- 著者: Xiao-Chen Xu, Jia-Xin Jiang, Ya-Qing Zhou, Shuai He, Yang Liu, Yi-Qi Li, Pan-Pan Wei, Jin-Xin Bei, Jian Sun, Chun-Ling Luo
- Corresponding author: Jian Sun; Chun-Ling Luo (Sun Yat-sen University Cancer Center, Guangzhou, China)
- 雑誌: Cell Death & Disease
- 発行年: 2023
- Epub日: 2023-08-09
- Article種別: Original Article
- PMID: 37558679
背景
鼻咽頭癌 (NPC) は、鼻咽頭上皮に由来する頭頸部悪性腫瘍の一つであり、中国南部、東南アジア、北アフリカで高い罹患率を示す地域特異的な分布を示す。Epstein-Barr virus (EBV) 感染、遺伝的素因、環境要因、生活習慣など、複数のリスク因子がNPCの発症に関与していることが示唆されている (Chen et al. 2019, Wong et al. 2021)。近年、癌関連遺伝子の転写制御がNPCの発生と進展に大きく寄与することが多くの研究で明らかにされている (Ren et al. 2017, Zhao et al. 2022, Hou et al. 2017)。しかし、NPCの発生における転写後制御、特に選択的スプライシング (AS) の役割については、これまで十分に調査されておらず、未解明な点が多い。この領域は、NPCの病態生理を完全に理解するために重要な知識のギャップが残されている。
ASは、単一の遺伝子から多様な機能を持つmRNA転写産物やタンパク質産物を生成する重要な転写後制御プロセスである。その異常は、細胞増殖、細胞分裂、アポトーシス、浸潤、免疫回避など、複数の癌の特性の制御に関与することが示されている (Xu et al. 2014, Bechara et al. 2013, Kahles et al. CancerCell 2018)。一般的に、ASプロセスは様々なスプライシング因子、特にセリン/アルギニンリッチスプライシング因子 (SRSFs) の協調によって精密に制御される。SRSFsは、1つまたは2つのRNA認識モチーフ (RRM) とセリン/アルギニンリッチ (RS) ドメインを含む12のファミリーメンバーから構成される重要なスプライシング因子である (Manley et al. 2010)。これらは通常、エキソン性スプライシングエンハンサーまたはイントロン性要素に結合し、スプライシングを促進または阻害する。
先行研究では、ほとんどのSRSFsが肺癌 (SRSF1, SRSF5)、乳癌 (SRSF3)、結腸癌 (SRSF1, SRSF10)、肝癌 (SRSF2)、グリオーマ (SRSF1, SRSF3) など多くの癌種で癌遺伝子としての役割を通じて、様々な癌関連遺伝子のASを制御することで広範に異常調節されていることが報告されている (Lv et al. 2021, Chen et al. 2018, Ke et al. 2018, Chen et al. 2017, Zhou et al. 2014, Luo et al. 2017, Zhou et al. 2019, Song et al. 2019)。しかし、NPCにおけるSRSFsの具体的な機能と根底にあるメカニズムは依然として不明であり、この分野における知識のギャップが残されている。本研究は、この不足している知見を補完することを目的とする。
目的
本研究の目的は、鼻咽頭癌 (NPC) における12種類の古典的セリン/アルギニンリッチスプライシング因子 (SRSFs) の発現プロファイルを体系的に解析し、特にSRSF3の過剰発現とその予後との関連性を明らかにすることである。さらに、SRSF3がNPC細胞の腫瘍形成に果たす癌遺伝子としての機能を詳細に調査する。また、SRSF3によって制御される選択的スプライシング (AS) イベントの全体像をRNAシーケンス解析により解明し、特にアンギオモチン様1 (AMOTL1) のエクソン12スプライシングにおけるSRSF3の直接的な制御機構を特定する。最終的に、SRSF3が生成するAMOTL1の長鎖アイソフォーム (AMOTL1-L) がYAP1の核移行を促進し、NPCの腫瘍形成を駆動するメカニズムを解明することで、NPCの新たな予後バイオマーカーおよび治療標的の可能性を提示する。
