- 著者: Sun et al.
- Corresponding author: Yongmei Li (Tianjin Medical University), Wen Wei (Arizona State University)
- 雑誌: Science Advances
- 発行年: 2026
- Epub日: 2026-07-01
- Article種別: Original Article
- PMID: 38956942
背景
長鎖非コードRNA (lncRNA) は、がん原性および腫瘍抑制経路の重要な調節因子として認識されており、細胞増殖、転移、免疫回避など多様な細胞機能に影響を与えることが報告されている (Mattick et al. 2023; Huarte 2015; Evans et al. 2016)。これらのlncRNAの多くは、初期の多細胞生物にまで遡る深く保存された調節メカニズムを利用している一方で、がん感受性の調節に関与するlncRNAは、より最近の進化起源を持つことが多く、しばしば哺乳類に限定される (Sarropoulos et al. 2019)。このような系統特異的な調節革新は、保存された細胞プロセスと相互作用し、新規の機能不全感受性を導入する可能性がある。例えば、ヒト特異的lncRNAであるLINC00662は、肝細胞癌におけるWnt/β-カテニンシグナル経路 (Tian et al. 2020)、胃癌におけるHippo-YAP1経路 (Liu et al. 2018)、卵巣癌におけるMAPK/p38経路 (Wu et al. 2021) など、様々な癌において複数の古代経路を調節することが示されている。これらの経路は、多細胞生物の分岐以前に起源を持つ。
霊長類のゲノム、特にヒトのゲノムは、大量の非コードDNAによって特徴づけられる。これらの領域における確率的な転写活性は、しばしば断片化されたRNAを生成し、新規lncRNAが生じるための原材料を安定的に供給する (Palazzo and Koonin 2020)。がん関連lncRNAの機能的役割にはかなりの注目が集まっているものの、その進化起源、特に以前は機能していなかった配列が、深く保存されたがん遺伝子や腫瘍形成経路を調節するためにどのように利用されるかについては、ほとんど未解明な点が残されている。lncRNAの進化経路は、配列組成と発現プロファイルの両方において急速なターンオーバーによって特徴づけられ (Sarropoulos et al. 2019)、これはタンパク質コード遺伝子と比較して非コード要素に作用する選択圧が一般的に緩和されているパターンと一致する。この許容的な環境は、点変異、挿入欠失、構造的挿入の蓄積を促進し、既存の調節ネットワークに統合される可能性のある新規転写産物の出現を可能にする (Wei et al. 2016; Zhang et al. 2015)。特に、トランスポゾン要素 (TE) のlncRNAエクソンへの頻繁な組み込みは、構造的および調節的革新の主要な源であり、スプライシングモチーフ、ポリアデニル化シグナル、さらには基本的な機能ドメインを提供する (Zeng et al. 2018; Fueyo et al. 2022)。これらの挿入は、転写産物の長さと安定性を増加させ (Kelley and Rinn 2012; Kapusta et al. 2013; Johnson and Guigó 2014)、それによって持続的な発現と保存された細胞経路との潜在的な相互作用の可能性を高める。しかし、lncRNAにおける配列レベルの変化が、腫瘍形成における機能的に一貫した役割にどの程度洗練されるかは、進化的な観点からは未解決の課題である。これらの役割が適応的洗練の結果を反映しているのか、あるいは弱い選択と歴史的偶発性によって主に形成された転写産物複雑性の偶発的な結果に過ぎないのかは不明である。本研究は、この知識ギャップを埋めることを目的とする。
目的
本研究の目的は、がん関連lncRNAの進化経路を非がん関連lncRNAと区別し、特にヒトにおいて新規に進化したがん関連lncRNAが、どのようにして深く保存されたがん関連経路に統合されるかを明らかにすることである。具体的には、転写活性の増加と配列拡張を経て、主に霊長類起源のlncRNAががん発生に影響を与える段階的プロセスを検証する。さらに、MIR497HGをモデルとして、その進化がAMPK (adenosine monophosphate–activated protein kinase)/フェロトーシスネットワークにどのように統合され、がん発生に影響を与えるかを詳細に解析し、その臨床的意義と治療標的としての可能性を探る。
