- 著者: Kim R, et al.
- Corresponding author: Jihee Lee Kang (Ewha Womans University, Seoul, Korea)
- 雑誌: Cellular and Molecular Immunology
- 発行年: 2022
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- PMID: 36241874
背景
肺がんは世界的に最も一般的ながんであり、がん関連死の主要な原因である Sung et al. CACancerJClin 2021。診断時に約75%の患者が局所進行性または転移性疾患を呈しており、転移はがん細胞の移動と浸潤を伴う多段階プロセスである。腫瘍微小環境 (TME) における癌関連線維芽細胞 (CAF) は、腫瘍の増殖と転移を促進する上で重要な役割を担うことが知られている。CAFは、パラクリンシグナルを介してがん細胞の移動・浸潤を促進し、腫瘍の悪性化と転移性拡大を支援する。CAFはまた、腫瘍間質における細胞外マトリックス (ECM) を物理的にリモデリングし、がん細胞が上皮特性を維持しながら浸潤することを可能にする。しかし、CAFが腫瘍の進行をどのように制御するかの分子メカニズムは未解明な点が多い。
Notchシグナルは、TMEにおける線維芽細胞の活性化を制御する上で重要である。Notchシグナルの活性化は通常、リガンドを発現する細胞との直接的な相互作用によって厳密に制御されており、Notchシグナルの異常は発生異常やがんと関連付けられている。興味深いことに、Notch活性は文脈依存的に、がん促進的機能と腫瘍抑制的機能の両方と関連している。先行研究では、構成的に活性化されたNotchシグナルを持つ間質線維芽細胞が、Wnt誘導性シグナル伝達タンパク質1 (WISP-1) の上方制御を介して、黒色腫の増殖を抑制し、腫瘍血管新生を抑制することが示されている Kim et al. CellMolImmunol 2022。これらの知見は、他の種類のがんにおけるCAFにおけるNotch1の制御的役割の分子メカニズムを解明するためのさらなる研究を必要とする。
TMEにおける高レベルの細胞死と死滅する腫瘍細胞のクリアランスは、腫瘍特異的免疫に深く影響を与える。TMEでは、食細胞を介したクリアランスの免疫抑制効果が抗腫瘍免疫応答を阻害すると考えられている。しかし、腫瘍細胞はエフェロサイトーシス（死細胞の貪食）の認識を妨げることで免疫監視を回避できる。さらに、抗炎症性およびプロレゾルビン脂質オートコイドは、マクロファージによる貪食を介したデブリクリアランスを促進することで、複数のがん種におけるデブリ刺激性のがん進行を抑制する。重要なことに、我々の以前の研究では、紫外線 (UV) 照射アポトーシス肺がん細胞に曝露されたマクロファージが、がん細胞の極性破壊、上皮間葉転換 (EMT)、および浸潤を阻害することが示された Kim et al. CellMolImmunol 2022。しかし、CAFによるがん細胞のエフェロサイトーシスがTMEにおけるCAFの活性化を制御し、がんの進行と転移を予防するかどうかは、これまで不足しており、研究されていなかった。本研究は、アポトーシスがん細胞がCAFをリプログラミングして腫瘍転移を制御するメカニズム、特にNotch1-WISP-1軸の関与について、その詳細な分子機序が未解明であったというギャップを埋めることを目的とする。
目的
