- 著者: Yuping Fan, Yan Teng, Fabien Loison, Aiming Pang, Anongnard Kasorn, Xinqi Shao, Cunling Zhang, Qian Ren, Hongbo Yu, Yi Zheng, Jose A. Cancelas, John Manis, Li Chai, Shin-Young Park, Li Zhao, Yuanfu Xu, Sizhou Feng, Leslie E. Silberstein, Fengxia Ma, Hongbo R. Luo
- Corresponding author: Hongbo R. Luo (Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, USA), Fengxia Ma (Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300020, China)
- 雑誌: Science Translational Medicine
- 発行年: 2021
- Epub日: 2021-07-28
- Article種別: Original Article
- PMID: 34321317
背景
好中球減少症は、化学療法、放射線療法、または造血細胞移植を受けた患者において、用量制限となる最も重要な合併症であり、細菌性および真菌性感染症を伴うことが多い。これらの感染症は、迅速な医療介入がなければ生命を脅かす可能性があり、全ての患者が抗生物質療法に反応するわけではない。顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF) 治療は代替の予防的アプローチであるが、骨髄が回復する前に効果を発揮しないことが多く、骨痛、頭痛、倦怠感、吐き気などの副作用を伴う。G-CSFの長期使用は、白血病のリスクを増加させる可能性もある。
顆粒球輸血 (GTX: granulocyte transfusion) は、重度の好中球減少症患者における生命を脅かす細菌性および真菌性感染症に対する治療選択肢である。現在、G-CSFで刺激された健常ドナーから大量の好中球を容易に得ることが可能である。しかし、GTXの臨床的利益は、ドナー好中球の短いex vivo保存期間とin vivoでの急速な細胞死によって依然として損なわれている。現在のGTXの有効性については議論があるものの、GTXは、絶対好中球数が500細胞/μl未満の場合、細菌性または真菌性感染症の証拠がある場合、または抗菌治療に少なくとも48時間反応しない場合など、適切な臨床状況において価値があると依然として考えられている。好中球の生存と機能を改善するための顆粒球生物学に関するさらなる研究開発が緊急に必要であるという点で、一般的なコンセンサスが得られている。
好中球の細胞死は、アポトーシス経路と溶解性細胞死経路の両方によって媒介される不均一なプロセスである。先行研究である Teng et al では、好中球の自発的細胞死における不均一性が示された。また、Colotta et al. (1992) はサイトカインによる生存制御を報告し、Luo et al. (2008) は好中球アポトーシスの構成的制御機構を明らかにした。これらの先行研究 (Teng et al. 2017, Colotta et al. 1992, Luo et al. 2008) により好中球死の分子機構は徐々に解明されてきたが、依然として実用的な保存技術の開発には至っていない。老化好中球に活性酸素種 (ROS) が蓄積し、ROS誘導性のホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸シグナル伝達の不活性化が好中球の細胞死を媒介することが示されている。これらのROSは、膜損傷および細胞死経路の開始にも関与することが示されている。また、老化好中球におけるカスパーゼ-3の切断と活性化は、カノニカルなカスパーゼ-8またはカスパーゼ-9媒介経路とは独立しており、代わりに細胞質セリンプロテアーゼPR3によって媒介されることが発見された。PR3は新鮮な好中球の顆粒に隔離され、老化中にROS誘導性のリソソーム膜透過性 (LMP: lysosomal membrane permeabilization) 障害によって細胞質に放出され、プロカスパーゼ-3の切断とアポトーシスを引き起こす。溶解性好中球死は、ガスダーミンD (GSDMD) によって媒介される可能性があり、GSDMDは切断され活性化されてN末端フラグメント (GSDMD-NT) を生成し、膜破裂とそれに続くパイロトーシスを誘発する。ネクロトーシスは別のプログラムされた壊死形態であるが、好中球生物学におけるその役割はあまり理解されていない。ヒト好中球は最近、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子への曝露後、CD44、CD11b、CD18、またはCD15などの接着受容体のリガンド結合後にネクロトーシスを起こすことが報告された。
