- 著者: Viviana Piccolo, Alberto Curina, Marco Genua, Serena Ghisletti, Marta Simonatto, Arianna Sabò, Bruno Amati, Renato Ostuni, Gioacchino Natoli
- Corresponding author: Gioacchino Natoli (Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology (IEO), Milan, Italy)
- 雑誌: Nature immunology
- 発行年: 2017
- Epub日: 2017-03-13
- Article種別: Original Article
- PMID: 28288101
背景
マクロファージは、生体内の多様な微小環境シグナルに応答して、M1 (古典的活性化) およびM2 (代替活性化) と呼ばれる機能的に異なる極性化状態へと分化する。M1マクロファージはIFN-γ (インターフェロンガンマ) やLPS (リポ多糖) によって誘導され、抗細菌・抗腫瘍応答を担い、主にSTAT1 (Signal Transducer and Activator of Transcription 1) やNF-κB (Nuclear Factor-kappa B) 経路に依存することが知られている。一方、M2マクロファージはIL-4 (インターロイキン4) やIL-13 (インターロイキン13) によって誘導され、組織修復、寄生虫防御、腫瘍促進に関与し、STAT6 (Signal Transducer and Activator of Transcription 6) 経路に依存する。これらの極性化プログラムは互いに拮抗的であり、IFN-γがIL-4誘導性遺伝子を抑制し、IL-4がIFN-γ誘導性遺伝子を抑制することは古くから認識されていた (Murray et al. 2014; Sica & Mantovani 2012; Lawrence & Natoli 2011)。
しかし、両刺激が同時に存在する複雑な環境下において、STAT1とSTAT6の競合、エンハンサー動態、クロマチンアクセシビリティの変化といった分子基盤がゲノムワイドにどのように相互作用し、その結果としてマクロファージの機能がどのように制御されるのかは未解明な点が多かった。特に、マクロファージの活性化状態は、細胞が曝露される刺激の多様性と同様に多様であり、可逆的であるため、微小環境の変化に応じて状態が相互変換する可能性がある。さらに、マクロファージは複数の、しばしば相反する微小環境刺激に曝露され、その生物学に複雑な影響を与えることが示唆されている (Xue et al. 2014)。例えば、ウイルスや蠕虫などの病原体による同時感染では、IFN-γとIL-4の放出経路が同時に活性化され、これらの相反するプログラム間の相互作用が重要な生物学的結果をもたらすことが知られている。また、腫瘍や炎症の解消期においても、マクロファージは炎症促進シグナルと抗炎症シグナルの両方に共曝露され、M1とM2のプロファイルが同時に、かつ頻繁に共存することが報告されている (Ostuni et al. 2015)。これらの観察は、マクロファージ生物学への影響を理解するために、複数の環境シグナル間の関係を解明する必要性を強調している。
特に、腫瘍微小環境における腫瘍関連マクロファージ (TAM) はM2様性質を持つことが多く、その再極性化は腫瘍免疫療法における重要な課題であるため、M1/M2相互抑制機構の解明は臨床的にも喫緊の課題であると考えられた。先行研究では、刺激に応答して活性化される潜在的エンハンサーや、免疫細胞における危険シグナルや環境刺激の短期記憶、訓練免疫のプログラムなど、マクロファージのクロマチンリモデリングとエピジェネティックな制御に関する知見が蓄積されてきた (Ostuni et al. 2013; Monticelli & Natoli 2013; Netea et al. 2016)。しかし、これらの知見だけでは、IFN-γとIL-4のような対立するサイトカインが同時に存在する場合に、ゲノムワイドなエピジェネティックおよび転写レベルでどのように相互作用し、マクロファージの機能的運命を決定するのかというメカニズムは不足している点が多かった。
