- 著者: Vaquero et al.
- Corresponding author: Rene Jackstadt (German Cancer Research Center (DKFZ))
- 雑誌: Nature
- 発行年: 2026
- Epub日: 2026-05-26
- Article種別: Original Article
- PMID: 38792671
背景
結腸直腸がん (CRC) は、世界的にがん関連死の主要な原因の一つであり、その高い死亡率は診断時に既に存在する播種性腫瘍細胞と、既存の全身療法が効果不十分であることに起因する (Siegel et al. 2023)。特に、CRCの約90%を占めるマイクロサテライト安定型CRCの標準治療は、5-フルオロウラシル (5-FU) とイリノテカン (FOLFIRI) またはオキサリプラチン (FOLFOX) の併用化学療法である。しかし、治療抵抗性の主要な要因として、腫瘍細胞の著しい可塑性が挙げられる (Canellas-Socias et al. 2024)。血管内皮増殖因子受容体 (VEGFR) や上皮成長因子受容体 (EGFR) を標的とする治療法は臨床的有効性を高めるものの、進行期CRC患者の5年全生存率が12%に留まる現状は、より効果的な治療選択肢の必要性を示唆している (Siegel et al. 2023)。
予後不良なCRCは依然として深刻な臨床的課題である。分子特性解析により、低WNTシグナル伝達活性を示す腫瘍が予後不良と関連することが明らかになっている (De Sousa et al. 2013)。さらに、トランスクリプトーム解析により、CRCは4つのコンセンサス分子サブタイプ (CMS) に分類され (Guinney et al. 2015)、その中でもiCMS3は予後不良な特徴を持つことが示されている (Joanito et al. 2022)。これらの予後不良な治療抵抗性サブタイプは、共通して低WNT経路活性を示す。しかし、これらの分類は患者層別化や治療アプローチにおいて臨床導入には至っておらず、この領域には未解明な点が残されている。
がん幹細胞 (CSC) は、がんの維持、治療抵抗性、転移に不可欠な自己複製能力の亢進を特徴とするがん細胞集団である (Batlle & Clevers 2017)。腸管の成人幹細胞に由来するLGR5発現細胞は、当初CRCの起源細胞およびCSCとして定義された (Barker et al. 2009)。しかし、LGR5陽性がん細胞の除去は、文脈依存的にLGR5 CSCプールの迅速な補充を伴う細胞可塑性を示すことが明らかになっている (Shimokawa et al. 2017)。転移カスケードにおける細胞動態の追跡により、原発腫瘍から離れる腫瘍細胞の多くはLGR5発現を欠き、胎児様細胞マーカーの発現を再獲得することが示されている (Fumagalli et al. 2020)。これらの胎児様がん細胞は、転移などの患者予後に重要な疾患関連プロセスで検出されるが、LGR5陽性成人腸管幹細胞は存在しない (Fey et al. 2024)。このことは、LGR5以外のCSCマーカーの不足を示唆する。
近年、抗体薬物複合体 (ADC) は、複数の癌種において標的治療戦略として急速に注目を集めている (Colombo et al. 2024)。TROP2 (trophoblast cell-surface antigen 2) は、胎盤細胞表面抗原2をコードする膜貫通型糖タンパク質であり、様々な癌種で豊富に発現するが、ほとんどの成人組織では発現しないことが示されている (Shvartsur & Bonavida 2015)。TROP2標的ADCの開発は盛んに行われており、サシツズマブ ゴビテカン (SG) は既に転移性乳がん患者に対して承認されている ([[Cortes et al. N. Engl. J. Med. 2025]])。しかし、CRCにおけるTROP2発現細胞の治療抵抗性における役割と、TROP2標的治療が腫瘍細胞状態の動態に与える影響については、依然として未解明な点が多く、新たな治療戦略の開発が不足している。