結果
SRSF3の過剰発現とNPCにおける予後不良との関連: NPCにおけるSRSFsの役割を体系的に調査するため、まず87例のNPC腫瘍組織と10例の非癌性対照組織における12種類の古典的SRSFsのmRNA発現レベルを解析した。その結果、SRSF2、SRSF3、SRSF9がNPC検体で対照検体と比較して有意に過剰発現していることが明らかになった (p<0.01)。RT-qPCRアッセイでは、NPC細胞株 (S26および5-8F) において、正常鼻咽頭上皮細胞株 (NP69) と比較してSRSF3のみが高発現していることが確認された (Fig. 1C)。さらに、Western blottingアッセイにより、SRSF3がNPC腫瘍組織で対照組織と比較して著しく高発現していることが確認された (Fig. 1D)。SRSF3発現の臨床的意義を評価するため、95例のNPC検体で免疫組織化学 (IHC) アッセイを用いてSRSF3のタンパク質発現を調べ、生存解析を行った。その結果、SRSF3の高発現がNPC患者の不良な予後と有意に相関していることが示された (Fig. 1F)。また、SRSF3の過剰発現は、NPC患者の転移 (p=0.0302) およびTステージ (p=0.0258) と著しく相関していた (Table 1)。これらの観察結果は、SRSF3がNPCの発生に寄与する潜在的な癌遺伝子であることを示唆している。
NPC進展におけるSRSF3の腫瘍形成促進的役割: SRSF3の生物学的機能をさらに調査するため、S26および5-8F細胞においてsiRNAを用いてSRSF3の発現をノックダウンした (Fig. 2A)。コロニー形成アッセイ (Fig. 2B) および細胞増殖曲線アッセイでは、SRSF3のノックダウンがNPC細胞の増殖能力を有意に低下させることが示された。これは、増殖マーカーであるEdU陽性細胞数の著しい減少によってさらに確認された (Fig. 2C)。Western blottingアッセイでは、増殖マーカーであるCCND1およびc-MYCの発現がSRSF3ノックダウン細胞で減少していることが明らかになった (Fig. 2D)。さらに、SRSF3ノックダウンは、Annexin V/プロピジウムヨージド (PI) 染色増加およびPARP活性化のタンパク分解的切断によって示されるように、NPC細胞のアポトーシスを顕著に誘導した (Fig. 2D)。トランスウェルおよび創傷治癒アッセイでは、SRSF3ノックダウンがNPC細胞の遊走を阻害することが示され (Fig. 2E)、これは遊走マーカーであるN-カドヘリンおよびビメンチンの発現減少によってさらに確認された。これらの観察結果は、NPCにおけるSRSF3の癌遺伝子としての役割を示唆している。
in vivoにおけるSRSF3の腫瘍形成促進機能: SRSF3のin vivoでの腫瘍形成促進機能を検討するため、SRSF3を標的とするshRNA (sh-SRSF3-1および-2) または対照shRNA (sh-Luci) を安定的に発現するS26細胞を用いた異種移植モデルを確立した。SRSF3ノックダウン群では、対照群と比較して腫瘍体積および重量が著しく減少することが観察された (Fig. 2F, G)。腫瘍体積は対照群の約2000 mm³に対し、SRSF3ノックダウン群では約500 mm³に減少した。一貫して、高い増殖活性を示すKi-67陽性細胞の割合は、SRSF3ノックダウン群で有意に減少した (Fig. 2H)。さらに、NPCにおけるSRSF3の癌遺伝子としての役割を検証するため、SRSF3を安定的に過剰発現するNPC細胞株を構築し (Fig. 2I)、NPC細胞の増殖および遊走能力が著しく増強されることを観察した (Fig. 2J-L)。これらの結果は、SRSF3がNPC細胞の増殖、遊走、および腫瘍形成に不可欠であることを強く示唆している。