目的
本研究は、IFN-γ (M1誘導) およびIL-4 (M2誘導) 刺激下のマウス骨髄由来マクロファージ (BMDM) において、STAT1とSTAT6のゲノム結合動態、エンハンサーの活性化と抑制、および転写アウトプットをゲノムワイドかつ経時的に統合解析することを目的とした。これにより、M1とM2のシグナルが互いのエンハンサーレパートリーおよび遺伝子発現プログラムを抑制する分子機構を定量的に解明し、複雑な環境下でのマクロファージ活性化制御におけるシグナル統合のメカニズム的枠組みを提供することを目指した。具体的には、M1およびM2極性化プログラムが相互排他的であるか、いずれかのプログラムが優位であるか、そしてM1極性化刺激とM2極性化刺激間のクロストークの根底にあるメカニズムを明らかにすることを目指した。この研究は、マクロファージの可塑性と、複数の刺激に対する応答の複雑性を理解するための基礎的な知見を提供することを意図している。
結果
STAT1/STAT6のゲノム結合プロファイルと相互抑制: ChIP-seq解析により、IFN-γ刺激下のSTAT1は約14,576部位に結合し、IL-4刺激下のSTAT6は約23,306部位に結合することが明らかになった (Fig. 3a)。これらの結合部位のうち、約20% (約1,200部位) がSTAT1とSTAT6に共通であり、これらの共通結合部位がクロストークの中核領域として機能することが示唆された。IFN-γ刺激後のSTAT1結合は、IL-4の同時刺激によってもほとんど影響を受けなかった (Fig. 3b)。しかし、共通結合部位において、IFN-γ刺激後のSTAT1結合はIL-4の同時刺激によりSTAT6結合を顕著に低下させ (約70%減少、p<0.001)、逆にIL-4先行刺激ではSTAT6が先に占拠し、IFN-γ刺激後のSTAT1結合が減弱することが観察された。この競合はStat1-/- BMDM (n=3 replicates) では消失し、STAT1が直接STAT6結合を排除するメカニズムが示唆された。STAT1結合イベントとSTAT6結合イベントは、IL-4耐性遺伝子とIL-4感受性遺伝子の近傍で同様に頻繁に発生し、同時刺激によって影響を受けなかった。IL-4刺激下のBMDMでは23,306個のSTAT6ピークが閾値を超えて検出された (Fig. 3a)。IFN-γとの同時処理は、STAT6のクロマチンへの結合を減少させる傾向を示したが、IL-4誘導性結合は概ね維持された (Fig. 3c, d)。例えば、Ccl5およびRsad2-Cmpk2遺伝子座におけるIL-4との同時刺激によるIFN-γ誘導性ヒストンアセチル化の減少は、STAT1占有率の検出可能な変化とは関連していなかった (Fig. 3e)。Arg1遺伝子座では、IFN-γとの同時刺激によりSTAT6の動員がわずかに減少したが、検出可能なレベルであった (Fig. 3e)。STAT1ピークで有意に過剰に濃縮されたDNA配列にはGASモチーフとIRF結合モチーフの両方が含まれ、STAT1の動員が直接的なDNA結合とIRFを介したDNA結合の両方を介して起こることが示唆された。一方、STAT6ピークに関連するDNA配列には、典型的なSTAT6結合モチーフとIRFおよび/またはPU.1様モチーフが含まれていた。
エンハンサー活性化の相互抑制とH3K27acの変化: H3K27acとp300結合で定義されるエンハンサー活性は、IFN-γ単独刺激で約3,000、IL-4単独刺激で約2,000のエンハンサーが活性化された (Fig. 2a)。IFN-γとIL-4の同時刺激では、相互誘導エンハンサーの活性化が約40-60%抑制され (p<0.01)、片方のシグナルがもう片方のエンハンサーレパートリーを相互に抑制することが示された (Fig. 2b, c)。特に、IL-4で先に活性化されたM2エンハンサー (Arg1, Retnla, Mrc1周辺) にIFN-γを後追加すると、H3K27ac、p300、STAT6結合が減衰し、GRO-seqで測定されるnascent転写も低下した。