本研究の目的は、UV照射により誘導したアポトーシス肺がん細胞 (ApoSQ) が癌関連線維芽細胞 (CAF) に与える影響を解析し、Notch1-Wnt誘導性シグナル伝達タンパク質1 (WISP-1) シグナルを介するCAFリプログラミングによる転移抑制機序を in vitro および in vivo で明らかにすることである。具体的には、ApoSQがCAFの移動・浸潤能、CAF活性化マーカーの発現、およびTGFβ1シグナル経路に与える影響を評価する。さらに、ApoSQ-CAF共培養系における液性因子の変化を網羅的に解析し、WISP-1が主要なメディエーターであるかを検証する。Notch1シグナルがWISP-1産生を制御するメカニズム、特にアポトーシス細胞表面のNotchリガンドの役割を解明する。また、脳特異的血管新生阻害剤1 (BAI1)-Rac1エフェロサイトーシス経路とNotch1シグナルのクロストークの存在とその機能的意義を明らかにする。最終的に、129/Svシンジェニックマウスモデルを用いて、ApoSQの単回注射またはApoSQ-CAF条件培地 (CM) の腫瘍内注射が肺転移を抑制する効果をin vivoで検証し、その効果がNotch1-WISP-1シグナルに依存するかを評価する。
結果
In vitroでの移動・浸潤抑制: ApoSQ-CAF CMは、TGFβ1誘導性の344SQ細胞の移動および浸潤を顕著に阻害した (p<0.001)。この効果は、p-Smad2/3、p-Akt、MMP2/MMP12の発現抑制と関連していた (Fig. 1g-i)。ApoSQ-CAF CMは344SQ細胞の移動を約70%抑制し、浸潤を約80%抑制した (Fig. 1a, b)。ApoSQと直接共培養したCAF自体も移動・浸潤能が低下し、α-SMA、Col1α1、FnなどのCAF活性化マーカーのmRNAおよびタンパク質発現が減少した (Fig. 2e, f)。壊死細胞 (NecSQ) は同様の効果を示さず、アポトーシス特異的な反応であることが確認された (Fig. 2a-d)。ApoSQ曝露によりCAFのα-SMA発現が約50%減少し、移動・浸潤能も約60%低下した (Fig. 2a, b, e, f)。ApoSQ-CAF CMは、TGFβ1誘導性のCAFの移動・浸潤も抑制し、Smadおよび非Smadシグナル経路の活性化、MMP2/MMP12の発現を抑制した (Fig. 2h-j)。
WISP-1が主要メディエーター: サイトカインアレイ解析により、ApoSQ-CAF CMにおいてWISP-1とLIFが最も顕著に増加した因子として同定された (Fig. 3a, b)。WISP-1 siRNAノックダウンにより、ApoSQ-CAF CMの抗移動・抗浸潤効果が消失した (p<0.01)。抗WISP-1中和抗体でも同様の逆転効果が確認された (Fig. 3e, f, i)。組換えWISP-1 (rWISP-1) は、344SQ細胞とCAFの移動・浸潤を用量依存的に阻害し、TGFβ1誘導シグナルを抑制した。WISP-1は、344SQ細胞ではインテグリンαvβ3を介して、CAFではインテグリンαvβ5を介してTGFβ1シグナルを遮断することが示された (Fig. 4a, b)。rWISP-1は344SQ細胞の移動を約50%抑制し、CAFの移動を約60%抑制した。
Notch1シグナルによるWISP-1産生機序: ApoSQ曝露によりCAFでNotch細胞内ドメイン1 (NICD1)、Hes1、WISP-1のタンパク質およびmRNAが増加し、WISP-1分泌量も増加した (ELISA; p<0.001) (Fig. 5a-c)。WISP-1分泌量はApoSQ曝露により約3倍増加した。Notch1 siRNAノックダウンまたはγ-セクレターゼ阻害薬DAPT処理によりこれらの変化が抑制され、ApoSQ-CAF CMの抗移動・抗浸潤効果が消失した (Fig. 5g-k)。フローサイトメトリーでUV照射後の344SQ、A549、HCT116細胞 (n=3 cell lines) でDll1の表面発現が選択的に増加し、他のNotchリガンド (Dll3、Dll4、Jag1、Jag2) は変化なかった (Fig. 5l)。抗Dll1中和抗体およびDll1 siRNAによりCAFのNotch1活性化とWISP-1分泌が有意に減少し、アポトーシス細胞表面のDll1がNotch1シグナル開始のトリガーであることが確立された (Fig. 5n-r)。
