- 著者: Dela Cruz FS, You D, Feinberg TY, Brosius S, Wang X, McCarter JG, Domenico D, Gutiérrez-Abril J, Arango Ossa JE, Gundem G, Walch HS, Chatila WK, Xu J, Li H, Guillan K, Siddiquee A, Silber J, Benhamida J, Linkov I, Ntiamoah P, Sauter JL, Bhanot UK, Jain M, Kombak FE, Medina-Martínez JS, Levine MF, Glodzik D, Gao T, Diolaiti D, Coutinho DF, Rose R, Li S, Stockfisch E, Bouvier N, Roberts RD, Yustein J, Rainusso N, Crompton BD, Ortiz MV, Slotkin EK, Thomas AD, Sait SF, Mattar MS, Meneses M, Rosales N, Kinnaman MD, Rodríguez-Sánchez MI, LaQuaglia MP, Gerstle JT, Iacobuzio Donahue CA, Glade Bender JL, Roehrl MH, Schultz N, Mauguen A, de Stanchina E, Shukla NN, Papaemmanuil E, Kung AL
- Corresponding author: Filemon S. Dela Cruz (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) and Andrew L. Kung (Memorial Sloan Kettering Cancer Center)
- 雑誌: CancerRes
- 発行年: 2026
- Epub日: 2024-01-17
- Article種別: Original Article
- PMID: 38231908
背景
小児がんにおける治療法の開発は、成人のがんに比べて発生率が低いため、疾患特異的なモデルの利用が限られているという課題に直面している。近年、患者由来異種移植片 (PDX) モデルは、がん生物学の解明や治療薬の評価において重要な前臨床ツールとして注目されている (Hidalgo et al. 2014)。PDXモデルは、従来の細胞株や細胞株由来異種移植片 (CDX) モデルとは異なり、元の腫瘍の組織学的特徴や不均一性を保持する特性を持つ (Cassidy et al. 2015)。これにより、PDXモデルは、腫瘍のゲノム的および表現型的特徴を高い忠実度で再現することが示されており (Woo et al. 2021)、小児がんの研究や治療戦略の評価において貴重なプラットフォームとなり得る。
これまでの研究では、小児固形腫瘍のPDXモデルコレクションが開発され、患者腫瘍の組織病理学的特徴やクローン構成を再現することが報告されている (Stewart et al. 2017)。また、小児PDXモデルのゲノム解析により、小児がん全体で観察される組織学的特徴、特徴的な体細胞変異、およびコピー数異常を再現できることが示されている (Rokita et al. 2019)。しかし、これらのモデルの多くは成人のがん種から開発されており、小児がん特有の多様な組織型やゲノム的特徴を網羅するモデルは依然として不足している。特に、超希少がん種や、治療前、治療後、再発時といった異なる病期から樹立された縦断的なモデルの必要性が指摘されている。
このような背景から、小児がんのPDX (Patient-Derived Xenograft) モデルを臨床ワークフローに統合し、広範な診断にわたる再現性のあるモデル生成を可能にする体系的なプログラムの確立が喫緊の課題である。これまでの報告では、PDXモデルの樹立における臨床的、バイオスペシメンレベル、および処理変数の包括的な評価は手薄である。特に、PDXモデルの確立を妨げる要因や、最適な組織処理、輸送、凍結保存条件に関する詳細な検討が不足しており、モデル生成の効率と再現性を向上させるための具体的な指針が未確立であった。本研究は、小児がんのPDXモデルの利用可能性を拡大し、前臨床研究を促進するための、臨床的に統合されたPDXプログラムの確立と、その有用性を示すことを目的とする。