NPC細胞におけるSRSF3によって制御されるASイベントの全体像: SRSF3が古典的なスプライシング因子であることを考慮し、SRSF3が選択的スプライシング制御を通じてどのようにその腫瘍形成機能を実行するかを調査した。トランスクリプトーム解析により、S26細胞においてSRSF3ノックダウンによって影響を受ける合計1,934のASイベントが明らかになった (Fig. 3A)。これには、1,490のカセットエクソン、125のイントロン保持 (IR)、122の代替5’スプライス部位 (A5SS)、119の代替3’スプライス部位 (A3SS)、および78の相互排他的エクソン (MXE) が含まれた (Fig. 3B)。ヒートマップ解析では、ほとんどのASイベントが代替エクソンのインクルージョンまたはエクスクルージョンのいずれかで有意に変化していることが示された (Fig. 3C)。さらに、Gene Ontology (GO) 解析では、SRSF3によって影響を受けるASイベントが、細胞周期およびmRNA代謝プロセスの制御を含むシグナル伝達経路に機能的に濃縮されていることが明らかになった (Fig. 3D)。カセットスプライシングイベントのうち、エクソンインクルージョン (58.86%または877/1,490) とエクスクルージョン (41.14%または613/1,490) の割合は同程度であり (Fig. 3E)、SRSF3がスプライシング活性化因子と抑制因子の両方の二重の役割を持つことを示唆している。その後、両グループから上位20のASイベントを選択し、逆転写PCR (RT-PCR) を用いてさらに検証した。SRSF3が標的エクソンのスプライシングを活性化 (Fig. 3F) または抑制 (Fig. 3G) することが確認され、これらの変化はトランスクリプトーム解析からのΔPSI (percent spliced in) と有意に相関していた (Fig. 3H)。これらの結果は、SRSF3がNPCにおいて複数のASイベントを制御する重要なスプライシング因子であることを強く示唆している。
SRSF3とAMOTL1間の相互結合部位がエクソンインクルージョンに関与: SRSF3によって影響を受けるASイベントの中で、エクソン12を含むAMOTL1の発現がSRSF3ノックダウンによって抑制され、対照細胞では長鎖アイソフォーム (AMOTL1-L) から短鎖アイソフォーム (AMOTL1-S) へとシフトすることが同定された (Fig. 4A, B)。さらに、AMOTL1-LはNPC検体 (n=62) で対照検体 (n=8) と比較して過剰発現しており (Fig. 4C)、AMOTL1-L/Sの比率はNPC検体においてSRSF3発現と正の相関を示した (p=0.034, Fig. 4D)。これは、SRSF3がAMOTL1スプライシングを制御していることを示唆している。SRSF3がAMOTL1エクソン12の選択的スプライシングをどのように制御するかというメカニズムを解明するため、AMOTL1のエクソン11からエクソン13にわたるゲノムDNA断片を含むミニジーンレポータープラスミドを構築し (Fig. 4F)、SRSF3ノックダウンの有無にかかわらずS26細胞に一時的にトランスフェクションした。SRSF3ノックダウン細胞では、エクソン12断片を持たないAMOTL1-Sバリアントが有意に増加し、野生型細胞における優勢なAMOTL1-Lバリアントの存在と比較して、AMOTL1のエクソン12のインクルージョンがSRSF3依存性であることが示唆された (Fig. 4G)。次に、RNA免疫沈降 (RIP) およびRT-PCRにより、SRSF3がAMOTL1の代替エクソン12に強く結合するが、エクソン11および13には結合しないことが明らかになった (Fig. 4H)。これらの観察結果は、SRSF3がAMOTL1のエクソン12に直接結合してそのインクルージョンを促進することを示唆している。さらに、SRSF3がRNA認識モチーフ (RRM) ドメインを介してAMOTL1のエクソン12に結合することが、SRSF3の野生型および変異体を用いた実験で確認された (Fig. 4I, J)。
