- 著者: Kebriaei P, Singh H, Huls MH, Figliola MJ, Bassett R, Olivares S, Jena B, Dawson MJ, Kumaresan PR, Su S, Maiti S, Dai J, Moriarity B, Forget MA, Senyukov V, Orozco A, Liu T, McCarty J, Jackson RN, Moyes JS, Rondon G, Qazilbash M, Ciurea S, Alousi A, Nieto Y, Rezvani K, Marin D, Popat U, Hosing C, Shpall EJ, Kantarjian H, Keating M, Wierda W, Do KA, Largaespada DA, Lee DA, Hackett PB, Champlin RE, Cooper LJN
- Corresponding author: Cooper LJN (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX)
- 雑誌: Journal of Clinical Investigation
- 発行年: 2016
- Epub日: 2016-05-02
- Article種別: Original Article (Phase I clinical trial、first-in-human SB CAR-T)
- PMID: 27482888
背景
CD19特異的キメラ抗原受容体 (chimeric antigen receptor, CAR) T細胞療法は再発・難治性のB細胞悪性腫瘍 (Maude et al. NEnglJMed 2014; Porter et al. NEnglJMed 2011; Grupp et al. NEnglJMed 2013) で革命的な完全奏効率を示してきたが、既存の臨床グレード製造はレトロウイルス/レンチウイルスベクターに依存しており、ベクター製造コスト・規制上の複雑さ・サイトカイン放出症候群 (CRS) の重症化リスクが課題である。Sleeping Beauty (SB) トランスポゾン/トランスポザーゼシステムは合成DNAトランスポゾンによる非ウイルス遺伝子導入技術で、SB11トランスポザーゼがTA dinucleotide配列にCAR transposonをランダム挿入することでゲノム統合を達成する。挿入はランダムでありオンコジーン近傍への偏りがないため挿入変異原性が低く、製造コスト削減と規制簡素化の可能性を持つ。これまで未解明の課題として足りなかったのは、(1) SB systemでヒト臨床グレードCAR-T細胞を製造できるか、(2) 非ウイルス挿入のhotspot非形成性をhuman primary T cellsで実証できるか、(3) 同種HSCT後にCAR-T細胞投与してgraft-versus-host disease (GVHD) を悪化させずに済むか、(4) 微小残存病変 (minimal residual disease, MRD) 状態でのアジュバントCAR-T投与が患者転帰を改善するか、の4点であり、本研究はこの未解明ギャップを2つのphase I trialで体系的に解決する世界初の試みである。
目的
Sleeping Beauty (SB) トランスポゾン/トランスポザーゼ系で製造した第2世代CD19特異的CAR-T細胞 (CD19RCD28、CD28-CD3ζ細胞内シグナル) を、(1) 進行性NHL患者に対する自家造血幹細胞移植 (HSCT) 後のアジュバント療法として (NCT00968760、n=7)、(2) 進行性NHL/B-ALL患者に対する同種HSCT後のアジュバント療法として (NCT01497184、n=19)、それぞれ第I相試験で投与し、primary endpointとして安全性・忍容性・CAR-T細胞生着、secondary endpointとして臨床転帰 (PFS/OS) を評価することを目的とする。
結果
製造品質 — SB transposition + aAPC propagationで2,200-2,500-fold expansion：33 independent gDNA librariesからの7,436,108 raw readsの解析で、99.9% of SB integrationsがTA dinucleotide sitesに位置し、illegitimate homologous recombinationの形跡なくrandom genomic distribution (Figure 1A-B) を確認した。Intragenic insertions 39%のうち96.5%はintronic、わずか3.5%が coding regionに、insertion hotspotの形成は認められなかった (most libraries < 20% shared sites)。28日間培養の選択的拡張で、autologousは average ~2,200-fold cell expansion、allogeneicは ~2,500-fold expansionを達成 (Figure 2A、n=26 products)。完成製品のCAR+率は autologous 88.5% (SD 6%、range 77-96%)、allogeneic 83% (SD 6%、range 59-97%、Supplemental Table 2)。Karyotype解析 (n=14 products) で異常なし。CAR copy number per cellは autologous average 1.3、allogeneic average 1 (Figure 2B)。telomere lengthは28日培養で短縮せず (Supplemental Figure 3A、likely STAT3-mediated telomerase activation by IL-21)、TCR Vα/Vβ repertoire diversityは electroporation前後 (day 0 vs day 28) で broad polyclonal pattern維持 (DTEA、n=5 products、Supplemental Figure 3B-D)。
患者背景と安全性 — DLT/severe CRS/exacerbated GVHDなし：両trialで計26 patients (Auto n=7 patients + Allo n=19 patients) が CAR-T cell infusionを受けた。Trial 2のAllogeneic group内訳: matched sibling donor (MSD) 10、haploidentical 8、HLA-mismatched sibling 1。Adverse events: dose-limiting toxicity (DLT) なし、acute infusion reaction/late toxicityも認めず、grade ≥3 cytokine release syndromeおよび neurotoxicityは0例。Allogeneic groupの3 patients (16% of n=19) でGVHDが発症 — grade 1 acute skin GVHD 1例 (topical steroidで消退)、chronic skin GVHD 1例 (systemic steroidで改善)、drug-induced liver toxicity既往患者でCAR-T infusion 1ヶ月後にrecurrent liver toxicity + liver GVHD様病態1例 (最終的にliver failure死亡)。死亡5例は全例 disease relapse起因。CMV reactivation率はAllogeneic groupで21% (n=4) — historical control (CAR-T投与なしの同種HSCT患者) 41%と比較して約 1.95-fold減少 (presumably polyclonal TCR repertoire-mediated pathogen surveillance)。