結果
がん関連lncRNAの進化動態とがん関連経路への統合: 約10,000のTCGAサンプルを含むパンキャンサー分類データを用いて、パンキャンサー関連lncRNA (PC-lncRNA) を同定した (Hoadley et al. 2018)。これらのPC-lncRNAは、癌組織における正常組織との比較での発現プロファイルの違いと、臨床的生存確率との相関によって特徴づけられた (Fig. 1A)。約18,000のヒトlncRNAを対象に、17種の動物種にわたる詳細な進化解析を実施した。この解析により、lncRNAの出現において顕著なバーストが、霊長類が齧歯類（マウス、ラット）およびウサギ目（ウサギ）から分岐した比較的最近の約9000万年前に起こったことが明らかになった (Fig. 1C)。この期間に、lncRNAの78.5%が霊長類特異的に起源し、100万年あたり156の新規lncRNAが出現したと推定される。対照的に、コード遺伝子の進化経路ははるかに深い起源を示し、霊長類系統内で出現したのはわずか5.1%であった (Fig. 1C, Table S3)。この差異は、新規に出現したlncRNAが、特に霊長類の進化において、コード遺伝子と比較して選択的制約の顕著な緩和またはより強い正の選択を経験したことを示唆する。霊長類の集団サイズが小さいことから、選択圧の弱化が新規lncRNAの拡大を促進する進化環境を育んだ可能性が高い。注目すべきは、霊長類特異的lncRNAの27.2%がPC-lncRNAに進化したことであり、これはコード遺伝子（17.9%）よりも有意に高い割合であった (カイ二乗検定、p=8.3 × 10⁻¹²)。PC-lncRNAは、非PC-lncRNAと比較して、より多くの癌関連経路（21対12）で濃縮されたPC-コード遺伝子と関連していた (Fig. 1F, Fig. S2)。特に、腫瘍形成および細胞増殖・死に直接関連する経路はPC-lncRNAのみで濃縮が認められた。
PC-lncRNAの配列拡張と発現レベルの増加: PC-lncRNAは、非PC-lncRNAと比較して、時間とともに配列長と選択的スプライシング転写産物の数の両方で有意な増加を示した (Fig. 2A, B)。ヒト-マーモセット分岐（B1からB3、約4300万年前）の間、PC-lncRNAは顕著な拡張を示し、最長転写産物は100万年あたり平均46.606 bpの速度で長さが増加し、100万年あたり0.162の選択的転写産物を獲得した (Fig. 2A, B)。この傾向は、ヒト-マカク分岐（B1とB2、約2900万年前）でさらに強まり、最長転写産物の配列長は100万年あたり平均66.647 bp増加し、100万年あたり0.302の選択的転写産物が増加した。対照的に、非PC-lncRNAはわずかな変化しか経験しなかった。拡張された断片の44.8%は外部ゲノム源に由来し、36.1%は同じ染色体（局所、内部、または混合）に由来し、19.2%は異なる染色体から動員された。PC-lncRNAは、非PC-lncRNAと比較して、外部起源の拡張の割合が有意に高かった（53.3%対37.2%） (Fig. 2C)。トランスポゾン要素（TE）の寄与は、非PC-lncRNAで41.4%、PC-lncRNAで35.1%であり、PC-lncRNAで有意に低い割合が観察された (カイ二乗検定、p=0.020) (Fig. 2D)。 PC-lncRNAは、ヒトにおいてマカクのホモログと比較して有意に高い発現レベルを示し、非霊長類ではホモログの発現が著しく低下していた (Fig. 3A)。ヒト胚性幹細胞（ESC）におけるPC-lncRNAの発現とマウスESCにおけるホモログの発現を比較した場合も同様のパターンが観察され、発現の高さがPC-lncRNA進化の重要な特徴であることが示唆された (Fig. S6)。PC-lncRNAの発現増加は、非PC-lncRNAよりも遅く (Fig. 3A; 対ペアt検定、p=0.005)、その結果、PC-lncRNAはヒトにおいて非PC-lncRNAよりも高い発現レベルを示した (Fig. 3B)。さらに、ヒトPC-lncRNAは、ホモログで観察される組織間の高い変動性とは対照的に、組織間で著しく低い発現変動性を示し、特にマカク、マウス、オポッサムと比較して、ヒト系統でより広範で均一な発現を示した (Fig. 3C)。