BAI1-Rac1エフェロサイトーシスとのクロストーク: Rac1阻害薬NSC23766によりCAFのApoSQエフェロサイトーシスが抑制され、それに伴いNotch1シグナルとWISP-1分泌が低下した (Fig. 6k-n)。Rac1阻害薬はエフェロサイトーシスを約60%抑制した (Fig. 6k)。BAI1ノックダウンでエフェロサイトーシスとNotch1シグナルが両方抑制され、BAI1過剰発現でApoSQ取込率増加、Notch1活性化増強、WISP-1分泌増加が確認された (Fig. 6d-i)。Notch1 siRNAはRac1活性を抑制し (最大24時間後)、エフェロサイトーシスを減少させ、Notch1とBAI1-Rac1経路の双方向クロストークが示された (Fig. 6o, p)。
In vivo検証 (シンジェニックマウスモデル): 129/Svマウス (n=9-12 mice/group) への単回ApoSQ注射後にThy1+ CAFを分離したqRT-PCR解析では、CAF活性化マーカー (Acta2, Col1α1, Fn, Itgβ1, Spp1, Pdgfrα/β, Mmp1a/2/9/12) と増殖因子/ケモカイン (Vegfa, Hgf, Cxcl12, Cxcl14) のmRNAが減少し、Notch1、Wisp1 (Ccn4)、Hey1/2、Hes1/5のmRNAが増加した (Fig. 7e)。Notch1阻害薬LY3039478は、ApoSQ注射による肺転移結節数・転移率の減少を有意に逆転させ (p<0.05, Kruskal-Wallis検定)、CAF活性化マーカー減少とNICD1/WISP-1増加を免疫組織化学で確認した (Fig. 7b-d, Fig. 8a-c)。ApoSQ注射により肺転移結節数が約70%減少した (Fig. 7c)。
ApoSQ-CAF CMの腫瘍内注射 (週3回) では、CAF CM単独と比較して原発腫瘍重量・体積が減少し、肺転移結節数・転移率が低下した (Fig. 9c-h)。原発腫瘍重量は約50%減少し、肺転移結節数は約80%減少した (Fig. 9d, g)。転移関連遺伝子アレイ (84遺伝子) では、MMP2、Cdh6、Smad2、Kras、Igf1を含む15遺伝子が2倍超下方制御され、Cdkn2a、Rorβ、Ctnna1を含む8遺伝子が2倍超上方制御された (Fig. 9i)。細胞接着アレイではCdh2、Selp、Itgβ1、Cdh3、Itga3、Ncam1、Vcam1、Ncam2が2倍超下方制御された (Fig. 9j)。抗WISP-1中和抗体によるApoSQ-CAF CMのWISP-1免疫除去でin vivo抗腫瘍・抗転移効果が消失し、WISP-1が主要エフェクターであることをin vivoでも確認した (Fig. 9c-h)。rWISP-1の腫瘍内注射 (12.5および25 μg/kg、週3回) は用量依存的に腫瘍重量・体積および肺転移率を抑制し、CD326+腫瘍細胞のSmad2/3、FAK、ERK、Akt活性化およびMMP2/MMP12発現を抑制した (Fig. 10b-k)。
考察/結論
本研究は、アポトーシス肺がん細胞が貪食性の癌関連線維芽細胞 (CAF) を再プログラミングし、パラクリンおよびオートクリンメカニズムを介してがん細胞とCAFの移動・浸潤を抑制するという重要な役割を明らかにした。この抗移動・抗浸潤効果は特異的であり、肺がん細胞に限定されないことが示された。アポトーシス細胞単独のCMや壊死細胞のCMでは効果が認められなかったことから、アポSQとCAFの間の相互作用が、移動・浸潤を抑制する上で極めて重要であると考えられる。
