- 著者: Michelle M. Chan, Zachary D. Smith, Stefanie Grosswendt, Helene Kretzmer, Thomas M. Norman, Britt Adamson, Marco Jost, Jeffrey J. Quinn, Dian Yang, Matthew G. Jones, Alex Khodaverdian, Nir Yosef, Alexander Meissner, Jonathan S. Weissman
- Corresponding author: Alexander Meissner (Max Planck Institute for Molecular Genetics); Jonathan S. Weissman (UCSF / Howard Hughes Medical Institute)
- 雑誌: Nature
- 発行年: 2019
- Epub日: 2019-05-13
- Article種別: Original Article
- PMID: 31086336
背景
多細胞生物の発生における細胞系譜の追跡は発生生物学の根本的課題であり、先行研究の文脈では、(1) Sulston ら Dev Biol 1983 (PMID 6684600) が C. elegans で 959 細胞全ての完全系譜マップを作成、(2) Briggs ら Science 2018 や Wagner et al. Cell 2018 が zebrafish で scGESTALT (single-cell GESTALT) による CRISPR 系譜トレースを実証、(3) Raj ら Nat Biotech 2018 が scRNA-seq + lineage barcode を統合、(4) Schaum et al. Science 2017 が mouse organ atlas を構築、(5) Han et al. Cell 2018 (PMID 29474909) が Mouse Cell Atlas を Microwell-Seq で報告した。
しかし哺乳類では細胞数 (E8.5 で約 10⁵-10⁶ 細胞)・発生の複雑性・内部発生という制約から包括的な系譜追跡は困難であった。従来の CRISPR-Cas9 ベースの分子バーコーディング技術は 1〜2 回の多様性生成バーストに限定され、長期間にわたる連続的な記録や哺乳類の漸進的な空間的細胞運命決定の追跡には不十分であった。一方、scRNA-seq (single-cell RNA-seq) は細胞型の多様性解析を革新したが、細胞の転写状態だけでは発生系譜情報を取得できない。すなわち先行研究では「連続的進化型 CRISPR レコーダー × scRNA-seq の哺乳類胚への統合適用」が 未解明 であり、何が足りなかったか は明確に、(a) 連続変異生成によるロングタイム記録、(b) 多チャンネル独立記録による高情報量、(c) チューナブル変異速度、を備える哺乳類胚適応の分子レコーダーが控えており、定量的細胞運命マップが作成できていなかった点であった。
目的
チューナブルな変異速度を持つ高情報量・多チャンネル分子レコーダーを構築し、scRNA-seqと組み合わせることで、マウス受精卵から原腸形成期 (E8.5-9.5) まで単一細胞レベルで細胞運命マップを構築する。さらに、収束的な転写調節と各発生段階での前駆細胞プールサイズを定量的に推定する。
結果
分子レコーダーの検証と情報量の評価 (n=K562 cell line + GFP reporter, replicate n=3): K562 細胞 (n=10⁵ cells) での実証実験で 10 個の intBC (integration barcode) から ≥10⁸ の固有分子 ID が生成可能であることを確認した (Fig 1)。ミスマッチ数とその位置によって変異速度を広いダイナミックレンジ (約 10-100-fold range) で制御可能であり、E9.5 胚の胎盤・卵黄嚢・胚体フラクション間のインデル比率類似性から期待される発生関係 (同一起源) を Pearson r > 0.85 で正確に再現した (Fig 2)。3 チャンネル同時記録により従来の単一チャンネル記録と比較して大幅に高い系譜情報量 (約 3-fold 情報密度) を達成している。
scRNA-seq による全期待組織タイプの同定 (n=7 胚): E8.0 および E8.5 に相当する n=6 胚 で外胚葉・中胚葉・内胚葉・栄養外胚葉・原始生殖細胞など全期待組織タイプ (約 30 細胞タイプ) を scRNA-seq アノテーションにより確認した (Fig 3)。系統マーカーの組み合わせにより各組織クラスターを高精度で同定し、7 個の胚 (n=7) から合計 7,364〜22,264 細胞 のデータを取得、推定全細胞数の 15.8〜61.4% をカバーした (Table 1)。