目的
本研究の目的は、小児がんのPDX (Patient-Derived Xenograft) モデルを臨床ワークフローに統合し、その確立を最適化することである。具体的には、以下の点を目的とした。
- PDXモデル生成プロセスを確立された臨床ワークフローに組み込み、組織採取、処理、凍結保存の方法を最適化し、モデル生成の効率と再現性を向上させる。これには、電子医療オーダーシステム (electronic medical order system) の導入や、最適な輸送培地 (HypoThermosol FRS) の特定が含まれる。
- 多様な小児がん種、特に超希少がん種を含む広範なPDXモデルコレクションを構築し、そのゲノム的忠実度を評価する。このコレクションは、40以上の異なる診断を代表し、治療前、治療後、再発時といった異なる病期からの縦断的モデルを含む。
- PDXモデルの樹立が患者の臨床転帰に与える影響を評価し、PDX樹立の予後因子としての可能性を検討する。
- 構築されたPDXモデルコレクションを用いて、バイオマーカー駆動型治療戦略の検証や、新規分子ドライバーの機能解析といった、トランスレーショナル研究におけるPDXモデルの有用性を示す。
- 特に、MTAP (Methylthioadenosine phosphorylase) 欠損腫瘍におけるMAT2A (Methionine adenosyltransferase 2A) 阻害剤AG-270の有効性、および新規RAF1 (RAF proto-oncogene serine/threonine kinase) 融合遺伝子EPB41L2::RAF1 (Erythrocyte membrane protein band 4.1 like 2::RAF proto-oncogene serine/threonine kinase) を有する骨肉腫に対するRAF/MEK阻害剤の治療効果を検証する。
これらの目的を達成することで、小児がんの生物学的理解を深め、新たな治療法の開発に貢献することを目指す。
結果
PDXモデル生成の臨床ワークフローへの統合と最適化: PDX (Patient-Derived Xenograft) モデル生成を臨床ワークフローに統合するため、電子医療オーダーシステムにPDX生成リクエストを組み込んだ。これにより、病理部門とPDX移植チームへの自動通知が可能となり、組織採取と移植の調整が円滑に行われた (Figure 1A)。組織処理時間の短縮も実現し、手術室からPDX移植までの平均処理時間は92.5分から71.1分に短縮された (Figure S1A)。組織処理および保存技術の評価では、新鮮組織（FTF (fresh tumor fragments)/FCS (fresh cell suspension)）は凍結保存組織（CTF (cryopreserved tumor tissue fragments)/CCS (cryopreserved cell suspension)）よりも有意に短い生着時間を示し (p=0.0001)、細胞懸濁液は組織断片よりも迅速に生着した (p<0.0001)。輸送培地の比較では、HypoThermosol FRSが最も高い生着率（100%）を示し、他の培地と比較して統計的に有意な差が認められた (vs RPMI: OR = 107.8, 95% CI: 2.32 - 5013, p = 0.02; vs M166: OR = 55.4, 95% CI: 1.20 - 2557, p = 0.04; vs L15: OR = 77.1, 95% CI: 1.66 - 3577, p = 0.03) (Figure 1C)。
小児PDXポートフォリオの構築と生着率の評価: 2016年11月から2022年12月にかけて、1311の組織サンプルがPDX生成のために採取・移植された。2023年12月までに、262人の患者から388のPDXモデルが樹立され、43の異なる診断を代表するコレクションとなった (Figure 2A, 2B, Table 1)。全体の生着率は29.6%（範囲: 4-420日、中央値: 80日）であった。