NPCにおけるAMOTL1-Lの癌遺伝子機能: 癌遺伝子であるSRSF3がAMOTL1-Lの発現を促進することから、AMOTL1-LがNPCの発生に寄与するかどうかを調査した。まず、AMOTL1のエクソン12を特異的に標的とする2つのsiRNAを用いてNPC細胞株 (S26および5-8F) においてAMOTL1-Lの発現をノックダウンした (Fig. 5A)。その結果、AMOTL1-Lノックダウン群では対照群と比較してNPC細胞の増殖能力が有意に阻害されることが観察された (Fig. 5B)。これは、EdU陽性細胞の減少およびCCND1とc-MYCの発現低下によってさらに確認された。フローサイトメトリーにより、AMOTL1-LノックダウンがNPC細胞のアポトーシスを顕著に誘導することが明らかになった。トランスウェルおよび創傷治癒アッセイでは、NPC細胞におけるAMOTL1-L枯渇により遊走能力が明らかに阻害されることが示された (Fig. 5C)。さらに、in vivoでのAMOTL1-Lの機能を検討するため、AMOTL1のエクソン12を特異的に標的とするshRNA (sh-AMOTL1-L1およびsh-AMOTL1-L2) または対照shRNA (sh-Luci) を発現するレンチウイルスを感染させたS26細胞の皮下注射による異種移植マウスモデル (n=5 mice per group) を確立した。AMOTL1-Lノックダウン群では、対照群と比較して腫瘍体積および重量が有意に減少することが観察され (Fig. 5D, E)、AMOTL1-Lの枯渇がNPC細胞の腫瘍増殖を阻害することを示している。これは、AMOTL1-Lノックダウン腫瘍におけるKi-67陽性細胞の減少およびcleaved-PARP1の発現誘導によってさらに検証された (Fig. 5F)。AMOTL1-L、AMOTL1-S、または空ベクターを安定的に過剰発現する細胞株 (S26および5-8F) をさらに確立した。コロニー形成アッセイおよび増殖マーカーEdU陽性細胞の染色アッセイにより、AMOTL1-Lの過剰発現がNPC細胞の細胞増殖を有意に促進するが、AMOTL1-Sはそうではないことが明らかになった。トランスウェルアッセイでは、AMOTL1-LはNPC細胞の遊走を改善するが、AMOTL1-Sはそうではないことが示された。さらに、Kaplan-Meier生存解析では、AMOTL1-Lの高発現がNPC患者の不良な予後と関連していることが示された。これらの結果は、AMOTL1-LがNPC細胞の増殖、遊走、および腫瘍形成に不可欠であることを強く示唆しており、その調節因子であるSRSF3の機能と一致している。
AMOTL1-LがNPCにおけるSRSF3の腫瘍形成機能を媒介: SRSF3がそのAS産物であるAMOTL1-Lと一貫した機能を共有することから、後者がNPCにおけるSRSF3の癌遺伝子機能を媒介するかどうかを検討した。まず、SRSF3ノックダウンとAMOTL1-Lまたは-Sの組み合わせを持つNPC細胞株を確立した。コロニー形成およびEdU陽性染色アッセイにより、SRSF3ノックダウンがNPC細胞の増殖を有意に減少させるが、AMOTL1-Lの過剰発現によって部分的に回復することが示された (Fig. 5G, H)。しかし、AMOTL1-Sでは回復効果は認められなかった。トランスウェルアッセイでも、AMOTL1-Lの過剰発現がSRSF3ノックダウンによって引き起こされる遊走阻害効果を回復させるが、AMOTL1-Sはそうではないことが確認された (Fig. 5I)。これらの観察結果は、AMOTL1-LがNPCにおけるSRSF3の腫瘍形成機能を部分的に媒介することを強く示唆している。
AMOTL1-Lの細胞質局在がYAP1の核内移行を媒介: NPCの発生において異なる役割を持つAMOTL1バリアントの制御メカニズムを次に検討した。まず、免疫蛍光アッセイにより、AMOTL1-Lと-SがそれぞれNPC細胞の細胞質と細胞膜に優先的に局在することが明らかになった (Fig. 6A)。これは、イムノブロッティングアッセイによってさらに検証され (Fig. 6B)、このような異なる細胞内局在が下流分子との相互作用に影響を与え、異なる機能につながる可能性を示唆している。AMOTL1がYAP1に結合し、その核内移行を促進するという先行研究の知見を考慮し (Zhou et al. 2020)、AMOTL1-L/SとYAP1の結合能力を調べた。免疫蛍光アッセイでは、AMOTL1-LがNPC細胞においてYAP1と強く共局在するが、AMOTL1-Sはそうではないことが示された (Fig. 6D)。共免疫沈降 (co-IP) アッセイにより、AMOTL1-LがYAP1と直接結合し、AMOTL1-Sよりも明らかに強い結合を示すことが明らかになった (Fig. 6C)。