これらの知見に基づき、好中球の短い保存期間と機能低下というGTXの主要な課題を克服するためには、単一の細胞死経路を標的とするだけでは不十分であり、複数の細胞死経路を同時に阻害する戦略が不可欠であるというギャップが残されている。特に、好中球の生存期間を大幅に延長し、かつその機能を維持する効果的な治療カクテルは未確立であり、臨床現場で実用可能な保存技術が圧倒的に不足しているという深刻な課題が残されている。
目的
本研究の目的は、顆粒球輸血 (GTX) の有効性を向上させる治療戦略を開発することである。具体的には、以下の点を目的とした。
- 単一細胞死阻害の限界の確立: 好中球の自発的細胞死が複数の経路によって媒介されることを踏まえ、単一の細胞死阻害剤では好中球の保存期間延長に限界があることを示す。
- 複数細胞死経路同時阻害カクテルの設計とスクリーニング: カスパーゼ、リソソーム膜透過性 (LMP) 障害、酸化ストレス、ネクロトーシスを阻害し、さらにG-CSFによる生存促進効果を組み合わせた複合カクテル (CLON-G) を設計し、その抗細胞死活性を評価する。
- ヒトおよびマウス好中球のex vivo保存期間と機能の評価: CLON-G処理がヒトおよびマウス好中球のex vivo半減期を24時間未満から5日以上に延長できるか、また、貪食、殺菌、走化性、活性酸素種 (ROS) 産生といった主要な機能が維持されるかを評価する。
- 薬剤除去後の好中球生存と機能の評価: CLON-G処理後、薬剤を除去した場合でも好中球の生存期間延長効果が持続するか、また、in vivoの炎症部位における生存率が新鮮好中球と比較してどうなるかを検証する。
- 好中球減少症関連感染症マウスモデルにおける治療効果の検証: 好中球減少症関連細菌性肺炎および全身性カンジダ症のマウスモデルにおいて、CLON-G処理した3日齢好中球の輸血が、新鮮好中球と同等の宿主防御強化、感染誘発性組織損傷軽減、生存率向上効果を示すかを評価する。
- 臨床顆粒球アフェレーシス製剤の検証: 臨床的に採取された顆粒球アフェレーシス製剤に対し、CLON-G処理が保存期間を延長し、機能を維持できることをex vivoおよびin vivo (免疫不全マウスモデル) で検証し、GTXの臨床翻訳への適用可能性を確立する。
結果
複数細胞死経路同時阻害による好中球生存期間の大幅な延長: 単一の細胞死阻害剤（パンカスパーゼ阻害剤Q-VD-Ophのみ、ネクロトーシス阻害剤Nec-1sのみ、抗酸化剤N-アセチルシステイン (NAC) のみ）では、ヒトおよびマウス好中球のex vivo生存期間は24〜48時間の延長に留まり、3日後の生存率は40%から60%であった。これは、好中球の自発的細胞死がカスパーゼ依存性アポトーシス、LMP媒介性壊死、酸化ストレス、ネクロトーシスといった複数の並行経路によって同時に活性化されるため、単一経路の阻害では不十分であることを示唆した。これに対し、Q-VD-Oph、DFO、Hsp70、NAC、Nec-1s、およびG-CSFを組み合わせた複合カクテルであるCLON-Gは、好中球の生存率を劇的に改善した。CLON-G処理により、ヒトおよびマウス好中球のex vivo半減期は24時間未満から5日以上に延長され、3日後の生存率は90%を超えた (Fig 1D, H)。未処理群では3日後には95%以上の細胞が消失または死亡したのと比較して、この効果は顕著であった (p<0.001)。G-CSF単独処理では、1日後にヒト好中球の約55%、マウス好中球の約40%が生存するに留まり、CLON-Gの生存促進効果がG-CSF単独によるものではないことが確認された。
CLON-G処理好中球の機能保持と薬剤除去後の効果持続: CLON-G処理した3日齢のヒトおよびマウス好中球は、形態学的にも正常な葉状核を保持しており、貪食能、ROS産生能、走化性、細菌殺菌能の全てにおいて、新鮮好中球と同等の機能を示した (Fig 3A-E, Fig 6F-K, Fig 7F-J)。特に、CLON-G処理した5日齢の好中球でも、未処理またはG-CSF単独処理の1日齢好中球よりも速い速度で遊走した (Fig 3A)。薬剤除去後もCLON-Gの保護効果が持続することが示された。CLON-Gで3日間処理したマウス好中球 (n=3 cells) を洗浄し、薬剤を含まない培地で培養した後も、未処理の新鮮好中球と比較して、健康な細胞の総数およびアネキシンV陰性/PI陰性細胞の割合が高く維持された (Fig 2B, C)。この効果は、マウス好中球では12時間後から顕著になり、ヒト好中球 (n=3 donors) では3日以上持続した。これは、細胞内への薬剤の長期的な保持、または薬剤効果の持続によるものと考えられた。