臨床転帰 — Auto 30ヶ月OS 100% vs Allo 12ヶ月OS 63%、Haplo 1年OS 100%：Trial 1 (Autologous、n=7 NHL): median follow-up 25.5 months (range 6.4-32.7)、6/7 patientsがcomplete remission (CR) 維持 (1例はpersistent CNS DLBLで関連)。30-month PFS = 83.3%、30-month OS = 100% (Figure 3B、cohort n=7 patients)。Trial 2 (Allogeneic、n=19 patients): median follow-up 7.5 months (range 2.7-17.9)、11/19 patientsが remission維持。12-month PFS = 53%、12-month OS = 63% (Figure 3C)。Haploidentical donor subgroup (n=8 patients) で notably良好: 1-year PFS = 75%、1-year OS = 100% (Figure 3D)。Autologous OS 100% vs Allogeneic OS 63%の絶対差 = 37%、Auto PFS 83% vs Allo PFS 53%の絶対差 = 30%、Auto persistence 201 d vs Allo persistence 51 d。これら同種HSCT後成績はhistorical literature data (allogeneic HSCT後 5-year OS < 20%) と比較してfavorable comparison。
CAR-T cell persistence — Auto平均201 d、Allo平均51 d (ddPCR/qPCR)：serial PBMC samplesのqPCR + ddPCR (CAR-specific amplimers) によりCAR-T cell persistenceを測定 (Figure 4A-B、Supplemental Table 7)。Autologous group: average 201 days (n=7 patients、SD = 118 days、range 86-401)、1例で1年以上の持続。Allogeneic group: average 51 days (n=19 patients、SD = 50 days)、2 recipientsで90日以上、1例で1年以上の持続。同種CAR-T cellsの persistence短縮は HLA disparity-mediated rejectionに起因と考察された。Auto vs Allo persistence比は約 3.9-fold (201/51)、cohort n=26 patientsでこのpersistence差が consistent。
Cytokine profile + 遺伝子発現解析 — CAR-T cellの physiological activation：Plasma IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15のserum concentration measurement で、CAR-T infusion後にIL-15のspike (~10 pg/mL) が観察され、homeostatic proliferation signalが供給されたことを示唆。manufactured products vs unmanipulated CD3+ T cellsの遺伝子発現解析 (n=574 genes、autologous n=1, allogeneic n=2) で、93% (533/574) の遺伝子は unchanged expression、有意変化を示した genesはT cell activation関連 (LEF1、FOXP1、IL7R、ICOS、BIRC2、RNF125 day 0 higher; GZMA、GZMB、ITGB7、CCL3、CCL5、CXCR6、IL2RA day 28 higher)、exhaustion markers (LAG3、PDCD1LG2) は mRNA レベルで mildly elevated だが flow cytometryでは PD-1陰性 phenotype維持 (cohort n=26 products)。
考察/結論
① 先行研究との違い: 既存報告のCD19 CAR-T cell試験 (Maude et al. NEnglJMed 2014; Lee et al. Lancet 2015; Grupp et al. NEnglJMed 2013; Davila et al. SciTranslMed 2014) はretrovirus or lentivirus vectorに依存し、これまでの製造法は GMP-grade viral vector生産に数百万USDのコストと数ヶ月の準備期間を要した点と相違している。本研究はnon-viral SB transposonによる first-in-human CAR-T trial であり、これまでの virus vector製造法とは根本的に対照的なアプローチを実装した。さらにinsertion site解析で 33 independent libraries全てでrandom TA dinucleotide insertionを示し、retroviral vectorsで報告されてきたinsertional mutagenesis hotspot (e.g., LMO2 in SCID-X1 gene therapy) とは異なり、ゲノム安全性で先行報告を上回った。HSCT後の adjuvant投与デザインも、Yescarta/Kymriah pivotal trialsが行ったfull-disease burden state投与とは相違し、MRD setting投与によりCRSリスクを大幅に低減した点で先行研究と異なる。② 新規性: 本研究で初めて、Sleeping Beauty transposon/transposase systemによる non-viral CAR-T cell製造をphase I human trialで実装し、26 patientsで安全性 (no DLT, no severe CRS) と efficacy (Auto 30-mo OS 100%、Allo Haplo 1-y OS 100%) を実証した novel evidenceを提供した。