MIR497HGの起源と進化: PC-lncRNAの代表としてMIR497HGを選択し、その進化経路を解析した。MIR497HGの短い祖先は共通の哺乳類祖先に起源し、当初はmiRNA（miR-497および/またはmiR-195）の前駆体として機能していた。ヒトとマカクを含む狭鼻猿類系統が分岐するにつれて、MIR497HGが出現し、MIR497HG-Sアイソフォームを生み出した (Fig. 5C, D)。その後、ヒトにおいてMIR497HGはさらに長い形態であるhsa-MIR497HG-Lへと進化し、hsa-MIR497HG-Lはhsa-MIR497HG-Sよりもはるかに高い発現を示した (Fig. 5E)。CAGE-seq (Cap Analysis Gene Expression sequencing) データを用いたヒトとマウス間の転写開始点（TSS）シグナルの比較分析により、ヒトではhsa-MIR497HGの5’末端にTSSシグナルが検出されたが、マウスホモログでは検出されなかった (Fig. 5F)。ChIP-seq (chromatin immunoprecipitation sequencing) およびDNase-seq分析でも、ヒトのhsa-MIR497HGの5’末端で活発な転写が示されたが、マウスホモログでは観察されなかった (Fig. 5F)。これらの結果は、狭鼻猿類の進化中に転写開始修飾が起こり、ヒトとマカクの両方でMIR497HGの高い発現レベルと相関していることを示唆する (Fig. S8)。MIR497HGの潜在的なプロモーター領域のさらなる分析では、ヒトとマカクの5’非翻訳領域（5’UTR）の-4位にAからTへの変異が発見された (Fig. 5G)。この変異は、転写機械との相互作用に影響を与え、mml-MIR497HG-Sの発現につながり、その後ヒトでより長いlncRNAへの進化を促進した可能性が高い。
MIR497HG-Lの機能的役割とAMPK/フェロトーシス経路への影響: hsa-MIR497HGの維持された高発現は正常組織機能に不可欠である可能性があり、28のパンキャンサータイプのうち16でその発現が著しく減少していた (Fig. 6A)。特に、消化器癌サブタイプC1、C4、C18では、対応する正常組織のMIR497HG発現レベルのわずか5.8%、3.1%、2.5%しか示さなかった。H9細胞（正常ヒトESC）と3つの異なる癌細胞株（HeLa、Caco-2、CFPAC-1）を用いたPCR分析では、癌細胞におけるMIR497HG-Lの発現がH9細胞と比較して大幅に減少していることが明らかになった (Fig. 6B, Fig. S9)。siRNA (small interfering RNA) を介したMIR497HG-Lのノックダウンは、H9細胞の細胞増殖を有意に増加させた (p < 0.001) (Fig. 6C, Fig. S10A)。逆に、内因性発現が低い癌細胞株におけるMIR497HG-Lの過剰発現は、細胞増殖を有意に抑制した (p < 0.001) (Fig. 6D-F, Fig. S10B)。 MIR497HG-Lの過剰発現細胞と対照細胞のRNA-seq分析により、3つの癌細胞株間で差次的に発現する遺伝子（DEG）のほとんどが個々の細胞株に特異的であることが明らかになった (Fig. 7A, Fig. S11)。しかし、AMPKシグナル経路とフェロトーシス関連プロセスの両方が、3つの癌細胞株すべてで一貫して濃縮されていた (Fig. 7B, C)。ウェスタンブロット分析では、癌細胞株におけるMIR497HG-Lの過剰発現がAMPKリン酸化の減少につながり、経路の不活性化を示唆した (Fig. 7D)。同時に、細胞内鉄レベルはMIR497HG-L過剰発現HeLa、Caco-2、CFPAC-1細胞で有意に増加し (Fig. 7E)、フェロトーシス促進の可能性と一致した。さらに、MIR497HG-Lの過剰発現は、フェロトーシス感受性を調節するシステムXc[-]トランスポーターの主要構成要素であるSLC7A11の量の減少 (Fig. 7F)、グルタチオン（GSH）レベルの減少、酸化型グルタチオン（GSSG）レベルの増加 (Fig. 7G)、GPX4活性の減少 (Fig. 7F)、および脂質過酸化のマーカーであるマロンジアルデヒド（MDA）の蓄積 (Fig. 7G) をもたらした。これらの結果は、MIR497HG-Lの摂動がAMPKシグナル伝達とフェロトーシス関連経路における協調的な変化と関連しているというモデルを支持する。
考察/結論