核質分離アッセイでは、AMOTL1-Lのノックダウンまたは過剰発現がそれぞれYAP1の核局在を阻害または促進することが示された (Fig. 6E, F)。次に、siRNAを用いてYAP1の発現をノックダウンすることにより、NPC細胞におけるYAP1の腫瘍形成能をさらに検討した (Fig. 6G)。細胞増殖、コロニー形成、およびトランスウェルアッセイにより、YAP1の枯渇がNPC細胞の増殖および遊走を有意に減少させることが明らかになった (Fig. 6H, I)。これらの観察結果は、AMOTL1-LがYAP1に結合し、その核内移行を促進することでNPCの腫瘍形成を促進することを強く示唆している。
考察/結論
SRSFsは古典的なスプライシング因子として様々な癌で異常調節されることが報告されているが、鼻咽頭癌 (NPC) におけるその根底にあるメカニズムは依然として未解明であった。本研究は、これまでの報告と異なり、NPCにおけるSRSFsの包括的な調査を初めて実施し、SRSF3がNPCの癌遺伝子として機能することを明らかにした。SRSF3の過剰発現はNPC患者の不良な予後と関連し、その機能的アッセイはSRSF3がNPC細胞の増殖、遊走、および腫瘍形成を有意に促進することを示した。
本研究で初めて、SRSF3がNPC細胞において1,934もの選択的スプライシング (AS) イベントを制御することを新規に同定した。特に、アンギオモチン様1 (AMOTL1) のエクソン12の選択的スプライシングがSRSF3によって直接制御され、癌遺伝子性の長鎖アイソフォームであるAMOTL1-Lが生成されることを明らかにした。SRSF3はRNA認識モチーフ (RRM) ドメインを介してAMOTL1のエクソン12に結合し、そのインクルージョンを促進する。これは、SRSF3の結合モチーフが代替エクソンに豊富に存在するという先行研究の知見を支持するものである。また、SRSF3のRSドメインの欠失がRNAへの結合能力を部分的に低下させるという観察は、RSドメインのリン酸化がRRMドメインの露出に影響を与え、RNA認識能力に影響を及ぼす可能性を示唆しており、これまで報告されていないメカニズムである。
AMOTL1-LはNPC細胞の増殖、遊走、および腫瘍形成を促進するが、短鎖アイソフォームであるAMOTL1-Sにはそのような機能は認められなかった。さらに、AMOTL1-Lの過剰発現はSRSF3ノックダウンによって引き起こされる増殖および遊走阻害効果を部分的に回復させ、AMOTL1-LがNPCにおけるSRSF3の腫瘍形成機能を媒介することを示唆している。AMOTL1-Lは細胞膜ではなく細胞質に優先的に局在し、YAP1とより強く結合してその核内移行を促進することで、癌遺伝子としての機能を発揮することが明らかになった。これらの知見は、SRSF3/AMOTL1スプライシング軸がNPCの発生において重要な役割を果たす新規なメカニズムであることを示唆する。
本研究の知見は、SRSF3/AMOTL1スプライシング軸がNPCの新たな予後バイオマーカーおよび治療標的となる可能性を示しており、臨床応用への道を開くものである。特に、AMOTL1-Lの細胞質局在とYAP1との相互作用は、Hippo-YAP経路を標的とする治療戦略の開発に臨床的意義を持つ可能性がある。
残された課題として、SRSF3によって制御される他のASイベントがNPCの発生に果たす役割をさらに調査する必要がある。また、AMOTL1のエクソン12がその細胞質局在にどのように影響するかの正確なメカニズムは未解明であり、構造予測や実験的検証による今後の検討が課題である。さらに、本研究のトランスクリプトームデータではSRSF2やSRSF9といった他のSRSFファミリーメンバーの過剰発現も示されており、これらの因子がNPCの発生に果たす潜在的な役割についても今後の研究で明らかにする必要がある。
方法
臨床検体収集: 広州のSun Yat-sen University Cancer Center (SYSUCC) でNPCまたは鼻炎と診断された患者から新鮮なNPC組織および対照組織を収集した。全検体は液体窒素で凍結し、-80 °Cで保存後、Western blot、トランスクリプトームシーケンス、qRT-PCRに供した。全ての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得て、SYSUCCの倫理委員会による承認を受けた。