目的
本研究の目的は、結腸直腸がん (CRC) におけるTROP2 (trophoblast cell-surface antigen 2) の臨床的意義と機能的役割を解明することである。具体的には、TROP2が予後不良な細胞状態のバイオマーカーとして機能するかどうかを評価し、TROP2陽性細胞の幹細胞様能力および転移能を詳細に解析する。さらに、TROP2標的抗体薬物複合体 (ADC) がこれらの細胞を特異的に標的とし、腫瘍細胞の状態を再構築するメカニズムを明らかにすることを目指す。従来の化学療法がTROP2発現細胞を誘導する現象に着目し、TROP2 ADCと化学療法の併用が抗腫瘍効果を増強し、治療抵抗性を克服する可能性を検証する。最終的に、TROP2をCRCの治療標的としての脆弱性として確立し、治療効果を向上させ、進行期疾患における抵抗性を克服するための細胞状態標的化の重要性を強調することを目的とする。
結果
TROP2は予後不良なCRC細胞を定義する: 公開データセットの解析により、TROP2をコードする_TACSTD2_遺伝子の高発現が、CRC患者1,336例において短い無再発生存期間と有意に相関することが示された (HR 1.5, p=0.00037) (Figure 1a)。また、_TACSTD2_の発現は、TCGA-COADデータセットのCRC患者468例において、進行期疾患で増加する傾向が認められた (Figure 1b)。非転移性 (M0) および転移性 (M1) CRC患者246例のケースコントロール研究では、TROP2発現が遠隔転移と有意に相関した (M1群で37.8% vs M0群で17.1%, p<0.001) (Figure 1c)。さらに、UICCステージIIの進行性局所CRC患者189例において、高TROP2発現は短い無病生存期間と関連した (Figure 1d)。単一細胞RNAシーケンス (scRNA-seq) 解析により、TROP2はWNT低分化型、胎児様細胞状態、および高再発細胞 (HRC) 状態と関連することが明らかになった (Figure 1f,g)。マウスモデルにおいても、TROP2発現は腫瘍の悪性度と相関して増加し、LGR5や胎児様マーカーとは異なる挙動を示した (Figure 1j)。特に、VAKPS MDOsではTROP2レベルが増加し、VKPN MDOsでも同様の傾向が観察された。
TROP2はWNT低分化型CRCのCSCをマークする: TROP2陽性細胞の機能的役割を評価するため、TROP2陰性細胞とTROP2陽性細胞（上位20%）を分離し、in vitroおよびin vivoで解析した。様々なステージのマウス由来オルガノイド (MDO) および患者由来オルガノイド (PDO) において、TROP2陽性細胞はクローン形成能の亢進を示した (Figure 2b-d)。例えば、VAKPS MDOsではTROP2陽性細胞のクローン形成能が有意に高かった (p<0.001)。特に、WNT低分化型モデルにおいて、TROP2陽性細胞は腫瘍形成能の亢進を示した (Figure 2g,h)。例えば、HD42466 PDOでは、TROP2陽性細胞の幹細胞頻度は1/7,807であったのに対し、TROP2陰性細胞では1/21,421であった。LGR5レポーターマウスモデルを用いた解析では、LGR5は主にWNT高分化型CRCのCSCをマークするのに対し、TROP2陽性細胞はWNT低分化型CRCにおいて幹細胞様腫瘍形成能を持つことが示唆された (Figure 2o-q)。これらの結果は、CRC細胞の高い可塑性と、TROP2陽性細胞プールの補充への潜在的な依存性を示唆する。VKPN MDOsではLGR5-tdTomato陽性細胞のクローン形成能の増加は認められず、WNT低活性環境でのLGR5のCSC特性の欠如が示唆された。
