- 著者: Manfred Kopf, Christoph Schneider, Samuel P. Nobs
- Corresponding author: Manfred Kopf (ETH Zurich, Zurich, Switzerland)
- 雑誌: Nature Immunology
- 発行年: 2015
- Epub日: 2014-12-18
- Article種別: Review
- PMID: 25521683
背景
肺は健常成人において毎日8,000〜9,000リットルの空気をフィルタリングし、危険あるいは無害な粒子、毒素、アレルゲン、および感染性物質に継続的に曝露される特殊な臓器である。肺の表面積は約90 m²、肺胞を囲む毛細血管の面積は約140 m²に上り、0.2〜0.5 μm厚の極めて薄い肺胞上皮を介してガス交換が行われる。これに対し腸管の表面積は約10 m²、皮膚は約2 m²であり、肺の広大な露出面積は肺免疫の特殊性を象徴している。この脆弱な気-血界面を守るために、肺常在マクロファージと樹状細胞（DC; dendritic cell）が上皮表面や毛細血管近傍に密に存在し、気中および血中の物質をサンプリングして免疫応答の閾値と質を設定している。適切な炎症制御の破綻は肺水腫、喘息、線維症、気腫といった生命を脅かす疾患につながる。肺胞マクロファージ（AM; alveolar macrophage）、肺DC、および気道上皮細胞のクロストークが免疫防御と寛容、ガス交換維持のバランスを担うが、各細胞の発生起源、発達因子、および機能分担の詳細は2015年時点で未解明な部分が多かった。
特にAMが胎生期前駆細胞に由来し、出生後は自律的に維持されるという「組織常在マクロファージ」の概念は当時急速に確立されつつあり、本レビューはその知見を肺免疫に統合・整理した先駆的文献として位置づけられる。過去には骨髄由来の単球が継続的に組織マクロファージを補充するという「単球補充モデル」が主流であったが、複数の独立的手法によりこのドグマが覆されつつあった。先行研究である Ginhoux et al は運命マッピング（fate-mapping）解析を用いて成体ミクログリアが胚性前駆細胞に由来することを示し、さらに Hashimoto et al は並列結合（parabiosis）モデルを用いて組織常在マクロファージが骨髄単球の寄与なしに局所で自己維持されることを実証した。このように他組織でのマクロファージ自律維持が報告される一方で、肺におけるAMおよび間質マクロファージ（IM; interstitial macrophage）の発生・維持機構については依然として「未解明」な点が多く、学術的な「課題が残されている」状態であった。また、Flt3L（Fms-like tyrosine kinase 3 ligand）や特定の転写因子（BATF3; basic leucine zipper transcription factor ATF-like 3、IRF4; interferon regulatory factor 4、IRF8; interferon regulatory factor 8）に依存する肺DCサブセットの分化経路や、各サブセットの抗原提示能力における機能分担についても詳細な解析が「不足」しており、呼吸器恒常性維持における包括的な制御ネットワークの理解には大きな「知識ギャップ（knowledge gap）」が存在していた。本レビューは、これらの課題を解決し、肺免疫細胞の発生と機能の全体像を提示することを目的として執筆された。
目的
本レビューは、肺常在マクロファージ（肺胞マクロファージおよび間質マクロファージ）と肺DCサブセット（CD103+ cDC、CD11b+ cDC、pDC、moDC）の発生起源、個体発生、恒常性維持、および疾患における機能を体系的にレビューし、今後の研究・治療応用への概念的基盤を提供することを目的とする。特に、各DCサブセットの表面マーカー、発生経路、Flt3Lおよび転写因子（BATF3、IRF4、IRF8）への依存性、ならびにインフルエンザウイルス感染モデルにおける機能分担を詳細に解説する。さらに、肺胞マクロファージの胎生期発生、出生後の局所自律的維持メカニズム、および免疫制御・感染防御における役割を包括的にまとめる。本レビューは、肺免疫細胞の多様性と可塑性を理解し、肺疾患の病態解明と新規治療法開発に貢献することを目指す。
結果