細胞培養と試薬: ヒトNPC細胞株 (S26および5-8F) はSYSUCCのChaonan Qian教授より供与された。ヒト胚性腎臓HEK293T細胞は中国科学院細胞バンクより入手した。全ての細胞は10% FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM培地で、37 °C、5% CO2の加湿インキュベーターで培養した。マイコプラズマフリーであることを定期的に確認した。主要抗体はCell Signaling Technology、BD Pharmingen™、Abcam、Proteintech、Ray Antibody Biotech、Abclonal、Sigma-Aldrichから市販品を使用した。
RNA抽出、RT-PCRおよびRT-qPCR: Trizol試薬 (Invitrogen) を用いて総RNAを抽出し、M-MLV逆転写酵素 (Promega) でcDNAに逆転写した。RT-PCR産物は1%アガロースゲルで分離し、Bio-Rad ChemiDoc Touchで画像化した。RT-qPCRはSYBR Premix Ex Taqキット (Takara) を用いて実施した。プライマーは補足表S1に記載した。
siRNA、プラスミド構築およびレンチウイルスパッケージング: SRSF3、AMOTL1-L、YAP1に対するsiRNA (Gene Pharma) はLipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) を用いてNPC細胞株に48時間トランスフェクションした。HAタグ付き野生型SRSF3およびSRSF3ドメイン欠失変異体はpcDNA3.1-HAベクターに構築した。AMOTL1スプライシングレポーターは、エクソン11からエクソン13にわたるゲノム配列断片をpcDNA3.1ベクターにクローニングした。Flag-YAP1はpCMVTag2Bベクターにクローニングした。HA-AMOTL1-L/SはpcDNA3.1ベクターに構築した。SRSF3またはAMOTL1のエクソン12を特異的に標的とするshRNAはPLKO.1-puroプラスミドに構築した。全長cDNAはpCDH-puroレンチウイルスベクターに独立してクローニングした。HEK293T細胞にこれらのプラスミドを一時的にトランスフェクションし、レンチウイルスを含む上清を回収してNPC細胞株に感染させ、ピューロマイシン (2 µg/mL) で選択した。
Western blotting: 組織または細胞を氷冷細胞溶解バッファー (Cell Signaling Technology) で溶解し、SDS-PAGEで分離後、PVDF膜 (Merck Millipore) に転写した。5% BSAでブロッキング後、一次抗体と4 °Cで一晩インキュベートし、HRP結合二次抗体と室温で1時間インキュベートした。FdbioDura ECLキット (Fdbio science) で検出した。
免疫組織化学 (IHC) および評価: NPC組織のパラフィン切片を脱パラフィン、再水和後、抗原賦活化のためにクエン酸ナトリウム溶液で煮沸した。内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチ後、一次抗体と4 °Cで一晩インキュベートした。二次抗体と室温で1時間インキュベートし、DAB発色免疫沈降を行った。ヘマトキシリンで対比染色した。IHC評価は染色強度と染色細胞の割合に基づき、SYSUCCの2名の病理医が独立して行った。
免疫蛍光 (IF): ガラス底ディッシュで培養した細胞をPBSで洗浄後、4%パラホルムアルデヒドで固定した。0.1% Triton X-100で透過処理後、5%ヤギ血清でブロッキングし、一次抗体と4 °Cで一晩インキュベートした。二次抗体と室温で1時間インキュベートした。核はDAPIで対比染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡 (Carl Zeiss, Microscope 880) で画像を取得した。