この「先行活性化エンハンサーの後退」はSTAT1の直接結合とHDAC (ヒストン脱アセチル化酵素) の動員に依存することが示唆された。逆に、IFN-γで活性化したM1エンハンサー (Nos2, Cxcl9, Irf1周辺) にIL-4を後追加すると、STAT6が結合してSTAT1を排除し、H3K27acが低下した。IL-4によるIFN-γ応答の抑制は、2時間時点では検出されず、4時間時点でのみ検出された (Fig. 2b, c)。IFN-γによるIL-4誘導性ヒストンアセチル化の抑制は、刺激後2時間で既に最大であったのに対し、IL-4依存性のIFN-γ応答の抑制は4時間でのみ検出可能であった。これは、応答後期に作用する転写因子、例えばIFN-γによって発現が誘導される転写因子の関与を示唆している。IL-4とIFN-γの同時刺激により、Nos2遺伝子座のH3K27acレベルはIFN-γ単独刺激と比較して顕著に減少した (log2FC -1.5、p<0.001)。
補助転写因子によるIL-4感受性の制御: IFN-γ誘導性エンハンサーをIL-4感受性群 (773領域) とIL-4耐性群 (736領域) に分類し、モチーフエンリッチメント解析を行った結果、STAT1およびIRF1 (Interferon Regulatory Factor 1) 結合モチーフのみを持つエンハンサーはIL-4抑制に耐性を示すことが明らかになった (Fig. 4c)。一方、AP-1 (Activator Protein 1)、ATF (Activating Transcription Factor)、C/EBP (CCAAT/Enhancer-Binding Protein)、NFκBなどの補助転写因子結合部位が共存するエンハンサーは、IL-4感受性が高まることが同定された (Fig. 4c)。特に、Cebpb (C/EBPβをコード) およびJunb (JUNBをコード) はIFN-γによって誘導され、IL-4との同時刺激によって発現が抑制された (Fig. 4d)。JunbまたはCebpbをノックダウンしたBMDM (n=3 replicates) では、IFN-γ誘導性遺伝子のうちIL-4感受性を示す遺伝子の活性化が優先的に障害され (Fig. 5e, f)、これらの補助転写因子がIL-4による抑制の脆弱性を生み出すことが示された。例えば、NfkbizやCd69はJUNBに依存し、Acsl1やIl27はC/EBPβに依存してIFN-γ誘導性を示した (Fig. 5g)。JUNBおよびC/EBPβのDNA結合は、IFN-γ単独刺激と比較して、IL-4との同時刺激下で有意に低かった (Fig. 5a, b)。JUNBノックダウンは、IL-4によって強く抑制されるJUNB結合部位において、IFN-γ応答性のH3K27ac量を有意に、しかし中程度に減少させた (Fig. 5c)。これは、JUNB結合がIFN-γ応答性のH3K27ac沈着に寄与し、その枯渇がIL-4との同時刺激による抑制の部分的な表現型模倣であることを示唆している。対照的に、Cebpbノックダウンは、IL-4感受性またはIL-4耐性のC/EBPβ占有部位におけるIFN-γ誘導性ヒストンアセチル化に明確な影響を与えなかった (Fig. 5d)。
MycによるIL-4応答のIFN-γ耐性成分の駆動: IL-4活性化エンハンサーをIFN-γ感受性群とIFN-γ耐性群に分類したところ、IFN-γ耐性エンハンサーではMyc (c-Myc) によって認識されるE-boxモチーフが最も顕著に濃縮されていた (Fig. 6c)。MycのmRNAおよびタンパク質発現はIL-4によって誘導され、この応答はIFN-γとの同時刺激下でも大部分が維持された (Fig. 6d, e)。MycはIL-4刺激後2時間で11,357ピーク、4時間で8,747ピークに結合し (Fig. 7a, b)、STAT6結合部位とは異なるゲノム領域にも結合することが示された。MycをノックダウンしたBMDM (n=3 replicates) では、IL-4誘導性遺伝子のうちIFN-γ耐性を示す遺伝子の発現が主に減少した (Fig. 7g)。