- 著者: Yusaku Watanabe, Kiyoshi Yoshimura, Koichi Yoshikawa, Ryoichi Tsunedomi, Yoshitaro Shindo, Sou Matsukuma, Noriko Maeda, Shinsuke Kanekiyo, Nobuaki Suzuki, Atsuo Kuramasu, Kouhei Sonoda, Koji Tamada, Sei Kobayashi, Hideyuki Saya, Shoichi Hazama, Masaaki Oka
- Corresponding author: Masaaki Oka (Department of Digestive Surgery and Surgical Oncology, Yamaguchi University School of Medicine, Ube, Yamaguchi, Japan)
- 雑誌: International Journal of Oncology
- 発行年: 2014
- Epub日: 2014-08-14
- Article種別: Original Article
- PMID: 25118635
背景
がん幹細胞 (CSC: Cancer Stem Cell) は、自己複製能、多分化能、抗がん療法耐性、および遠隔臓器への転移能を持つ細胞集団であり、がんの再発や治療抵抗性の主要な原因と考えられている (Reya et al. 2001; Visvader and Lindeman 2008)。従来の化学療法や放射線療法は、主に増殖の速い腫瘍細胞を標的として開発されてきたが、CSCに対しては効果が限定的であり、標準的な化学療法剤に対して高い耐性を示すことが報告されている (Costello et al. 2000; Dean et al. 2005)。特に膵臓がんは、世界的に5年生存率が10%未満と極めて予後不良ながんであり (Siegel et al. 2012)、肝転移を有する患者の予後は極めて厳しい。そのため、CSCを標的とした新規治療法の開発が喫緊の課題である。
CSCは、CSC特異的な細胞表面マーカーの発現、Hoechst 33342排出によるサイドポピュレーション表現型の検出、浮遊スフェア形成能の評価など、様々な方法で同定・単離されてきた (Li et al. 2007; Hermann et al. 2007; Eramo et al. 2008)。しかし、腫瘍検体中のCSC比率は極めて低く、その生物学的特性の解明や、CSCを標的とした薬剤スクリーニング、新規治療法の開発を大きく阻害する要因となっていた。この問題は、CSC研究における重要な知識ギャップ (knowledge gap) として認識されている。
これまでのスフェア培養法は、血清を含まない培地中でEGF (Epidermal Growth Factor) やbFGF (basic Fibroblast Growth Factor) などの増殖因子を添加することでCSCを富化できることが示されてきた (Lee et al. 2006; Zhong et al. 2010)。しかし、スフェア培養を10日以上継続すると、CSC特性の自然分化や細胞死が問題となり、安定したCSC集団の長期維持が困難であった (Pollard et al. 2009)。この課題を克服し、安定的に十分な数のCSCを供給できる培養法の確立が強く求められていた。特に、神経幹細胞培地に含まれる神経刺激因子であるNSF-1 (Neural Cell Survival Factor-1) やLIF (Leukemia Inhibitory Factor) がCSCの維持に寄与する可能性はこれまで報告されておらず、この点が未解明な領域として残されていた。本研究は、この知識ギャップを埋めることを目指し、神経幹細胞培地をベースとした新規培養法を開発することで、P-CSLC (Pancreatic Cancer Stem-Like Cell) と称する膵臓がん幹細胞様細胞の富化と安定的な維持を可能にすることを目指した。従来の方法では、十分な細胞数と未分化状態の維持を両立させることが技術的に困難であり、研究に必要な細胞供給量が圧倒的に不足していた。
目的
本研究の目的は、ヒト膵臓がん細胞株から膵臓がん幹細胞様細胞 (P-CSLC) 富化集団を誘導するための新規培養法を確立し、その幹細胞特性を詳細に評価することである。具体的には、神経幹細胞培地をベースに、EGF、bFGF、LIF、NSF-1、およびN-アセチルシステインを含むCSC誘導培地と、ラミニンコートディッシュを組み合わせた培養系を開発する。この培養系を用いて誘導された細胞集団について、細胞表面マーカー (CD24, CD44)、ESA (Epithelial Specific Antigen)、CD44v (CD44 variant)、ALDH (Aldehyde Dehydrogenase) 活性、細胞周期、幹細胞および上皮間葉転換 (EMT: Epithelial-Mesenchymal Transition) 関連遺伝子の発現、ならびにin vivoでの腫瘍形成能を解析し、P-CSLCとしての特性を包括的に検証する。また、CSC誘導培地におけるNSF-1およびLIFのP-CSLC誘導への必須性を確認するとともに、培養上清中のサイトカイン・ケモカインプロファイルを解析し、P-CSLCの微小環境特性を明らかにすることも目的とする。