in vivoにおけるCLON-G処理好中球の生存期間延長と感染部位への効率的な動員: NSG免疫不全マウスを用いたヒト好中球のin vivo輸血モデルにおいて、CLON-G処理した3日齢のヒト好中球は、新鮮ヒト好中球と同等のin vivo生存期間を示し、血液、肺、肝臓、脾臓組織への浸潤能および貪食能を保持していた (Fig 8B, C, E, F, H)。マウス腹膜炎モデルでは、CLON-G処理した3日齢好中球は、未処理の新鮮好中球と比較して炎症部位での細胞死率が低く、3日後には新鮮好中球に対する比率が10-fold increase以上に達した (Fig 2F, G, p<0.01)。これは、CLON-G処理がin vivoでの輸血顆粒球の生存も促進することを示している。さらに、好中球減少症関連肺炎モデルにおいて、CLON-G処理した3日齢好中球は、新鮮好中球と同様に炎症を起こした肺への効率的な動員を示し、動員効率の低下は認められなかった (Fig 4B-D)。
好中球減少症関連感染モデルにおけるCLON-G処理好中球の治療効果: 好中球減少症性E. coli肺炎モデル (n=5 mice) において、CLON-G処理した3日齢好中球の輸血は、新鮮好中球の輸血と同等に、細菌クリアランスを促進し、肺浮腫を改善し、炎症性サイトカイン (TNF-α、IL-6) の産生を低下させ、マウスの生存率を向上させた (Fig 5B, C, E, F, G, H)。未処理またはG-CSF単独処理の好中球の輸血では、これらの保護効果は認められず、CLON-G処理好中球の輸血によりE. coli感染マウスの生存率は100%に回復した (p<0.01)。同様に、Candida albicans全身感染モデルにおいても、CLON-G処理した3日齢好中球の輸血は、新鮮好中球の輸血と同等の宿主防御強化、真菌負荷の減少、体重減少の回復、腎臓壊死の軽減、生存率の向上効果を示した。これらの結果は、CLON-G処理が好中球減少症関連感染症に対する治療効果をin vivoで発揮することを示している。
臨床顆粒球アフェレーシス製剤におけるCLON-Gの有効性: 健常ドナーから採取された顆粒球アフェレーシス製剤に対し、CLON-G処理は保存期間を延長し、機能を維持することが確認された。CLON-G処理した3日齢のアフェレーシス好中球は、ROS産生、貪食能、走化性、殺菌能において新鮮好中球と同等の機能を示した (Fig 6F-K, Fig 7F-J)。特に、CLON-G処理した5日齢の好中球でも、細菌殺菌能はわずか15%の減少に留まり、未処理またはG-CSF単独処理の1日齢好中球で認められた50%以上の減少と比較して、機能が大幅に維持されていた (Fig 6K)。さらに、CLON-G化合物をアフェレーシス採血バッグに直接添加した場合でも、同様に好中球の生存率と機能が改善され、5.0-fold increaseの生存率向上を達成した (Fig 7B-J, p<0.001)。これらの結果は、CLON-G処理が現在の臨床GTX製品の保存期間延長に直接適用可能であることを示唆している。
考察/結論
先行研究との違い: 本研究は、単一の細胞死経路を標的とすることで好中球の生存期間をわずかに延長できるとした従来の研究と異なり、好中球の細胞死が複数の並行経路によって媒介されるという概念を確立し、これらの経路を同時に阻害するCLON-Gが、単一経路阻害とは対照的に、好中球の生存期間と機能を大幅に改善できることを初めて示した。特に、Teng et al が示した好中球細胞死の不均一性という知見を、治療戦略へと応用した点がこれまでのアプローチと大きく異なる。
新規性: 本研究で初めて、カスパーゼ、リソソーム膜透過性 (LMP) 障害、酸化ストレス、ネクロトーシス、およびG-CSFによる生存促進を組み合わせたCLON-Gという複合治療が、好中球の運命を変化させ、その半減期を5日以上に延長し、かつ貪食、殺菌、走化性、ROS産生といった主要なエフェクター機能を完全に維持できることを新規に同定した。また、CLON-G処理後の薬剤除去後も、細胞内薬剤保持または持続的な薬剤効果により、in vivoでの好中球生存期間延長効果が持続するという重要な知見も本研究で初めて報告された。
臨床応用: 本知見は、顆粒球輸血 (GTX) の臨床応用に直結する大きな臨床的意義を持つ。CLON-G処理により、好中球の保存期間が延長されることで、現在のGTXが抱える「同日採取・24時間以内輸血」という制約が解消され、遠隔地からの輸送や複数患者への分割使用が可能となる。これにより、化学療法後の好中球減少性敗血症、骨髄移植後の感染症、慢性肉芽腫症 (CGD) などの患者に対する治療アクセスが拡大し、Aspergillus、Candida、Pseudomonas、E. coliなどの侵襲性感染症に対するGTXの臨床的有効性が大幅に向上すると考えられる。特に、多剤耐性菌の増加傾向にある現状において、GTXの重要性はますます高まっており、CLON-Gは実用化に向けた重要なステップとなる。