具体的には、Ch25h, Cd274, Ccl2, Ccl7, Ccl12, Flt1, Serpina3fを含む54個のIL-4誘導性遺伝子の発現が減少した (Supplementary Table 16)。これは、MycがIL-4応答においてIFN-γによる抑制に耐性のある応答成分を駆動する重要な役割を果たすことを示唆している。Myc結合領域のクラスター解析により、STAT6の有意な動員、豊富なH3K27ac、STAT6モチーフ、およびE-boxモチーフに関連する小さなクラスター (クラスター1; ピークの11.6%) と、STAT6結合が限定的または無視できる2つの大きなグループ (クラスター2および3) に分離された。クラスター1は免疫応答に関連する遺伝子オントロジー用語に選択的に濃縮されており、クラスター2および3は両方とも「RNA代謝」や「細胞周期」といった典型的なMyc関連遺伝子オントロジー用語に濃縮されていた (Fig. 7d)。
考察/結論
先行研究との違い: 本研究は、M1およびM2マクロファージ極性化プログラムが単なる並行した活性化状態ではなく、STAT1とSTAT6がゲノムレベルで共通エンハンサーに競合的に結合し、クロマチン状態を動的にリモデルする相互排他的なシステムとして機能することを、ゲノムワイドかつ経時的に初めて証明した。この知見は、マクロファージがM1/M2の連続スペクトラム上に存在するという従来の単純なモデルと異なり、活性化状態がSTAT競合によって決定される動的な均衡であり、シグナル優位性が時間的に切り替わるとエンハンサーレパートリー自体が再構成されるというパラダイムを提供した。IFN-γとIL-4の同時刺激は、各サイトカイン単独で誘導される応答を広範に、しかし部分的に減弱させた。全体として、IFN-γとIL-4誘導性プログラムは大部分が共存可能であったが、同時刺激条件下ではマクロファージは2つの対立する機能的極の間で「引き伸ばされ」、両方の相互減弱をもたらした。
新規性: 本研究で初めて、IFN-γ応答におけるIL-4感受性が、STAT1/IRF1結合モチーフに加えてAP-1やC/EBPβなどの補助転写因子結合部位の共存によって決定されることを同定した。また、IL-4応答においてMycがIFN-γによる抑制に耐性のある応答成分を駆動する重要な役割を果たすことを新規に示した。これらのメカニズムは、複雑な微小環境下でのマクロファージの可塑性とシグナル統合を理解するための基本的な枠組みを提供する。単純なシス制御要素はIL-4の拮抗作用に耐性を示す一方、JUNBなどの補助転写因子モチーフを含む複雑なシス制御要素はIL-4による抑制に脆弱性を示した。
臨床応用: 本知見は、腫瘍免疫療法におけるTAM (腫瘍関連マクロファージ) の再極性化戦略に臨床的意義を持つ。TAMはIL-4/IL-13が豊富な腫瘍微小環境でM2様性質を示し、免疫抑制や腫瘍増殖を促進する。本研究の結果は、IL-4シグナルが先行して確立されたTAMであっても、STAT1シグナルによって再極性化が可能であることを示唆する。したがって、STAT6阻害剤 (例: IL-4Rα (IL-4受容体α) 抗体デュピルマブ) とSTAT1活性化剤 (例: IFN-γ局所投与、TLR (Toll-like receptor) アゴニスト) の併用によるTAMのM1化は、理論的に支持される臨床応用戦略となり得る。また、IL-4とIFN-γ間のクロストークは、炎症の解消期における炎症促進プログラムから抗炎症プログラムへの移行に関与する可能性があり、タイプ1またはタイプ2免疫応答を誘発する病原体との同時感染中に観察される病原性効果の一部を説明する可能性があり、異なる腫瘍に関連するマクロファージの複雑で異なる表現型を説明する可能性もある。
残された課題: 今後の検討課題として、(1) 本研究がBMDMベースであるため、in vivoの腫瘍TAMにおける本機序の検証、(2) ヒトTAMにおけるSTAT1/STAT6クロストークの特性解明、(3) シグナル時間差や強度依存性 (臨床投与タイミングの最適化に重要)、(4) 組織常在マクロファージ (ミクログリア、クッパー細胞、肺胞マクロファージ) における異なるエピジェネティック基盤の検討、(5) TAMの可塑性と耐性機構のさらなる詳細な解析、が挙げられる。これらの今後の研究は、マクロファージ極性化の複雑な制御機構をより深く理解し、疾患治療への応用を加速させるために不可欠である。