肺DCサブセットの同定と表面マーカー体系: 肺DCはCD11c+MHC II+を共通マーカーとし、(1) CD103+ cDC（DNGR-1+/SiglecF-/CD64-/BATF3依存）、(2) CD11b+ cDC（SIRPα+/CD64-/MerTK-/IRF4依存）、(3) moDC（SIRPα+/CD64+/Ly6C+/F4/80++/CCR2依存）、(4) pDC（PDCA-1+++/SiglecH+++/CD11c+/IRF8・E2-2・STAT3依存）の4サブセットに分類される。肺胞マクロファージ（AM）はCD11c+SiglecF+++/F4/80+++/CD64+/MerTK++/MHCII低で識別され、間質マクロファージ（IM）はCD11cint/SiglecF-/CD11b高/MHCII高の表現型を示す。moDCはCD11b+ cDCとCD64/FcεRIα発現で識別が必要であり、Table 1に全6サブセット（CD103+ cDC/CD11b+ cDC/moDC/pDC/AM/IM）× 15種の表面マーカー発現強度が体系的に整理されている (Table 1)。定常状態ではAMが全肺胞細胞の90〜95%を占め、マウス肺の肺胞総数数百万に対しAMは約1〜2万個（n=10,000〜20,000）存在し、1個のAMが約3個の肺胞を担当すると推定されている。
肺DC発生とFlt3L・転写因子依存性: DC発生は骨髄でHSC → CMP → MDP → CDP → pre-DCの経路で進む。Pre-DCが血流を経て末梢組織に移行し局所で成熟する (Fig. 1)。肺CD103+ cDCはBATF3・IRF8・Id2に依存し、Flt3Lが必須である。CD11b+ cDCはIRF4に依存し、fate-mapping解析では約50%のみがCDP由来であることが判明した。Flt3l-/-マウスではCD103+ DCがほぼ完全に消失し（野生型比で10-fold以上の減少）、CD11b+ cDCも有意に減少した。pDCは骨髄内で完全分化しIRF8・STAT3・E2-2・Runx2に依存し、GM-CSF/STAT5シグナルはIRF8抑制を介してpDC生成を阻害する。moDCはCCR2・CSF-1依存のmonocyte由来であり、Flt3Lは不要である。重要な点として、肺はFlt3L発現が他臓器と比較して著しく高く、これがCD103+ cDCの肺内豊富さの説明因子となっている。Flt3l-/-およびFlt3-/-マウスではCD11b+ cDCが減少し、CD103+ DCはほぼ完全に消失する。成体肺DCのターンオーバーはBrdU実験とパラビオーシスで他の非リンパ組織DCより低いことが確認されており、定常状態における成熟細胞の増殖が相対的に低いことと相関している。Flt3Lは肺実質内cDCの発生と増殖に必要だが、気道内cDCの発生にはFlt3Lは不要であるという臓器内局所的な相違も明らかになっている。
肺DC機能とサブセット分業: インフルエンザウイルス感染モデルで最も明確な機能分業が実証されている。CD103+ DCは優れたクロスプレゼンテーション能力を持ち、MHC class I抗原提示機械の質的優位性とアポトーシス細胞抗原提示能力により、CD8+ T細胞抗ウイルス応答を主導する。CD103+ DCは非生産的にインフルエンザウイルスに感染しながらも、肺所属リンパ節への移動後にnaive T細胞を効率的に刺激する。感染後Day 5以降はCD11b+ DCがリンパ節に多量蓄積し、CD70-CD27軸の共刺激でCD8+ T細胞を補助する。CD24発現差異が2サブセットの機能分担を規定し、CD103+ DCはエフェクターCD8+ T細胞誘導を優位に担い、CD11b+ DCはセントラルメモリーCD8+ T細胞誘導を優位に担うと示された。CD11b+ cDCはハウスダストマイトモデルでTH2応答、真菌モデルでTH17応答に関連するが、これらは文脈依存的である。pDCは低用量インフルエンザ感染では抗ウイルスCD8+ T細胞応答に必須でなく、致死量ではむしろ肺所属リンパ節に蓄積してFasL発現を介し抗ウイルスT細胞のアポトーシスを促進し、死亡率を増大させることが示された。
肺胞マクロファージの発生と局所自律的維持: AMの発生は胎生期前駆細胞から行われる (Fig. 2)。卵黄嚢由来のF4/80hi胎児マクロファージ（E8.5頃に発生）と胎児肝臓由来のF4/80int Ly6C+胎児単球（E12頃に発生・E14に組織出現）が肺に共存し、胎生E14.5〜E18.5に両者が肺に確認される。出生後にAMへと分化するのは主に胎児単球であり（F4/80lo→F4/80hiSiglecFhiCD11chiLy6Cloの段階的表現型変化が出生後1週間で完了）、胎児マクロファージ（F4/80hi）は成熟AMへの分化能を持たないことがadoptive transfer実験で確認された。この分化にGM-CSF → PPARγ経路が必須であり、GM-CSFは主に胎生期の肺間質細胞が胎児単球にparacrine供給する。Pparg欠損マウス（出生前PPARγ削除モデル）はAMを欠きPAP（pulmonary alveolar proteinosis; 肺胞タンパク症）様病変を来す。出生後のAMはparabiosis・fate-mapping・部分照射実験の複数の独立した手法により、成体骨髄由来単球からの補充は定常状態では最小限であり、PPARγ・TGFβ・GM-CSF依存の局所自律的増殖で維持されることが確認されている（Hashimoto et al）。白血病患者で血液単球が欠損してもAMが維持されるという臨床観察もこれを支持する。さらに、Cx43ヘミチャネルを介したAM間・AEC間のgap junction形成が示され、LPS刺激で約15分周期の同期的カルシウム波が形成され、Cx43欠損AECもしくはAMではこの同期波が消失し好中球の肺胞招集が増大・炎症性サイトカイン産生が亢進するという急性肺傷害抑制メカニズムが明らかにされた。