残された課題: 今後の検討課題として、CLON-Gカクテルに含まれる6種類の化合物の複合的なFDA承認プロセス、製造スケールアップの課題が残されている。また、本研究のin vivo実験は免疫不全マウス (n=5 mice) で行われたため、CLON-G処理されたヒト好中球の輸血が、好中球減少症患者において実際に宿主防御を効果的に強化できるかについては、さらなる臨床試験での検証が必要である。薬剤の細胞内保持による保護効果は示されたものの、カスパーゼ阻害剤などの薬剤が患者に与える潜在的な副作用 (例: 自己免疫リスク) についての評価も必要である。ドナーの年齢や健康状態による好中球の変動性、凍結保存後の機能維持、およびCGD患者のgp91phox欠損好中球に対するCLON-Gの効果も未検証であり、これらが今後のlimitationとして挙げられる。
方法
研究デザイン: 本研究は、顆粒球輸血 (GTX) における好中球のex vivoおよびin vivo生存を改善するための治療戦略を探索することを目的とした。まず、ヒトおよびマウス好中球のex vivo生存期間を約24時間から5日以上に延長する治療法 (CLON-G) をスクリーニングにより同定した。次に、CLON-G処理好中球の機能を評価し、走化性、活性酸素種 (ROS) 産生、貪食、殺菌を含む正常なex vivo機能を示すことを確認した。さらに、好中球減少症関連細菌性肺炎および全身性カンジダ症の臨床的に関連性の高いマウスGTXモデルにおいて、輸血された好中球の機能をin vivoで評価し、CLON-G処理した3日齢好中球の輸血が、新鮮好中球と同等の宿主防御強化、感染誘発性組織損傷軽減、生存期間延長効果を示すことを実証した。最後に、CLON-G処理が、アフェレーシスにより採取されたヒトGTX製品の保存期間を延長し、機能をex vivoおよびNSG (NOD/SCID/γc-null) マウスにおけるin vivoで維持できることを示す実験を行った。全ての実験は少なくとも3回独立して実施され、再現性が確認された。
好中球分離: ヒト末梢血好中球は、ボストン小児病院の血液銀行ラボから提供された廃棄された白血球フィルター (Pall Corporation) から分離した。マウス骨髄好中球は、大腿骨および脛骨からPercoll/HBSS勾配遠心法を用いて分離した。臨床顆粒球アフェレーシス製剤は、G-CSF (250 μg) およびデキサメタゾン (8 mg) で刺激されたドナーから標準的な連続フローアフェレーシスにより採取した。
化合物スクリーニングとCLON-Gの同定: 好中球死関連経路の様々な阻害剤 (カスパーゼ、リソソーム膜透過性 (LMP) 障害、セリンプロテアーゼ、ROS/NADPHオキシダーゼ) およびG-CSFを用いて、ヒトおよびマウス好中球の生存率に対する効果を評価した。最終的に、カスパーゼ阻害剤 (Q-VD-Oph 50 μM)、LMP阻害剤 (DFO 1 μM、Hsp70 10 pM)、酸化ストレス阻害剤 (N-アセチルシステイン (NAC) 10 μM for human, 1 mM for mouse)、ネクロトーシス阻害剤 (Nec-1s 10 μM)、およびG-CSF (10 ng/ml) を組み合わせた複合カクテルをCLON-Gとして同定した。
Ex vivo保存と機能アッセイ: 好中球はRPMI 1640培地 (20% FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン含有) で培養した。生存率の評価には、アネキシンV/PIフローサイトメトリーおよび共焦点蛍光顕微鏡を用いた。形態は光学顕微鏡で観察した。機能アッセイには、貪食能 (pHrodo-E. coliまたはザイモサンバイオ粒子)、ROS産生 (fMLP誘導NADPHオキシダーゼ活性化をルミノール化学発光で測定)、走化性 (EZ-TAXIScan装置を用いたfMLP勾配下での細胞移動速度と方向性) を用いた。
マウス感染モデル: 好中球減少症は、シクロホスファミド (CPM) および5-フルオロウラシル (5-FU) 投与により誘導した。感染モデルには、E. coli肺炎モデルおよびCandida albicans全身感染モデルを用いた。
NSGマウスにおけるヒト好中球輸血: NOD/SCID/γc-null (NSG) 免疫不全マウスにヒト好中球を静脈内 (i.v.) 輸血し、in vivoでの組織浸潤、肺炎症、貪食能、生存期間を評価した。
臨床製剤のバリデーション: 顆粒球アフェレーシス製剤をCLON-G処理し、3日後の機能 (ROS、貪食、走化性、殺菌) を新鮮製剤と比較した。臨床状況を模倣するため、アフェレーシス製剤は輸血前に25グレイ (Gy) で放射線照射した。
統計解析: データ分布の正規性はShapiro-Wilk検定で確認した。ほとんどの実験では、特に記載がない限り、両側非対Studentのt検定を用いて比較を行った。P値が0.05未満を統計的に有意とみなした。生存解析には、Kaplan-Meier生存曲線を作成し、ログランク検定を用いて群間の比較を行った。