結果
P-CSLC富化集団の安定誘導とNSF-1・LIFの必須性: YPk2およびYPk5細胞をCSC誘導培地 (EGF, bFGF, LIF, NSF-1, N-アセチルシステイン含有) で培養すると、数時間以内にスフェアが形成された (YPk2-Sp, YPk5-Sp) (Figure 1)。これらのスフェアは7日以内に大きなスフェアクラスターへと成長した。7日目にスフェアを回収し、ラミニンコートディッシュに移して培養を継続すると、細胞は数時間以内に接着し始め、その後約2ヶ月間、接着細胞とスフェア状細胞の両方の形態を維持しながら安定的に増殖した (YPk2-Lm, YPk5-Lm) (Figure 1)。この培養系により、従来のスフェア培養で問題となっていた10日以上での自然分化や細胞死を克服し、長期安定的なP-CSLCの供給が可能となった。特筆すべきは、CSC誘導培地からNSF-1またはLIFのいずれかを省略した場合、CD24low/CD44low細胞が優勢となり、P-CSLCの誘導に失敗したことである (Figure 2)。この結果は、NSF-1とLIFがP-CSLCの誘導および維持に必須の因子であることを明確に示している。
CSC表面マーカー (CD24/CD44/ESA/CD44v) の有意な増加: P-CSLC富化集団 (YPk2-Lm, YPk5-Lm) において、CSC特異的表面マーカーの発現が大幅に増加した。親細胞であるYPk2およびYPk5では、CD24high/CD44high細胞の比率は約0.1%であった (Figure 2)。これに対し、YPk2-Lmでは7.5±2.6% (p=0.0211、親細胞比約75-fold増加)、YPk5-Lmでは11.1±2.8% (p=0.0211、親細胞比約111-fold増加) へと有意に増加した (n=3 independent experiments; Figure 2)。さらに、FACSソーティングにより単離されたYPk2-SortLmおよびYPk5-SortLmでは、ESA発現率がそれぞれ23.2%および36.2%に達し、親細胞の0.1%と比較して著しい富化が認められた (Figure 2)。また、近年CSCにおける役割が注目されているCD44vの発現も評価した。YPk2親細胞ではCD44v発現率はわずか0.2%であったが、YPk2-Lmでは16.7%、YPk2-SortLmでは99.8%にまで増加した (Figure 2)。YPk5-SortLmでも同様にCD44vの高発現が確認され (Figure 2)、誘導された細胞集団が多様なCSCマーカーを高発現していることが示された。
ALDH活性の上昇と細胞周期G0/G1期への偏在: ALDH活性は、CSCの化学療法耐性や自己複製能と密接に関連する機能的マーカーである。親細胞であるYPk2およびYPk5は、それぞれ68.5%および54.6%のALDH活性を示したが、ラミニンコート培養後のYPk2-LmおよびYPk5-Lmでは、さらに高いALDH活性 (YPk2-Lm: 93.4%、YPk5-Lm: 92.0%) を示した (Figure 3)。この結果は、誘導されたP-CSLCが機能的なCSC特性を保持していることを強く示唆する。細胞周期解析では、YPk2-LmおよびYPk5-Lmが親細胞と比較してG0/G1期に偏在する傾向を示した (Figure 4)。統計的な有意差は認められなかったものの、多くのCSCが非増殖性のG0期に留まることが知られており、この傾向はP-CSLCが比較的静止状態にあることを示唆している。
優れた腫瘍形成能と幹細胞・EMTマーカーの高発現: 誘導されたP-CSLCは、in vivoにおいて親細胞よりもはるかに高い腫瘍形成能を示した。YPk2-SortLm細胞は、わずか10^3個 (n=10^3 cells) の細胞を移植するだけで、3匹中3匹のマウス (n=3 mice) に腫瘍を形成した。これに対し、YPk2親細胞では10^3個の細胞移植では腫瘍形成は認められず、10^4個 (n=10^4 cells) の細胞を移植した場合に一部で腫瘍が形成されるに留まった。この結果は、P-CSLCが極めて高い腫瘍形成能、すなわちがん開始細胞としての能力を有することを明確に実証している。 リアルタイムRT-PCRによる遺伝子発現解析では、幹細胞マーカーであるKITおよびALDH1A1が、YPk2-Lm (KIT: p=0.0095, ALDH1A1: p=0.0022) およびYPk5-Lm (KIT: p=0.0022, ALDH1A1: p=0.0049) の両方で親細胞と比較して有意に高発現していた (Figure 5)。NANOGもYPk2-Lmで有意に高発現していた (p=0.005)。さらに、EMT関連遺伝子であるCDH2、VIM、SNAI1、SNAI2、ZEB1、ZEB2、およびFN1は、YPk2-Lmにおいて全て有意に高発現しており (全てp=0.0022)、YPk5-LmではSNAI1 (p=0.026) およびZEB2 (p=0.0087) が有意に高発現していた (Figure 5)。これらのEMT関連遺伝子の高発現は、誘導されたP-CSLCが転移能の高い特性を獲得している可能性を示唆する。一方で、上皮関連遺伝子であるCDH1 (E-cadherin) はYPk2-Lmで有意に高発現したが (p<0.05)、YPk5-Lmでは有意差がなかった (Figure 5)。