TROP2は転移開始細胞 (MICs) を定義する: TROP2陽性細胞の転移における関連性を評価するため、転移の様々な段階におけるTROP2発現を解析した。LGR5発現がより大きな病変で検出されるのに対し、TROP2は転移初期段階から存在することが示された (Extended Data Figure 5a-g)。転移播種アッセイにおいて、VAKPS[LT]腫瘍のLGR5陽性細胞はLGR5陰性細胞よりも有意に高い転移能を示した。特に、LGR5陽性/TROP2陽性二重陽性細胞は、より多くの転移を形成した (Extended Data Figure 5h-k)。LGR5陰性細胞の転移能を評価したところ、TROP2陽性細胞で有意な転移効率の増加が認められた (Extended Data Figure 5i-l)。VKPN[LT] MDOsでは、LGR5レベルに関わらず、TROP2陽性細胞集団はTROP2陰性細胞集団よりも有意に高い転移能を示した (Extended Data Figure 5m-o)。これらの結果は、TROP2陽性細胞がVAKPSおよびVKPNモデルの両方でTROP2陰性細胞よりも高い転移能を持つことを示している。転移巣では、LGR5陽性細胞とTROP2陽性細胞の比率が迅速に回復し、高い細胞可塑性を示した (Extended Data Figure 5l, p)。
TROP2標的化はがん細胞の状態を再構築する: TROP2発現細胞を標的とすることの臨床的関連性を検証するため、TROP2標的ADCであるサシツズマブ ゴビテカン (SG) を用いた。患者由来のCRCサンプルから作製したPDOおよびPDOXは、原発組織と同様のTROP2発現および膜局在を示した (Figure 3a)。確立されたPDOXに対するSG治療は、TROP2発現依存的な生存利益を示した (Figure 3b-e)。例えば、TROP2高発現PDOX (HD42466) では、SG治療により生存期間が有意に延長された (p<0.0001)。これは、TROP2細胞表面タンパク質レベルの減少を伴った (Figure 3f,g)。scRNA-seq解析により、SG治療はHRC様および胎児様シグネチャーの顕著な減少と、ISC/LGR5シグネチャーの増加と関連することが明らかになった (Figure 3h-l)。時間分解解析では、SG単回投与後48時間以内に細胞状態組成に明確な変化が生じ、TROP2陽性および胎児様細胞を犠牲にしてLGR5プログラムが上方制御されることが示された (Figure 3n-q)。この細胞状態の変化は可逆的であり、薬剤効果が薄れると元の状態に戻った (Extended Data Figure 7g-o)。
化学療法はTROP2発現と可塑性を誘導する: FOLFIRI化学療法で様々なPDOを処理したところ、ベースラインのTROP2レベルに関わらず、すべてのモデルでTROP2発現の誘導が観察された (Figure 4a-f)。ベースラインで全ての細胞がTROP2を発現している腫瘍でも、FOLFIRI曝露によりTROP2表面レベルが有意に亢進した (Figure 4d)。TROP2誘導は、in vitroおよびin vivoのVAKP MDOにおけるFOLFIRI曝露後にも検出された (Extended Data Figure 8d-f)。この誘導は薬剤中止後96時間で回復し、高い可塑性を示唆した (Extended Data Figure 8g)。Tacstd2[CreER]アレルを用いた系統追跡実験では、化学療法が選択的な細胞濃縮ではなく、TROP2レベルの上方制御を誘導することが示唆された (Figure 4g-j)。FOLFIRI処理後のPDOの縦断的解析では、TROP2タンパク質およびmRNAの経時的な増加と、_LGR5_の発現低下が認められた (Figure 4m-q)。例えば、HD43478 PDOsではFOLFIRI処理後、TACSTD2 mRNA発現が約2.5-fold増加した。