生着率が高い要因としては、再発状態（診断時24.7%に対し45.4%；OR = 2.32, 95% CI: 1.68 – 3.19, p < 0.0001）および遠隔転移または局所再発疾患（原発部位24.1%に対しそれぞれ43.1%および33.7%；ORmetastatic vs primary site = 2.01, 95% CI: 1.50 – 2.68, p < 0.0001; ORlocal recurrence vs primary site = 1.60, 95% CI: 1.02 – 2.52, p = 0.04）が挙げられた。神経芽腫サンプルでは有意に低い生着率が観察された (OR = 0.214, 95% CI: 0.145 - 0.315, p < 0.0001) (Table 2)。移植までの時間（24時間以内 vs 24時間以上）は生着率に有意な影響を与えなかった (p=0.4) (Figure 2C)。
PDX生着の予後への影響: PDX生着が患者の転帰に影響を与えるか評価するため、562人の小児患者を対象にレトロスペクティブ解析を実施した。生着した腫瘍を持つ患者は、生着しなかった患者と比較して全生存期間が不良であり、36ヶ月生存率はそれぞれ38% (95% CI: 32-45%) vs 72% (95% CI: 67-77%) であった (Figure 2D)。単変量Cox frailtyモデルでは、少なくとも1つの生着モデルの存在は死亡リスクの増加と関連していた (HR = 2.61, 95% CI: 2.04–3.33, p < 0.001)。この関連は、組織型、治療状態、局所再発、転移性疾患で調整した多変量解析でも有意であった (HR = 26.5, 95% CI: 5.09–138, p < 0.001) (Table S4)。
小児PDXモデルのゲノム検証: 患者由来腫瘍と対応するPDXモデル間の変異の忠実度を評価するため、ペアワイズ比較を実施した。SNV (Single Nucleotide Variant)/INDEL (Insertion/Deletion)sでは約85%、構造変異では53%、腕レベルCNV (Copy Number Variant)では60%、遺伝子レベルCNVでは28%の一致が示された (Figure S2A)。PDXモデルでは、元の腫瘍と比較して有意に高い腫瘍純度が観察された (Figure S2C)。SNV/INDELsおよびCNVの両方で、同一腫瘍サンプル由来のExactマッチングペアで最も高い忠実度（SNV/INDELsで87.9%共有、CNVで91.7%共有）が観察された (Figure 3A, 3B)。変異アレル頻度（VAF）の比較では、ソース腫瘍とPDXモデル間で強い相関が認められ、多くの変異が同様の頻度で保持されていることが示された (Figure 3C)。
PDXモデルにおける特徴的な腫瘍特異的分子異常の再現: PDXモデルの分子忠実度を評価するため、主要な小児固形腫瘍タイプにおける反復性ゲノム異常を解析した。骨肉腫およびユーイング肉腫のPDXでは、TP53変異、MYC増幅、EWSR1::ETS融合などの特徴的な異常が保持されていた (Figure S7)。横紋筋肉腫、滑膜肉腫、MPNST (Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor)、DSRCT (Desmoplastic Small Round Cell Tumor)などの軟部肉腫モデルでは、PAX3/7::FOXO1融合、RAS経路変異、SYT::SSX1/2融合、NF1欠失、EWS::WT1融合などのサブタイプ特異的異常が保持されていた (Figure 3F, Figure S7)。神経芽腫PDXコホートでは、モデルの75%（n=18/24）がMYCN増幅を保有しており、これは臨床で観察される頻度（約25%）よりも高かった (Figure S8)。
小児PDXモデルにおけるバイオマーカーガイド型治療評価: MTAP (Methylthioadenosine phosphorylase) 欠損腫瘍におけるMAT2A (Methionine adenosyltransferase 2A) 阻害剤AG-270の有効性を評価した。9つのPDXモデル（骨肉腫n=3、神経芽腫n=2、MPNSTn=2、胚性横紋筋肉腫n=1、退形成性上衣腫n=1）を用いて、p16INK4aおよびMTAPタンパク質発現をIHC (Immunohistochemistry)で評価した (Figure 4A, 4B)。MTAP欠損PDX（n=3 models）では、AG-270治療により対照群と比較して腫瘍体積が減少した (p < 0.0001)。MTAP野生型PDX（n=6 models）では有意な改善は検出されなかった (p = 0.6) (Figure 4C)。疾患進行のリスクは、MTAP欠損モデルのAG-270治療群で対照群と比較して低かった (HR = 0.249, 95% CI: 0.119-0.521, p = 0.0007)。しかし、CDKN2Aステータスと治療群の間に有意な相互作用は検出されなかった (p = 0.6) (Figure 4F)。