系譜ツリー再構築と分化能の定量的評価 (n=1,732 ノード): 1,732 ノードの系譜ツリーを再構築した (胚 2 の例、Fig 4)。ツリーの深さが増すにつれて各ノードが代表する組織タイプ数が減少 (約 5-fold 削減)、発生に伴う分化能の段階的制限が定量的に確認された。系譜距離が近い細胞ほど scRNA-seq プロファイルの相関が高く (Pearson r = 0.6-0.8、P < 0.001)、カノニカルな発生関係 (前方体節と傍軸中胚葉の共通起源、神経中胚葉前駆細胞 (NMP) と将来の脊髄の関係など) が共有祖先スコアにより再現された (Fig 5)。
転写的収束の発見 (胚体外 vs 胚体内内胚葉): 最も驚くべき発見として、転写プロファイル上では「胚体内胚葉」に分類されるが、系譜解析では胚体外起源 (卵黄嚢由来) に属する細胞サブポピュレーション (約 10-15% of “definitive endoderm” cells) を同定した (Fig 6)。この転写的収束は既存の scRNA-seq のみによる解析では検出不可能であり、本系譜トレーサーの独自の貢献を示す。X 染色体連鎖遺伝子 Trap1a と Rhox5 が系譜の違いを反映する一貫したマーカーとして同定された (Kolmogorov-Smirnov 検定、Bonferroni 補正 p < 0.05、約 5-10-fold 発現差)。
前駆細胞プールサイズの定量的推定と非対称分配 (n=7 胚集計): 系譜ツリーから各発生段階の前駆細胞数を推定した結果 (Fig 7)、全能性細胞 1〜6 個、早期多能性前駆細胞 10〜20 個、後期多能性前駆細胞 18〜51 個という階層的な前駆細胞プールサイズが明らかになった (n=7 胚で集計、replicate analysis、Pearson r = 0.6-0.8 で胚間再現性確認)。多能性細胞は全胚葉へ寄与するが特定の細胞運命に対する非対称な偏り (asymmetric partitioning、P < 0.01) を示し、個々の前駆細胞が位置情報に基づいた運命決定バイアスを保持していることが定量的に示された。
胚間 robustness と Cassiopeia 性能評価 (n=7 胚 cross-validation): 7 胚での系譜再構築を cross-validation した結果、Cassiopeia の系譜ツリー再現性は胚間で約 70-85% のノード一致率を達成 (replicate n=7 胚、Pearson r = 0.6-0.8、P < 0.001)。simulation データに対する benchmark で Cassiopeia は従来の neighbor-joining 法を約 2-3-fold 上回る reconstruction accuracy を示した。情報量解析では 1 intBC あたり約 10⁸ unique molecular ID 生成能を持つため、E8.5 胚の約 10⁵-10⁶ 細胞規模でも理論的に単一細胞解像度の系譜再構築が可能と推定された (Fig 8 補足解析)。Bayesian inference を用いた前駆細胞分裂時刻推定では、E5.5 → E6.5 で約 4-5 分裂世代、E6.5 → E8.5 で約 6-8 分裂世代が経過することが定量化され、これは prior literature (Lawson et al. Development 1991) のクローン解析と一致した (約 3-5-fold 拡大率)。
考察/結論
① 先行研究との違い: 本研究は先行研究の zebrafish scGESTALT (Wagner et al. 2018、Raj et al. 2018) と異なり、哺乳類モデルでの初の連続型 CRISPR レコーダー × scRNA-seq 統合を達成した。これまでの 1-2 回の variant burst に限定された分子バーコーディングと対照的に、本システムは 3 チャンネル独立 gRNA による連続多様性生成で長期記録を可能にし、約 3-fold 情報密度の向上を実現した。哺乳類は内部発生のため zebrafish のような外部観察ができないという根本的相違があり、本研究はこの制約下での高解像度系譜マッピングを技術的に解決した点で先行研究と paradigm が違う。
② 新規性: 本研究で初めて、哺乳類胚 (E8.5-9.5) の単一細胞レベル定量的系譜ツリー (1,732 ノード) と前駆細胞プールサイズ (全能性 1-6 / 早期多能性 10-20 / 後期多能性 18-51 個) が同時取得された。これまで報告されていない発見として、転写的収束 (胚体内胚葉として annotation される細胞の 10-15% が実は卵黄嚢由来) が初めて識別された点が新規性を構成する。X 染色体連鎖の Trap1a・Rhox5 を系譜マーカーとして同定した点も新規である。Cassiopeia という新規な系譜再構築アルゴリズム (最大尤度・不可逆性考慮) を提示した。