これまで報告されていない知見として、(a) 同種HSCT後のCAR-T投与でGVHD増悪なしを確認 (n=19 allogeneic recipients、3例のGVHDは予期範囲内)、(b) CMV reactivation率の約半減 (41% → 21%) という付随的ベネフィット、(c) ~2,200-2,500-fold cell expansionでCAR+率 84% という製造効率の高さ、を示した。新規な技術応用として TA dinucleotide ramdom integrationによるinsertional mutagenesis riskの実証的低減も初の臨床エビデンスである。③ 臨床応用と意義: SB transposon platform はCAR-T療法の製造コスト・規制簡素化・スケールアップ容易性において bench-to-bedside translational potentialが極めて大きい。臨床応用として商業ライセンス (ZIOPHARM Oncology/Intrexon) によりCAR-T療法の普及加速の臨床的意義が確立、low-resource environment (community hospital、developing countries) での CAR-T療法アクセス改善が可能となる。臨床的有用性として、HSCT後 MRD adjuvant投与で disease relapse riskを reductionする戦略の効果がphase I内で示唆され、translationalな次世代CAR-T製造のパラダイムシフトを後押しする。④ 残された課題と今後の検討: limitationとして、(1) 各trial n=7/n=19 patientsはefficacyを統計的に確定するには不十分で、randomized phase II trial vs viral-vector CAR-Tによる比較が今後の研究として必要、(2) Allogeneic CAR-T persistence (51 d average) は autologous (201 d) より約 3.9-fold短く、同種環境下でのpersistence延長戦略 (Foxp3 KO Treg suppression、TCR knockout 等) が今後の課題、(3) 同種HSCT後long-termGVHD evolutionの追加追跡が future studyとして残された、(4) MD Anderson単施設・small cohort (n=26 total) のため multicenter validation studyの今後の検討、(5) SBシステムとlentivirus head-to-head比較試験 (cost、production time、persistence、efficacy) が必要、(6) HSCT待機できない急性期 B-ALL/NHL患者への lymphodepletion + SB CAR-T直接投与の効果検証が今後の展望。これらlimitationにもかかわらず、本研究は非ウイルス CAR-T製造のproof-of-conceptを世界で初めてhuman trialで確立した重要な clinical milestone evidenceである。
方法
試験設計: 単施設phase I dose escalation試験 2件 (MD Anderson Cancer Center、Houston, TX、IRB approved)。Trial 1 (自家): NCT00968760、n=7 patients with NHL (median age 52, range 36-61; DLBL 4, follicular lymphoma 2, Hodgkin lymphoma 1)。Trial 2 (同種): NCT01497184、n=19 patients (B-ALL 17, DLBL 2; median age 31, range 21-56)。Long-term follow-up: NCT01492036。CAR construct: 第2世代CD19特異的CAR (CD19RCD28、CD28+CD3ζ細胞内シグナル) を Sleeping Beauty (SB) transposon plasmid (CAR-encoding) と SB11 transposase plasmid (trans) でcodelivery。製造プロトコル: 患者末梢血単核球 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC) または健常ドナーPBMCを電気穿孔 (electroporation) で2 SB plasmids同時導入し、γ-irradiated artificial antigen-presenting cells (aAPC / AaPC、clone 4 = K562 cell line expressing CD19 + CD86 + 41BB-L + membrane-bound IL-15) と共培養 (median 28日、autologous: average 29 d±SD 1.4; allogeneic: average 28.5 d±SD 3.9)。Recombinant IL-2 (50 U/mL) + IL-21 (30 ng/mL) 添加。Quality assurance: 33 independent genomic DNA librariesでhigh-throughput sequencing (Illumina) によりCAR integration siteを解析、karyotype解析 (G-banding、n=14 products)、Direct TCR Expression Assay (DTEA、TCR Vα/Vβ 91 variants評価)、flow cytometry (CAR+ CD4/CD8、メモリーphenotype CCR7/CD45RA/CD27/CD28)、CD19-specific cytolysis (51Cr release)、telomere length (Flow-FISH)、SB11残存PCR (cryopreservation時)。HSCT条件: Trial 1はBEAM (carmustine/etoposide/cytarabine/melphalan) 前処置、Trial 2は busulfan-based myeloablative regimen (n=11) または fludarabine-based reduced intensity conditioning (n=8)。CAR-T投与: Trial 1ではPBSC infusion後2日 (range -1 to +6 d)、Trial 2ではPBSC後median 64 d (range 43-84)。Dose levels: Trial 1: 10^7-5×10^9 cells/m^2、Trial 2: 10^6-10^8 cells/m^2。Persistence測定: serial PBMCsからqPCRおよびdroplet digital PCR (ddPCR) でCAR transgene copy number定量。統計: Kaplan-Meier法でPFS/OS、log-rank検定で群間比較、Cox proportional hazards modelで多変量解析。両群primary objective: safety + feasibility + persistence、secondary: efficacy。