方法
細胞およびサイトカイン刺激: マウスBMDM (骨髄由来マクロファージ) (C57BL/6) をL929細胞馴化培地中のM-CSF (マクロファージコロニー刺激因子) で分化させた後、IFN-γ (100 ng/ml)、IL-4 (10 ng/ml)、またはこれらの逐次/同時刺激 (1-24時間) で処理した。サイトカインの最適濃度は、STAT1およびSTAT6のリン酸化、ならびに代表的なM1遺伝子 (Nos2) およびM2遺伝子 (Arg1) の最大誘導に基づいて決定された。STAT1 (Tyr701) およびSTAT6 (Tyr641) のリン酸化はフローサイトメトリーおよび免疫蛍光分析で確認され、両転写因子が同一細胞内で活性化されることが示された。IL-4によるIFN-γ誘導性遺伝子発現の抑制は、Stat6-/- BMDMでは消失し、STAT6の関与が示唆された。
ゲノムワイド解析:
- ChIP-seq (Chromatin Immunoprecipitation sequencing): STAT1、STAT6、Myc、JUNB、C/EBPβ (CCAAT/Enhancer-Binding Protein β)、p300 (ヒストンアセチルトランスフェラーゼp300)、H3K27ac (ヒストンH3リジン27アセチル化)、H3K4me1 (ヒストンH3リジン4モノメチル化) のゲノムワイド結合およびヒストン修飾変化をマッピングした。ChIP-seqデータはLangmead et al. NatMethods 2012のBowtie2 v2.2.6を用いてmm10参照ゲノムにマッピングされ、ピークコールはアセチル化に対してはSICER v1.1、転写因子に対してはZhang et al. GenomeBiol 2008のMACS2 v2.1.0.20150731を用いて実施された。
- ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing): クロマチンアクセシビリティの変化を評価した。
- GRO-seq (Global Run-on sequencing): nascent転写 (新生転写) の変化を測定した。
- RNA-seq (RNA sequencing): 遺伝子発現プロファイルを解析した。RNA-seqリードはTopHat v2.1.0を用いてマッピングされ、差分発現解析はRobinson et al. Bioinformatics 2010のedgeR v3.10.5とlimma v3.24.15 Bioconductorパッケージを用いて実施された。
バイオインフォマティクス解析: 共通および特異的なSTAT結合サイトの定義、モチーフエンリッチメント解析 (HOMER)、エンハンサー活性スコア (H3K27acおよびp300結合に基づく) の算出、差分発現遺伝子 (DESeq2) の同定を行った。遺伝子発現の差分は、FDR (false-discovery rate) ≤ 0.01かつ未処理条件と比較して2倍以上の発現変化に基づいて同定された。
遺伝子操作: Stat1-/- および Stat6-/- BMDMを用いて、STAT1およびSTAT6がクロストークに果たす役割を検証した。また、レンチウイルスを介したshRNA (short hairpin RNA) 導入によりJunbまたはCebpbをノックダウンしたBMDMを用いて、これらの補助転写因子の役割を評価した。Mycのノックダウンも同様にshRNAを用いて実施された。
機能検証: 代表的なM1マーカー遺伝子 (Nos2, Cxcl9, Cxcl10, Irf1) およびM2マーカー遺伝子 (Arg1, Retnla, Chil3, Mrc1) の発現レベルをRT-qPCR (Real-Time quantitative Polymerase Chain Reaction) で定量した。また、STAT1/STAT6結合エンハンサー部位のルシフェラーゼレポーターアッセイにより、エンハンサー活性の相互抑制を検証した。統計解析には、負の二項分布に基づく正確検定が用いられた。