P-CSLC培養上清の独特なサイトカイン・ケモカインプロファイル: Bioplexアッセイによる培養上清中のサイトカイン・ケモカインの測定結果は、P-CSLCとその親細胞の微小環境シグナルが質的に異なることを示した (Figure 6)。P-CSLC培養上清 (Sup-Lm2, Sup-Lm5) では、bFGF、IL-9、IP-10 (interferon gamma-induced protein 10)、およびRANTES (regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted) のレベルが親細胞培養上清 (Sup-YPK2, Sup-YPK5) と比較して有意に高かった (p<0.05)。G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor) もSup-Lm2で有意に高値であり (p=0.02)、Sup-Lm5でも高値傾向を示した (p=0.06)。これに対し、親細胞培養上清では、TGF-β1、TGF-β3、IL-5、IL-12、およびPDGF-BBのレベルがP-CSLC培養上清よりも有意に高かった (p<0.01〜p=0.04)。この結果は、CSCの維持と増殖には特定のサイトカイン・ケモカイン環境が重要であり、神経系サイトカインがCSCニッチの維持機構に関与する可能性を示唆している。
考察/結論
先行研究との違い: 本研究で確立された培養法は、従来のスフェア培養法と異なり、スフェア形成後にラミニンコートディッシュへと細胞を接着させる2段階の培養プロセスを採用している。従来法では10日以上の培養でCSC特性の自然分化や細胞死が避けられなかったのに対し、本法では2ヶ月以上の長期にわたり未分化状態と高い生存能を維持したままP-CSLCを安定的に増殖させることが可能となった。
新規性: 本研究で初めて、神経系幹細胞の維持に関与するNSF-1およびLIFが、膵臓がん細胞からのP-CSLC誘導およびその維持において必須の因子であることを明らかにした。また、P-CSLCが独自のサイトカイン・ケモカイン分泌プロファイル (bFGF, IL-9, IP-10, RANTES, G-CSFの高分泌) を有し、親細胞とは異なる微小環境ニッチを自律的に形成していることを新規に示した。
臨床応用: 本培養法は、希少なCSCを約100倍に富化させて大量に安定供給できるため、臨床応用への道を開くものである。具体的には、CSC特異的抗原を同定するためのプロテオミクス解析や、患者由来の免疫エフェクター細胞を用いたCSC排除能の評価プラットフォーム、さらにはCSCを標的とした新規免疫療法や分子標的薬のハイスループットスクリーニングへの臨床的有用性が期待される。
残された課題: 今後の検討課題として、本培養法が細胞株だけでなく、新鮮なヒト膵臓がん患者の臨床組織検体に対しても同様に適用可能であるかどうかの検証が必要である。また、NSF-1やLIFがP-CSLCの幹細胞特性を維持する下流の分子シグナル経路の解明や、誘導されたP-CSLCの既存の化学療法剤に対する薬剤感受性プロファイルのより詳細な解析が今後の課題として残されている。さらに、本培養系がPD-L1発現やT細胞認識回避機構にも影響を与えるかどうかの解析を通じ、P-CSLCを標的とした免疫療法の開発につなげることも重要な展望である。
方法
細胞株と培養条件: 山口大学で樹立されたヒト膵臓がん細胞株 YPk2 および YPk5 (human pancreatic cancer cell lines, established at Yamaguchi University; Yamamoto et al. 2002) を用いた。これらの細胞株は、DMEM-F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) 培地に10%熱不活化 FBS (fetal bovine serum; Life Technologies) を添加し、37℃、5% CO2条件下で維持した。
P-CSLC誘導培養: まず、YPk2およびYPk5細胞を、神経幹細胞培地をベースとした無血清CSC誘導培地で培養した。この基礎培地はDMEM-F12に10 mM HEPES、1X抗生物質・抗真菌溶液、0.6%グルコース、1 mg/mlトランスフェリン、250 μg/mlインスリン、0.6 mMプトレシン、0.3 μM亜セレン酸ナトリウム、0.2 μMプロゲステロンを添加したものである。これに2 μg/mlヘパリン、20 ng/ml EGF (Sigma-Aldrich)、20 ng/ml bFGF (Merck Millipore)、10 ng/ml LIF (Merck Millipore)、1/50容量のNSF-1 (Lonza)、および60 μg/ml N-アセチル-L-システイン (Sigma-Aldrich) を加えてスフェア形成を誘導した (YPk2-Sp, YPk5-Sp)。数時間以内にスフェアが形成され、7日間培養した。
ラミニンコートディッシュでの長期培養: 7日後、形成されたスフェア細胞 (YPk2-Sp, YPk5-Sp) を回収し、ラミニンコートディッシュに移した。この際、20 μl/ml B27サプリメント (Life Technologies)、1X抗生物質・抗真菌溶液、75 μg/ml BSA (bovine serum albumin; Sigma-Aldrich)、10 ng/ml EGF、および10 ng/ml bFGFを含むスフェア培養培地を用いた。培地は7日ごとに50%交換し、約2ヶ月間培養を継続した (YPk2-Lm, YPk5-Lm)。