併用療法は有効性を高める: 化学療法が治療抵抗性に関連するTROP2発現を誘導することから、化学療法とSGの併用が治療効果を高める可能性を検証した。FOLFIRIまたはFOLFOX治療は、TROP2発現を有意に亢進させた (Extended Data Figure 11a-i)。SG単剤療法および併用療法の両方で、表面TROP2発現細胞の有意な減少が認められた。PDO移植マウスモデルにおいて、FOLFOXとSGの併用治療は、各単剤療法と比較してマウスの生存期間を有意に延長した (Extended Data Figure 12a,b)。例えば、HD42466 PDOXを移植したマウス (n=6 mice/group) では、FOLFOX+SG併用群の生存期間中央値は単剤群と比較して有意に長かった (p<0.001)。早期転移と確立されたマクロ転移の両方に対する併用治療は、TROP2低発現細胞においても生物発光シグナルを減少させた (Figure 5c,d)。同様に、標準治療化学療法とSac-TMTの併用は、腫瘍増殖を遅延させ、毒性は検出されなかった (Figure 5e)。これらのデータは、LGR5陽性細胞とTROP2陽性細胞が異なる状態で共存し、化学療法がTROP2発現を誘導することで腫瘍細胞の状態が変化し、TROP2陽性細胞を標的とする機会が生まれるというモデルを支持する (Figure 5f)。
考察/結論
本研究は、結腸直腸がん (CRC) においてTROP2が予後不良な細胞状態のマーカーであることを同定し、TROP2標的抗体薬物複合体 (ADC) と化学療法の併用が治療効果を増強する可能性を示した。
先行研究との違い: これまでの研究では、LGR5陽性細胞がCRCの幹細胞として広く認識されてきたが、本研究はWNT低分化型CRCにおいてTROP2陽性細胞が代替の幹細胞プールとして機能することを初めて明らかにした。LGR5陽性細胞がWNT高活性環境で幹細胞特性を示すのに対し、TROP2陽性細胞はWNT低活性環境で幹細胞様能力と転移能を発揮するという、細胞状態依存的な幹細胞特性の二分化を提示した点は、これまでのLGR5中心の幹細胞概念と対照的である。
新規性: 本研究で初めて、TROP2が胎児様細胞および高再発細胞 (HRC) 集団の両方の複合マーカーとして機能することを新規に同定した。これらの細胞集団は、治療抵抗性および転移と関連しており、TROP2がCRCの進行における重要な脆弱性であることを示唆する。さらに、化学療法がTROP2発現を誘導し、腫瘍細胞の状態をLGR5陽性からTROP2陽性へと再構築するという、治療によって駆動される細胞状態の動態を詳細に解明したことは、これまで報告されていない新規の知見である。TROP2標的ADCが、これらの治療抵抗性細胞を特異的に標的とし、腫瘍細胞の状態を再構築するメカニズムを明らかにした点も新規性が高い。
臨床応用: 本研究の知見は、CRCの治療戦略に大きな臨床的含意を持つ。TROP2が予後不良な細胞状態のマーカーであることから、TROP2発現レベルは患者の層別化や予後予測に利用できる可能性がある。また、化学療法がTROP2発現を誘導するという発見は、化学療法後にTROP2標的ADCを投与することで、治療効果を最大化できる可能性を示唆する。この併用療法は、既存の治療抵抗性を克服し、進行期CRC患者の治療成績を向上させるための新たなアプローチとして臨床応用が期待される。特に、TROP2 ADCによる細胞状態の再構築は、治療抵抗性メカニズムを標的とする上で重要なベンチ・トゥ・ベッドサイド研究の成果である。
残された課題: 今後の検討課題として、TROP2陽性細胞が鋸歯状腺腫の起源細胞であるかどうかのさらなる検証が必要である。また、TROP2発現細胞が転移開始細胞 (MIC) を標識するメカニズムと、MICとCSCの間で細胞状態および動態がどのように異なるのかを詳細に解明する必要がある。TROP2標的ADCに対する抵抗性メカニズム、特に標的エピトープ発現の減少や欠如以外の要因についても、さらなる研究が求められる。Limitationとしては、主にマウスモデルやオルガノイドを用いた実験結果であり、ヒトの臨床環境での検証をさらに進める必要がある。
方法