新規ドライバーの機能的検証: 骨肉腫患者から樹立されたPDXモデル（MSKOST-48654）を用いて、新規RAF1 (RAF proto-oncogene serine/threonine kinase) 融合遺伝子EPB41L2::RAF1 (Erythrocyte membrane protein band 4.1 like 2::RAF proto-oncogene serine/threonine kinase) の機能的意義を調査した。患者腫瘍の分子プロファイリングにより、TP53のナンセンス変異、CDKN2A/Bの欠失、および新規EPB41L2::RAF1融合が同定され、PDXモデルでも確認された (Figure 5A, 5B, Figure S10A-D)。融合陽性PDXモデルのライセートの免疫沈降により、予測分子量に相当する125 kDaのユニークな融合タンパク質が検出された (Figure 5B, Figure S10D)。in vivoでのRAFおよびMEK阻害剤の評価では、トボラフェニブ、ベムラフェニブ、またはコビメチニブで治療したマウス (n=5 mice per treatment arm) で腫瘍増殖の有意な抑制が観察された (各薬剤vsビヒクル比較でp=0.01)。特にコビメチニブは、ベムラフェニブおよびトボラフェニブと比較して有意な腫瘍体積制御を示した (両比較でp=0.01)。RAF1融合陰性の骨肉腫PDXモデル（MSKOST-13063）では、これらの薬剤による腫瘍増殖の改善は認められなかった (Figure 5E)。
考察/結論
本研究は、小児がんにおけるPDX (Patient-Derived Xenograft) モデルの確立と臨床応用を可能にする統合プログラムを開発し、その有用性を示した。このプログラムは、臨床ワークフローへのPDX生成プロセスの統合、組織採取・処理・凍結保存の最適化、およびモデルのゲノム的忠実度の検証を特徴とする。
先行研究との違い: これまでの小児PDXプログラムは、主に特定の疾患タイプや研究目的のためにモデルを収集してきたが、本研究は、広範な小児がん種を対象とし、臨床ワークフローに深く統合された体系的なアプローチを採用した点で、これまで報告されたものとは異なる。特に、超希少腫瘍タイプや、治療前、治療後、再発時といった異なる病期からの縦断的サンプリングを可能にしたことは、従来のPDXプログラムでは手薄であった領域を補完するものである。また、PDX生着が患者の予後不良と関連するという知見は、他の小児がん研究でも報告されているが、本研究では多変量解析で調整後もその関連が維持されることを示し、生着が腫瘍の生物学的攻撃性を捉える可能性を強く示唆している。
新規性: 本研究で初めて、電子医療オーダーシステムと病理部門との連携を強化することで、PDX生成のための組織採取を効率化し、処理時間を大幅に短縮する統合ワークフローを確立した。また、HypoThermosol FRSが他の輸送培地と比較して有意に高い生着率を示すことを実証し、PDXモデルの樹立における最適な輸送条件を新規に特定した。さらに、新規RAF1 (RAF proto-oncogene serine/threonine kinase) 融合遺伝子EPB41L2::RAF1 (Erythrocyte membrane protein band 4.1 like 2::RAF proto-oncogene serine/threonine kinase) を同定し、その機能的意義を患者由来PDXモデルを用いてin vivoで検証したことは、これまで報告されていない分子ドライバーの治療標的としての可能性を明らかにした点で新規性がある。