フローサイトメトリー解析とソーティング: 解離した細胞をPBS/2%FBSで2回洗浄後、10^6細胞/100 μlの濃度で再懸濁した。抗CD44-APC (eBioscience)、抗CD24-PE (Beckman Coulter)、抗ESA-FITC (GeneTex)、および抗CD44v抗体を用いて20分間氷上でインキュベートした。MACSQuantアナライザー (Miltenyi Biotec) で解析し、FlowJoソフトウェア (TreeStar) で結果を分析した。CD24high/CD44high細胞はFACSAria III (BD Immunocytometry Systems) を用いてソーティングし、YPk2-SortLmおよびYPk5-SortLmと称した。NSF-1またはLIFを欠いた培地での培養も行い、P-CSLC誘導への影響を評価した。
ALDH活性測定: Aldefluorアッセイキット (StemCell Technologies) を製造元の指示に従って使用した。細胞をAldefluorアッセイバッファー (1x10^6細胞/ml) に懸濁し、Aldefluor基質と共に37℃で45分間インキュベートした。陰性コントロールとして、特異的ALDH阻害剤である1.5 mM DEAB (diethylaminobenzaldehyde) を添加したサンプルも用意した。MACSQuantアナライザーの緑色蛍光チャネル (FL1) で解析し、FlowJoソフトウェアで分析した。
細胞周期解析: BD Biosciencesの推奨プロトコルに従い、細胞周期解析を実施した。細胞をトリプシン処理後、PBSで2回洗浄し、70%冷エタノールで固定した。固定細胞はPI/RNase染色バッファー (BD Biosciences) で染色し、室温で15分間インキュベート後、MACSQuantアナライザーで解析した。
異種移植モデル: 免疫不全マウスとして Rag-/-IL-2共通γ鎖-/-マウス (Jackson Laboratory) を使用し、皮下移植による腫瘍形成能を評価した。10^3または10^4個の細胞をマウスの左下腹部に皮下接種した (n=3 mice)。すべての動物実験は山口大学の動物実験委員会ガイドラインに従って実施された。
半定量的リアルタイムRT-PCR: 幹細胞関連遺伝子 (KIT, ALDH1A1, NANOG) および上皮間葉転換 (EMT) 関連遺伝子 (CDH1, CDH2, VIM, FN1, SNAI1, SNAI2, ZEB1, ZEB2) の発現レベルをRT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) で評価した。TRIzol試薬 (Life Technologies) でRNAを抽出し、PrimeScript RT試薬キット (Takara Bio) で逆転写を行った。リアルタイムPCRはLightCycler 480 Probe Master (Roche Diagnostics) とUniversal ProbeLibraryプローブ (Roche Diagnostics) を用いてLightCycler System Version 3 (Roche Diagnostics) で実施した。GAPDHおよびβ-アクチン (ACTB) を参照遺伝子として、ΔΔCt法で相対的なmRNAレベルを算出した。
サイトカイン・ケモカインレベルの測定: YPk2およびYPk5の培養上清 (Sup-YPK2, Sup-YPK5) と、ラミニンコートディッシュで1ヶ月培養したYPk2-LmおよびYPk5-Lmの培養上清 (Sup-Lm2, Sup-Lm5) を回収した。Bioplexアッセイ (Bio-Rad) を用いて、TGF-β (transforming growth factor-beta)、IL-1b、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、エオタキシン、bFGF、G-CSF、GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)、IFN-γ (interferon-gamma)、IP-10、MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1)、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB (platelet-derived growth factor-BB)、RANTES、TNF-α (tumor necrosis factor-alpha)、VEGF (vascular endothelial growth factor) の28種類のサイトカイン・ケモカインのタンパク質レベルを測定した。サンプルは3連 (n=3 replicates) で分析した。
統計解析: 結果は平均値±標準偏差で示し、Mann-Whitney U検定を用いて統計的有意差を評価した。P値が0.05未満の場合を有意差ありと判断した。