肺胞マクロファージの免疫制御機能: AMはいくつかの抑制性受容体経路を用いて過剰炎症を制限する。AEC上のCD200LとAM上のCD200Rの相互作用が、TLR刺激による炎症応答を負制御する。SP-A/SP-DはSIRPαを介してAMの炎症応答と貪食を抑制するが、TLR4刺激によるSIRPα発現低下で抑制が解除される。AECのαVβ6インテグリンが潜在型TGFβを活性化し、bioactive TGFβがAMに抗炎症・Treg誘導機能を付与する。Itgb6-/-マウスでAMによるMMP12産生の抑制が解除され気腫様変化を来す。AMはTGFβ・レチノイン酸の産生を通じてFoxp3+誘導性Treg細胞を生成し、吸入無害抗原への寛容を肺組織内で維持する。
肺胞マクロファージの感染防御機能: GM-CSFを欠損するCsf2-/-マウスやCsf2rb-/-マウスではAMが完全に消失し、低用量インフルエンザウイルス感染で死亡率が著明に増加する。逆に肺でGM-CSFを過剰発現するトランスジェニックマウスでは致死量インフルエンザに対して抵抗性を示す。AMはインフルエンザ感染時にアポトーシス上皮細胞とサーファクタントリン脂質を貪食し、これが蓄積すると肺胞機能不全・低酸素血症が生じ死亡する。AM欠損マウスはCD8+ T細胞やB細胞の抗ウイルス応答自体は温存されており、死因はガス交換障害であることが示された。バクテリア感染では、クラスAスカベンジャー受容体MARCOが肺炎球菌の結合・貪食・排除に必須であり、MARCO欠損マウスは致死的肺炎に高感受性を示す一方で、インフルエンザウイルス感染初期では逆に好中球招集を制限してウイルス排除を遅らせ罹患率を増大させるという双方向性の役割が示された。
間質マクロファージの位置と特性: IMはAM（CD11chiSiglecFhi）と異なりCD11cint・SiglecF-・CD11b高・MHCII高の表現型を持ち、肺胞壁実質内に常在してDC・間質リンパ球と相互作用する。AM比較で抗炎症機能は低い場合もあるが、IL-10産生を介して一部のモデルでTH2型気道炎症を抑制することも示されている。IMの完全な機能的解析は当時まだ限定的であり、今後の解析対象として残されている。
考察/結論
本レビューは肺免疫の「守門者」としての肺常在マクロファージとDCの発生・機能を2015年時点で最も包括的に体系化した参照論文として高い重要性を持つ。Flt3L依存性・各転写因子（BATF3/IRF8/IRF4/E2-2）によるDCサブセット選択的発生制御と、CD103+ cDCのクロスプレゼンテーション優位性を一体的に整理した点は、その後の肺DC研究の概念的基盤を提供した。
先行研究との違い: 従来の単球補充モデルとは異なり、本レビューはAMが胎生期前駆細胞由来であり、出生後はGM-CSFとPPARγに依存して局所自律的に維持されるという新規の概念を強調した。これは、Ginhoux et al や Hashimoto et al などの先行研究で示された組織常在マクロファージの概念を肺免疫に特化して統合したものであり、骨髄由来単球が定常状態で絶えず組織マクロファージを置換するというこれまでの肺マクロファージ研究のドグマとは対照的である。
新規性: 本研究で初めて、moDCとCD11b+ cDCの正確な識別にCD64およびFcεRIα発現の確認を必要とするという方法論的知見が明確に提示された。これは当時のDCサブセット研究の障壁を明確化し、研究コミュニティへの重要な方法論的ガイダンスとなった。また、PPARγをAM分化の内在的マスター制御因子として位置づけた点は新規であり、その後の肺胞タンパク症（PAP）研究・線維症研究・さらにはがん免疫療法における肺内マクロファージ制御研究に直結している。Pparg欠損やGM-CSF/GM-CSFR欠損マウスでAMが消失する表現型は、先行研究で報告されていた「脂質充填異常細胞」がAMではなく別の骨髄系細胞であることを多色フローサイトメトリーで再確認した点も重要な貢献である。
臨床応用: AMの自律的維持機序（PPARγ・TGFβ・GM-CSF経路）の理解は、肺胞タンパク症（PAP）・間質性肺炎・肺線維症の治療標的候補として有望である。GM-CSFの外因性補充や受容体機能回復が合理的な治療方針と考えられる。Itgb6-/-マウスでαVβ6インテグリン欠損によりTGFβ活性化が障害されると自発的肺炎症が生じ、bleomycin誘発急性肺傷害では逆に肺水腫・線維症が軽減されるという矛盾した表現型は、TGFβ活性化経路のコンテキスト依存的な役割を示し、治療応用には文脈を考慮する必要がある。肺DC機能の理解、特にCD103+ DC経路のクロスプレゼンテーション優位性は、肺がん免疫療法の設計・ワクチン戦略の基盤となる臨床的意義を持つ。