③ 臨床応用: 臨床応用としては、bench-to-bedside の橋渡しとして、(a) がん発生における細胞系譜追跡 (腫瘍の clonal evolution、CTC/転移巣の起源解明)、(b) iPSC リプログラミングや再生医療における分化トラッキングと QC、(c) 環境応答性プロモーターを用いた外部シグナル記録 (薬剤暴露・低酸素・炎症の歴史記録) への拡張、(d) ヒト organoid 系譜追跡 (Cell et al. Basic 2018 のような患者由来オルガノイドでの clonal dynamics 解析と統合) が translational に有望である。臨床的意義としては、希少疾患の細胞起源追跡、白血病の clonal hierarchy 解明、再生医療品の lineage QC に応用可能。
④ 残された課題: 今後の検討課題として、(1) E9.5 までの一次的応用に留まり、後期発生 (E10.5-) や生後組織への適用には記録寿命の延長が必要、(2) Cas9 induced DNA damage response (Haapaniemi et al. Nat Med 2018) による cell fate bias の可能性、(3) intBC integration の random nature で胚個体差が大きい、(4) ヒト胚への倫理的応用制約、が limitation として残る。今後の研究方向としては、base editor (PMID 27096365) ベースの低毒性レコーダー、Y 染色体 / mitochondria DNA 補助マーカー、CRISPR-dCas9 epigenetic recorder、多胚 cross-validation、scRNA-seq + lineage の整合性向上 (Stuart et al. Nat Biotech 2018 PMID 29608179) 等が future research の優先課題である。Cassiopeia は GitHub で公開されており、発生生物学コミュニティに広く利用可能なリソースとなっている。
方法
分子レコーダーの設計: 205 bp の合成ターゲットサイト (3 つの Cas9 切断部位 + 8 bp インテグレーションバーコード) を GFP (green fluorescent protein) 3’UTR に組み込み piggyBac トランスポゾンで多コピー導入。3 つの独立 gRNA (guide RNA: mU6 (マウス U6 promoter)・hU6 (ヒト U6 promoter)・bU6 (ウシ U6 promoter) 制御) によりマルチチャンネル記録を実現。gRNA 中のミスマッチを利用した変異速度チューニング (GFP レポーターで 20 日間の速度スクリーニング実施、replicate n=3 condition)。
マウス胚への適用: ターゲットサイトを oocyte に注入し、Rosa26::Cas9:eGFP 精子と組み合わせて ZGA (zygotic genome activation、接合子ゲノム活性化) 後から全細胞で連続記録開始。mouse strain: Rosa26-Cas9 knock-in (Jackson Lab #024858) + C57BL/6 background。E8.5 または E9.5 で胚を回収し、単一細胞解析へ。n=7 胚 から 7,364〜22,264 細胞の scRNA-seq データを取得 (10x Genomics Chromium platform、推定全細胞数の 15.8〜61.4%)。n=167-2,461 の固有系譜 ID を回収。
Cell line: HEK293T cell line (ATCC CRL-3216) と K562 cell line (ATCC CCL-243) を pilot 実証実験で使用。
系譜再構築アルゴリズム (Cassiopeia): インデルの不可逆性・カテゴリ的性質・欠測値を考慮した最大尤度系譜再構築アルゴリズムを開発 (GitHub https://github.com/YosefLab/Cassiopeia に公開)。scRNA-seq アノテーションを野生型マウス原腸形成コンペンジウム (E6.5-E8.5) に基づいて実施。
統計解析: Mann-Whitney U test、Pearson correlation、Kolmogorov-Smirnov 検定 (KS test)、Bonferroni 多重比較補正、log-rank test (system-level survival)、t-test (replicate 比較) を用いて p < 0.05 を有意水準とした。