臨床検体および患者由来オルガノイド (PDO) の作製: M0/M1ケースコントロールコホートおよびUICCステージIIコホートの患者検体は、LMUミュンヘン病理学研究所から取得された。TROP2発現は、ホルマリン固定パラフィン包埋切片に対し、抗TROP2抗体 (Abcam; ab227691; クローンSP295) を用いた免疫組織化学染色で検出された。PDOおよび組織は、ハイデルベルク大学病院で倫理的承認 (S-136/2021およびS-871/2021) を得て作製された。
動物実験: すべてのマウス実験は、カールスルーエ行政管区の地方当局の承認 (G-148-20, G-27-22, G-159-22, G-164-22) を得て実施された。腫瘍増殖は定期的にモニタリングされ、腫瘍サイズが最大許容値に達するか、人道的なエンドポイント基準が満たされた時点でマウスは安楽死された。Tacstd2[CreERT2]トランスジェニックマウスは、相同組換えにより作製された。皮下注射および腫瘍モニタリング、脾臓内注射により、腫瘍形成能および転移能が評価された。腫瘍形成能は、ELDAウェブツールを用いた限界希釈分析により評価され、尤度比検定で比較された。実験にはNOD scid IL2Rγ null (NSG) マウスが用いられた。
単一細胞RNAシーケンス (scRNA-seq) およびデータ解析: 腫瘍サンプルは単一細胞に解離され、ハッシュ抗体を用いて多重化された。シーケンスリードは、10x Genomics Cell Ranger (v.7.1.0) を用いてヒトおよびマウスの参照ゲノムにマッピングされた。データの前処理はPythonのscanpyパッケージ (v.1.9.3) を用いて行われ、細胞の遺伝子数、ミトコンドリア含有量、および二重体に基づいてフィルタリングされた。次元削減、クラスタリング、および可視化は、主成分分析、k-近傍グラフ、Leidenアルゴリズム、およびUMAPを用いて行われた。バッチ効果を最小化するため、harmonypy (v.0.0.9) を用いたデータ統合が実施された。細胞タイプおよび細胞状態の注釈は、遺伝子セットおよびマーカー遺伝子発現パターンに基づいて行われた。TROP2陽性細胞とTROP2陰性細胞間の差次的発現解析は、Decoupler (v.1.8.0) を用いた擬似バルクデータ生成後、PyDESeq2 (v.0.4.10) のWald検定により実施された。
in vitroおよびin vivo薬物治療: FOLFIRI化学療法は、MDOまたはPDOを5 µM 5-FUおよび5 µMイリノテカンで96時間処理することで行われた。SG治療は、PDOを5 µM SGで3時間または96時間処理することで行われた。in vivoでは、FOLFIRI化学療法は、マウスに10 mg/kgの5-FUおよび45 mg/kgのイリノテカンを腹腔内投与することで行われた。SG治療は、マウスに25 mg/kgのSGを腹腔内投与することで行われた。実験にはHD42466、HD42541、HD43094などのPDOsが用いられた。
クローン形成能アッセイ: MDOまたはPDOは単一細胞に解離され、MDO細胞1,000個またはPDO細胞5,000個がBMEに播種された。オルガノイド形成後、ウェルあたりのオルガノイド数が定量され、Fijiソフトウェアを用いてオルガノイドサイズが測定された。播種効率は、形成されたオルガノイド数と播種された初期細胞数で算出された。
統計解析: scRNA-seqデータの解析に関連する統計解析は、各パッケージを用いてMethodsセクションに記載された通りに行われた。その他の統計解析にはGraphPad Prismソフトウェアv.9が用いられた。限界希釈分析はELDAウェブツールを用いて行われた。統計的有意性は、*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001と示された。特に、Wilcoxon rank-sum testが差次的発現解析に用いられた。