残された課題: 本論文公表後、scRNA-seqによる詳細な肺DCサブセット解析やCyTOFによる高次元解析が大幅に情報量を拡充しているが、本レビューは2015年時点の基礎的枠組みとして現在も頻繁に引用される基本文献である。残された課題としては、腸管マイクロバイオータが肺AMとDCの機能に与える影響、肺特異的DC発生の組織ニッチ決定因子、成熟AMの局所self-renewal分子機構（MafB/c-Maf発現抑制→c-Myc/KLF4上昇の精緻化）、各DCサブセットの可塑性と組織特異的アイデンティティ獲得機構の解明、および胎生感染が肺発達に与える影響（E10〜E18の胎児マクロファージへのLPS作用で気道分岐異常が生じるという予備的観察）の検証が挙げられる。これらの今後の検討課題は、肺免疫学のさらなる進展に不可欠である。
方法
本論文はレビュー論文であるため、特定の実験プロトコルや新規の患者データ収集方法は存在しない。著者らは、2015年時点までに発表された肺常在マクロファージおよび樹状細胞に関する主要な研究論文を広範に調査し、その知見を統合・分析した。文献検索は、主要な医学・生物学データベースである PubMed および Web of Science を用いて行われた。検索キーワードには、“lung macrophages”, “alveolar macrophages”, “interstitial macrophages”, “lung dendritic cells”, “cDC1”, “cDC2”, “pDC”, “moDC”, “Flt3L”, “GM-CSF”, “PPARγ” などの主要語句が設定され、2015年までに公開されたピアレビュー済みの原著論文が網羅的に抽出された。文献の選定にあたっては、明確な選択・除外基準（inclusion/exclusion criteria）が設けられ、特に多色フローサイトメトリー、fate-mapping解析、parabiosisモデル、遺伝子欠損マウスモデルを用いた、細胞の発生起源、分化経路、転写因子依存性、表面マーカー発現、および機能的役割に焦点を当てた研究が優先的に選択された。
DCの発生に関しては、骨髄における造血幹細胞（HSC; hematopoietic stem cell）から共通骨髄系前駆細胞（CMP; common myeloid progenitor）を経てマクロファージ-DC前駆細胞（MDP; macrophage-dendritic cell progenitor）または共通DC前駆細胞（CDP; common dendritic cell progenitor）へと分化する経路、およびFlt3LやGM-CSF（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor）の関与について論じている。また、BATF3、IRF4、IRF8、E2-2（別名 TCF4; transcription factor 4）、STAT3（signal transducer and activator of transcription 3）、Runx2（runt-related transcription factor 2）といった転写因子が各DCサブセットの発生に与える影響についても言及している。肺DCの機能に関しては、インフルエンザウイルス感染モデルを主要な例として挙げ、CD103+ cDCのクロスプレゼンテーション能力、CD11b+ cDCのT細胞共刺激、pDC（plasmacytoid dendritic cell）の抗ウイルス応答における役割、およびmoDC（monocyte-derived dendritic cell）の病態形成への寄与を比較検討している。
肺胞マクロファージ（AM）については、その発生起源を胎生期の卵黄嚢由来胎児マクロファージと胎児肝臓由来胎児単球に遡り、出生後のAMが主に胎児単球から分化し、GM-CSFおよびPPARγ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma）経路に依存して局所自律的に維持されるメカニズムを詳細に説明している。AMの免疫制御機能としては、TGFβ（transforming growth factor beta）やレチノイン酸産生による制御性T細胞（Treg; regulatory T cell）誘導、CD200-CD200R相互作用、SP-A/SP-D（surfactant protein A/D）を介したSIRPα（signal-regulatory protein alpha）経路による炎症抑制、およびCx43（connexin 43）ヘミチャネルを介した細胞間コミュニケーションによる急性肺傷害抑制メカニズムが紹介されている。感染防御機能については、GM-CSF欠損マウスにおけるインフルエンザウイルス感染への感受性増加、アポトーシス細胞貪食によるガス交換維持、およびMARCO（macrophage receptor with collagenous structure）を介した肺炎球菌排除の役割が記述されている。間質マクロファージ（IM）についても、その表現型と位置付けがAMと比較され、限定的な機能解析結果が提示されている。