本研究では、ヒトゲノムにおけるlncRNAの数の顕著な拡大を特定したが、これらの新規に出現したlncRNAのごく一部のみが腫瘍形成に寄与していることが示された。このパターンは、ドリフトバリア仮説 (Lynch et al. 2016; Lynch 2010; Wei et al. 2022) を通して解釈できる。遺伝的変異の進化経路は、自然選択と遺伝的浮動の相互作用によって形成され、後者は霊長類のような実効集団サイズが小さい種において不均衡に強い影響を及ぼす。遺伝的浮動は集団サイズに反比例して作用するため、自然選択の有効性を不明瞭にし、ジャンクDNAを含む非適応配列のゲノム内での保持を促進する (Lynch and Conery 2003)。霊長類における非コード配列の広範なリザーバーは、lncRNAの出現に肥沃な土壌を提供する (Palazzo and Lee 2015)。その結果、ヒトの実効集団サイズの小ささは、lncRNAの著しい拡大に寄与した可能性が高い。しかし、非機能性配列の増殖を促進するのと同じ確率的力は、有益な変異の効率的な固定に対する障壁も課し (Lynch et al. 2016)、遺伝的システムの洗練を妨げ、新規に出現したlncRNAが機能的役割を一貫して獲得することを阻害する。このドリフトバリア仮説は、PC-lncRNAのような限られた数の新規lncRNAのみがこれらの制約を克服し、調節的および腫瘍形成的な関連性を獲得した理由を説明する。これは、ヒトにおける新規タンパク質コード遺伝子の比較的遅い出現 (Zhang et al. 2015) と、lncRNAレパートリーで観察されるより急速な進化的ターンオーバーとの対比を説明する。
先行研究との違い: 以前の研究では、lncRNAの拡大の主要な推進力はTE挿入であると仮説が立てられていた (Kapusta et al. 2013)。しかし、本研究の知見は、PC-lncRNAの伸長が、均一にTE駆動型モデルに従うのではなく、複数の配列起源の組み込みを通して主に起こることを示唆しており、これまでの報告とは対照的である。
新規性: MIR497HGの場合、その初期の主要な拡大は、祖先miRNAの上流における単一ヌクレオチド変異によって駆動されたことが本研究で初めて示された。この変異は、転写開始複合体の形成を促進し、ヒトとマカクの共通祖先においてlncRNA転写産物（MIR497HG-S）の出現につながった。時間とともに、この転写産物はイントロン領域のエクソン化を通してさらに伸長し、最終的に、特にパンキャンサー調節において潜在的に新規な機能的役割を持つ、より長いアイソフォーム（MIR497HG-L）を生み出した。
臨床応用: 本研究は、MIR497HG/AMPK/フェロトーシス軸が癌治療の潜在的な治療標的であることを強調する。MIR497HG-Lの発現低下は、複数の癌種で細胞増殖を促進し、AMPK経路の活性化とフェロトーシスの抑制を介して作用することが示された。この知見は、MIR497HGの発現低下が複数の癌における予後バイオマーカーとして有用である可能性を示唆し、臨床現場での診断および治療戦略の開発に貢献する臨床的意義を持つ。
残された課題: AMPKの役割は、その二面性から議論の対象であり続けている。AMPK活性化は細胞周期停止と細胞死を誘導し、乳癌 (Hadad et al. 2009)、結腸直腸癌 (Baba et al. 2010)、胃癌 (Kim et al. 2013)、肝癌 (Zheng et al. 2013)、卵巣癌 (Li et al. 2014) など複数の癌で腫瘍進行に影響を与える一方で、代謝ストレス下では腫瘍増殖を促進することもある (Su et al. 2014)。この文脈依存的な機能性は、MIR497HG-LとAMPK/フェロトーシス経路の相互作用をさらに詳細に解明する必要があることを示唆する。また、MIR497HGの進化は、霊長類の脳発達に寄与するなど特定の利点を提供する可能性があるが、遺伝子調節ネットワークを不安定化させるリスクも伴い、その破壊が腫瘍形成感受性を増加させる可能性がある。この複雑な相互作用を理解するためには、今後の研究で、lncRNAがどのようにして古代の調節ネットワークに統合され、その機能がどのようにして癌発生に寄与するのかを、より広範な生物学的文脈で検討する必要がある。
方法