臨床応用: 本研究で確立されたPDXモデルコレクションは、分子特性が詳細に解析されており、バイオマーカー駆動型治療戦略の検証に直接的に応用可能である。例えば、MTAP (Methylthioadenosine phosphorylase) 欠損腫瘍におけるMAT2A (Methionine adenosyltransferase 2A) 阻害剤AG-270の有効性評価は、CDKN2A欠失がMTAP欠損の代用バイオマーカーとして臨床試験で用いられる現状に対し、MTAPタンパク質発現による直接的な評価の重要性を示唆する。これは、より正確な患者層別化と治療選択に繋がる臨床的意義を持つ。また、新規RAF1融合遺伝子に対するRAF/MEK阻害剤の治療効果の検証は、個別化医療の推進に貢献し、将来的に臨床現場での治療選択肢を拡大する可能性を秘めている。
残された課題: 今後の検討課題として、PDXモデルにおけるゲノム的忠実度のより高解像度な評価が挙げられる。本研究ではターゲットシーケンスデータを用いたが、全ゲノムシーケンスやRNAシーケンス、シングルセル解析など、より包括的なアプローチを用いることで、サブクローンレベルの不均一性や進化の動態を詳細に解析する必要がある。また、MTAP欠損とMAT2A阻害剤の感受性に関する探索的解析では、MTAPステータスと治療群の間に統計的に有意な相互作用が検出されなかった。これは、限られたモデル数によるものか、あるいはMTAPステータス以外の要因が感受性に影響を与えている可能性があり、より大規模なコホートでの検証が残された課題である。さらに、確立されたPDXモデルが、その後の継代で再生着に失敗する二次的な生着失敗（secondary engraftment failure）が観察されており、この現象のメカニズム解明と克服も今後の重要な研究課題である。
方法
本研究では、小児がんのPDX (Patient-Derived Xenograft) モデルを確立し、その特性を評価するために、以下の方法を用いた。
患者同意と組織採取: 臨床的に必要な処置（外科的生検、画像ガイド下生検、腫瘍切除術）を受ける患者から、MSK (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) 臨床シーケンス（MSK-IMPACT, IRB#12-245, NCT01775072）およびバイオスペシメン研究（IRB#06-107）への書面によるインフォームドコンセントを得た。未成年者については、親または法的保護者から同意を得た。剖検検体は、Last Wish Program（IRB#15-021）を通じて取得した。すべての研究はMemorial Sloan Kettering Cancer CenterのInstitutional Review Boardの承認を得て、ヘルシンキ宣言に従って実施された。
患者腫瘍処理とPDX生成: 外科的に切除された検体および生検組織は、臨床診断のために病理部門に提出された。臨床検査後に十分な組織が残った場合、余剰組織はPDX腫瘍モデル生成および腫瘍組織のバイオバンキングのために研究用途に割り当てられた。組織処理ワークフローの最適化のため、手術室からPDX移植までの各段階での時間測定を行い、効率化を図った。PDX生成には、腫瘍組織を室温で維持した後、直ちに免疫不全マウス（NSGマウス、Jackson Laboratory, Strain #005557）に移植するか、4℃のHypoThermosol FRSに保存した。腫瘍断片（1-2 mm）をマウスの皮下ポケットに移植した。あるいは、腫瘍組織をマセレートして組織スラッシュにするか、酵素的に解離させて単一細胞懸濁液にしてから皮下移植した。初期のPDX樹立には2×10^5～2×10^6個の生細胞を移植し、継代には1～3×10^6個の細胞を移植した。移植マウスは腫瘍生着と増殖について綿密にモニタリングされた。腫瘍体積が約1000～1500 mm^3に達するか、マウスが苦痛の兆候を示した場合、マウスは安楽死させられ、腫瘍は解剖、断片化、または解離され、最大5継代まで追加のマウスに反復的に移植された。
PDX腫瘍輸送および凍結保存の最適化: 輸送、一時保存、および生体凍結保存条件を最適化するため、12のPDX腫瘍由来組織をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に採取した。腫瘍組織は1-2 mmの断片に切断するか、酵素的に解離させてからNSGマウスに皮下移植した。並行して、断片化または解離した組織は、DMEM F12培地（10% FBS、10% DMSO含有）中で凍結保存された。凍結保存サンプルは7日間液体窒素保存後、解凍されNSGマウスに移植された。また、4種類の輸送培地（RPMI, M199, L15, HypoThermosol FRS）を用いて、新鮮な断片化腫瘍組織の輸送実験を行った。
