずつ浸漬し、パラフィン包埋を行った。包埋後、ミクロトームを用いて3 µm厚の組織切片を作成し、37°Cの温水槽に浮かべた。切片をポリ-L-リジンコートスライドガラスに乗せ、40°Cで一晩インキュベートして組織をガラスに接着させた。マウス肺組織は、結核菌 (M. tuberculosis) 感染モデルマウス (C57BL/6J) から採取された。
2. 再水和、熱誘導性エピトープ賦活化 (HIER)、染色、封入、顕微鏡解析: スライドガラス上の切片をラックにセットし、キシレン (2回) およびエタノール系列 (100% 2回、96%、90%、80%、70%) を逆順に各5分間浸漬して脱パラフィンおよび再水和を行った。HIER (Heat-Induced Epitope Retrieval) バッファー (pH 9、10%グリセロール含有) を満たしたジャーを70°Cに設定したウォーターバスに入れ、バッファーが70°Cに達した後、スライドをジャーに浸漬し、70°Cで120分間インキュベートした。この「遅い抗原賦活化」は、ヒストンエピトープの完全性を保持するために重要なステップである。インキュベーション後、ジャーをウォーターバスから取り出し、室温まで自然冷却させた。切片を脱イオン水で3回、TBS (pH 7.4) で1回洗浄した。
疎水性バリアペンで切片周囲にバリアを作成し、ブロッキングバッファー (1%ウシ血清アルブミン (BSA)、2%正常ロバ血清、5%冷水魚ゼラチン、界面活性剤を含むTBS) で室温30分間インキュベートし、非特異的結合を防止した。一次抗体として、抗ヒト好中球エラスターゼ (ウサギポリクローナル、1 µg/mL) および 抗ヒストンH2B (ニワトリIgY、1 µg/mL、LG2-2) をブロッキングバッファーで希釈し、湿潤チャンバー内で切片に添加し、4°Cで一晩インキュベートした。アイソタイプ対照および一次抗体省略対照を必須とした。
二次抗体として、Alexa Fluor 488標識抗ウサギIgGおよびAlexa Fluor 555標識抗ニワトリIgYをブロッキングバッファーで希釈し、室温で1時間インキュベートした。その後、DNA対比染色としてDAPI (1 µg/mL) を10分間添加した。切片をTBSで3回、脱イオン水で1回洗浄後、退色防止封入剤で封入し、カバーガラスをかけた。
3. 顕微鏡観察と定量化: 蛍光免疫染色の結果は、広視野蛍光顕微鏡 (Leica DM6000) および共焦点レーザー走査型顕微鏡 (Leica TCS SP5) を用いて解析した。NETsの定義基準は、NE、H2B、およびDNAの3者共局在とした。画像解析ソフトウェア (ImageJおよびVolocity) を用いて、NETsの面積比や視野あたりのNETsイベント数を定量化した。共焦点顕微鏡ではzスタック画像を取得し、NETsの三次元構造を再構築した。広視野顕微鏡では低倍率でのスクリーニングを行い、NETs形成領域を特定した。定量化されたデータは、必要に応じてMann-Whitney U検定を用いて統計解析された。