パンキャンサー分類は、以前の研究 (Hoadley et al. 2018) から得られた約10,000のTCGAサンプルを対象とした。RNA-seqリードカウントはTCGAおよびGTEx V8から取得した。差次的発現遺伝子 (DEG) はDESeq2 (Love et al. 2014) を用いて、log2(fold change) > 2または< -2、かつ調整済みp値 < 0.001で定義した。臨床データはcBioPortal (Cerami et al. 2012) から取得し、Rパッケージ「survival」を用いて生存確率を評価した。PC-lncRNAおよびPC-コード遺伝子は、生存分析において有意な影響 (p < 0.05) を持つパンキャンサーDEGとして同定された。
lncRNAの起源を追跡するため、16種の動物種にわたる包括的な検索を実施し、ENSEMBL v100およびRNA-seqデータセット (Hezroni et al. 2015; Necsulea et al. 2014) からlncRNA、mRNA、その他の非コードRNAを取得した。相同性検索はBLASTNを用いて行い、相互ランク (MR) 基準で相同体を同定した。進化系統樹はCVTree 4.0 (Zuo 2021) を用いて構築し、TimeTree 5 (Kumar et al. 2022) から分岐時間を推定した。コード遺伝子の起源も同様にBLASTNを用いて追跡した。
共発現分析では、各lncRNAとPC-コード遺伝子間のピアソン相関係数を用いて共発現関係を評価した。共発現は、絶対相関係数 |r| ≥ 0.6に基づいて定義された。lncRNAの配列長と選択的スプライシング転写産物の数はENSEMBLアノテーションから取得した。長さが延長されたlncRNAのカテゴリを特定するため、ヒトlncRNAをマカクおよびマーモセットのオルソログと比較した。延長された配列セグメントはMUSCLE (Edgar 2004) を用いてアラインメントし、BLASTN検索によりその起源を外部、遠位、内部、局所、混合の5つのカテゴリに分類した。トランスポゾン要素 (TE) の分析は、UCSCゲノムブラウザから取得したヒトTEアノテーションを用いて行った。
lncRNAの発現レベルは、7つの異なる臓器（脳、小脳、心臓、腎臓、肝臓、卵巣、精巣）にわたる発生RNA-seqデータ (Necsulea et al. 2014) から取得したRPKM値を用いた。組織特異性指数はYanai et al. (2005) の定義に従って計算した。ヒトおよびマウスESCのRNA-seqデータはGuo et al. (2020) から取得し、Trimmomatic (Bolger et al. 2014)、HISAT2 (Pertea et al. 2016)、SAMtools (Danecek et al. 2021)、StringTie (Pertea et al. 2016) を用いて解析した。ヌクレオチド多様性分析は、1000ゲノムプロジェクトから取得したヒトSNPデータを用いてVCFtoolsで行った。転写開始点 (TSS) シグナルはFANTOM5 (Lizio et al. 2015) のCAGE-seqデータから、ChIP-seqおよびDNase-seqピークはChIP-Atlas (Zou et al. 2024) から取得した。
細胞株として、H9ヒトESC、R1マウスESC、HeLa細胞、Caco-2細胞、CFPAC-1細胞を用いた。ルシフェラーゼレポーターアッセイは、pGL4.17 [luc2/Neo] レポーターベクターを用いてMIR497HGプロモーターの転写活性を評価した。RNA抽出、逆転写、qPCRはTRIzol試薬とTransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMixを用いて行い、2⁻ΔΔCt法で相対発現レベルを算出した。プラスミドとトランスフェクションにはpcDNA3.1(+)ベクターとLipoGene 2000 Plusを用いた。細胞増殖アッセイは、6ウェルプレートに細胞を播種し、2日ごとに細胞数をカウントして成長曲線をプロットした。MIR497HG-L過剰発現細胞のRNA-seqは、DNBSEQプラットフォームでシーケンスし、DESeq2を用いてDEGを同定し、KEGGprofileを用いてKEGG経路濃縮分析を行った。ウェスタンブロッティング、MDAアッセイ、Fe²⁺アッセイ、GSHおよびGSSGアッセイも実施した。AMPK経路およびフェロトーシス関連遺伝子はKEGGデータベースから取得した。統計分析はRパッケージまたはPythonパッケージ「scipy」を用いて行った。