PDXモデルのゲノム検証: PDX腫瘍サンプルは、MSK-IMPACTターゲットシーケンスパネルを用いてシーケンスされた。データ管理、バイオインフォマティクス解析、およびデータ可視化はIsablを用いて処理された。生シーケンスデータは、まずdisambiguate (v. 1.0.1) を用いてマウス特異的および曖昧なリードを除去した。リードはBWA-MEMアルゴリズム (v. 0.7.17) を用いてヒトGRCh37参照ゲノムにアラインされた。SNV (Single Nucleotide Variant)はcgpCaVEMan (v. 1.7.4)、Mutect (v. 4.0.1.2)、Strelka (v. 2.9.1) を用いてコールされた。構造変異はDelly (v. 0.7.8)、Svaba (v. 0.2.1)、BRASS (v. 4.0.5)、GRIDSS (v. 1.5.1) の4つのアルゴリズムを用いてコールされた。患者腫瘍とPDXのゲノムプロファイルの非教師あり階層的クラスタリング解析は、Wardの連結法を用いてSciPy Pythonパッケージ (v. 1.7.3) で実施された。
遺伝子融合転写産物の検証: MSK-IMPACT遺伝子パネルに含まれない融合癌遺伝子は、RT-PCRにより検証された。全RNAはRNeasyキット（QIAGEN）を用いて単離され、cDNAはSuperScript IV One-Step RT-PCRキット（Invitrogen）を用いて生成された。
免疫沈降およびウェスタンブロット: EPB41L2::RAF1 (Erythrocyte membrane protein band 4.1 like 2::RAF proto-oncogene serine/threonine kinase) 免疫沈降のため、PDX腫瘍組織からタンパク質ライセートを調製した。RAF1 (RAF proto-oncogene serine/threonine kinase) およびEPB41L2 (Erythrocyte membrane protein band 4.1 like 2) はDynabeads Protein G Immunoprecipitation Kitを用いて免疫沈降された。ウェスタンブロットでは、RIPAバッファーを用いて総タンパク質ライセートを調製し、NuPAGE 4-12% Bis-Trisゲルで電気泳動後、ニトロセルロース膜に転写した。
免疫組織化学 (IHC): 患者腫瘍組織生検はホルマリン固定パラフィン包埋された。MTAP (Methylthioadenosine phosphorylase) およびp16INK4a IHCのため、組織切片はLeica Bond染色プラットフォームを用いて処理された。
PDX in vivo研究: MAT2A (Methionine adenosyltransferase 2A) 阻害剤AG-270の腫瘍アグノスティックな治療効果評価では、9つのPDXモデルが用いられた。AG-270は100 mg/kgで14日間経口投与された。新規EPB41L2::RAF1融合イベントのin vivo有効性研究では、骨肉腫PDXモデルにビヒクル、トボラフェニブ、ベムラフェニブ、コビメチニブを投与した。治療はPDX腫瘍が150-250 mm^3に達した時点で開始され、腫瘍体積により層別化された。
統計解析: 解析は両側検定で有意水準0.05を用いて実施された。組織処理時間の比較には独立サンプルt検定を用いた。生着結果と保存方法、輸送培地との関連は、GEE (Generalized Estimating Equations) 線形またはロジスティック回帰を用いて評価された。PDX生着の患者転帰への予後効果を評価する生存解析では、全生存期間（OS）はKaplan-Meier法で推定され、単変量および多変量frailty Coxモデルを用いて解析された。MAT2A阻害の動物転帰への影響を評価する研究では、相対腫瘍体積（RTV）はGEE線形回帰を用いて比較された。無増悪生存期間（PFS）はCox比例ハザードモデルを用いて解析された。RAF阻害剤研究では、腫瘍増殖曲線はVardiの検定を用いて比較された。多重比較はBenjamini-Hochberg法を用いて補正された。