RNA免疫沈降 (RIP): SRSF3とその変異体とAMOTL1のpre-mRNAとの結合を調べるためにRIPを行った。S26細胞にSRSF3-HAおよび関連変異体プラスミドまたは空ベクターを一時的にトランスフェクションした。48時間後、Magna RIPキット (Merck Millipore) を用いてRIPを行い、RT-PCRでRNA濃縮を測定した。
共免疫沈降 (co-IP): HEK293T細胞にHA-AMOTL1-L/SとFlag-YAP1プラスミドをLipofectamine 2000で共トランスフェクションした。48時間後、細胞を細胞溶解バッファーで溶解し、抗Flagまたは抗HA抗体と4 °Cで4時間インキュベートした。プロテインA/Gビーズを添加し、4 °Cで一晩回転させた。ビーズを洗浄後、SDSバッファーで煮沸し、免疫複合体をWestern blottingで解析した。
細胞増殖およびアポトーシス: 細胞増殖曲線のため、S26または5-8F細胞を12ウェルプレートに播種し、24、48、72時間後に細胞数をカウントした。コロニー形成アッセイでは、S26または5-8F細胞を6ウェルプレートに播種し、8-10日間培養した。コロニーを固定、クリスタルバイオレットで染色し、Bio-Rad ChemiDoc Touchで可視化した。細胞アポトーシスアッセイでは、FITC Annexin Vアポトーシス検出キットI (BD Biosciences) を用いてフローサイトメトリーで検出した。
細胞遊走: トランスウェルアッセイでは、NPC細胞を無血清培地中のトランスウェルチャンバーに播種し、10% FBSを含むDMEM培地中の24ウェルプレートに配置した。16-20時間後、膜を通過した細胞を固定、クリスタルバイオレットで染色し、画像化した。創傷治癒アッセイでは、S26または5-8F細胞を12ウェルプレートに播種し、培養インサートを除去して明確な細胞フリーギャップを形成した。0、24、48時間後に倒立顕微鏡 (IX73; Olympus) で撮影した。
In vivo異種移植モデル: 1×10^6^ S26細胞をPBSに再懸濁し、Matrigel (Corning Incorporated) と混合して、6週齢の雄BALB/cヌードマウス (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology) の側腹部に皮下注射した。マウスはSPF環境で飼育し、各群5匹に無作為に分けた。腫瘍体積の測定は週2回行い、4週間後にマウスを屠殺し、腫瘍組織を摘出して重量を測定した。腫瘍体積は「長さ (mm) × (幅 (mm))^2 /2」の式で算出した。全ての動物実験はSun Yat-sen Universityの動物実験倫理委員会によって承認された指示に厳密に従って実施した。
RNA-seq解析: SRSF3 siRNAまたは対照siRNAを48時間トランスフェクションしたS26細胞の総RNAをRNeasy Mini Kit (Qiagen) で単離した。リボソームRNAはRiboZero Magneticキット (Illumina) で除去した。TruSeq RNA Library Prep Kit (Illumina) を用いてライブラリーを構築し、Hiseq Xシーケンサー (Illumina) で150 bpのペアエンドリードでシーケンスした (GSE227503)。遺伝子発現解析にはBowtie 2 Langmead et al. GenomeBiol 2009を用いてリードをヒト参照ゲノム (UCSC hg38) にマッピングした。リボソームRNA除去後、各遺伝子の転写産物発現はHTseq Anders et al. Bioinformatics 2015を用いて定量した。選択的スプライシング解析にはCASHソフトウェアを用いた。PSI (percent spliced in) 値は、インクルージョンまたはエクスクルージョンイベントを支持するリード数に基づいて算出した。
統計解析: 全てのグループデータは平均 ± 標準偏差 (SD) で示した。統計解析はGraphPad Prism version 7を用いて行った。データはStudentの両側t検定で解析した (p<0.05, p<0.01, p<0.001, p<0.0001)。AMOTL1のPSIとSRSF3発現の相関解析にはPearson相関解析を用いた。生存曲線はKaplan-Meier法で算出し、ログランク検定を用いて比較した。