先行研究との違い: 以前の研究では、Notch1-WISP-1軸が黒色腫の間質線維芽細胞の浸潤・転移調節に関与することが示されていたが、本研究は、肺がんにおいて腫瘍自身のアポトーシスシグナルがこのNotch1-WISP-1軸を起動するという上流制御機序を初めて明らかにした点で、これまでの報告とは異なる。また、WISP-1の腫瘍抑制機能に関する先行研究では、がん種やWISP-1濃度によって異なる結果が報告されていたが、本研究では低濃度のrWISP-1 (≤10 ng/ml) が344SQ細胞とCAFの移動・浸潤に同様の抑制効果を示し、TGFβ1シグナル経路を広範に抑制することが示された。
新規性: 本研究で初めて、アポトーシスがん細胞表面のDll1がCAFのNotch1シグナルを活性化し、WISP-1産生を誘導するという新規メカニズムを同定した。さらに、BAI1-Rac1エフェロサイトーシス経路とNotch1シグナル経路が正のクロストークを示すことで、CAFの最適なエフェロサイトーシス能力とWISP-1産生が維持されるという新知見も得られた。これは、エフェロサイトーシスが単なる死細胞除去機構に留まらず、CAFのリプログラミングにおける重要なシグナル変換に関与することを示唆する。
臨床応用: 本研究の知見は、CAFを標的としたアポトーシスがん細胞療法、またはアポトーシスがん細胞に曝露されたCAFのCMやWISP-1などのCM成分を用いた細胞フリー療法が、肺がんの進行と転移を抑制するための効果的な治療アプローチとなる可能性を示唆する。特に、rWISP-1の腫瘍内注射が用量依存的に腫瘍増殖と肺転移を抑制したことは、WISP-1をベースとした治療薬開発の臨床応用への道を開くものである。
残された課題: 今後の検討課題として、本研究で示されたCAFのリプログラミング機序がヒト肺がんCAFにおいても同様に機能するかを確認する必要がある。また、アポトーシス誘導細胞療法の臨床的実現可能性を検証し、TMEにおける免疫応答との相互作用をさらに詳細に解明することが残されている。さらに、WISP-1が複数のインテグリン受容体を介して機能するメカニズムや、がん種によるWISP-1の機能的差異の背景にある分子メカニズムを深く理解することも今後の研究方向性として重要である。
方法
試薬と抗体: DAPT (γ-セクレターゼ阻害薬) はSigma-Aldrichから、TGFβ1およびマウス組換えWISP-1 (rWISP-1) はR&D Systemsから、Notch1選択的阻害薬LY3039478はMedChemExpressから購入した。ウェスタンブロッティング、免疫蛍光、フローサイトメトリー、細胞ソーティングに使用した抗体は補足表S1に記載されている。
CAFの分離と細胞培養: CAFは、Kras変異マウス (KrasLA1) の肺腫瘍から、線維芽細胞特異的マーカーThy1を用いた磁気活性化細胞ソーティングにより分離した。CAFはα-MEM培地で培養し、不死化のためにTERTプラスミドを安定的にトランスフェクトした。ヒトがん細胞株 (A549、HCT116) およびマウス肺腺がん細胞株344SQはRPMI 1640培地で培養した。
細胞死の誘導: アポトーシスは、上皮がん細胞株を254 nmのUV照射に15分間曝露し、その後37℃で2時間培養することで誘導した。壊死細胞は、複数回の凍結融解サイクルにより作製した。アポトーシスと壊死は、Annexin V-FITC/ヨウ化プロピジウム染色とフローサイトメトリーで確認した。
CAFの培養とCAF CMの調製: CAFをX-VIVO 10培地で24時間血清飢餓させた後、アポトーシスまたは壊死がん細胞 (9 × 10^5 cells/ml) を含むX-VIVO 10培地で20時間刺激した。上清を回収し、CMとしてがん細胞またはCAFの刺激に使用した。
移動・浸潤アッセイ: 細胞の移動と浸潤は、フィブロネクチンまたはマトリゲルでコートしたTranswellチャンバーを用いて評価した。がん細胞 (1 × 10^5 cells/well) またはCAFを、TGFβ1 (10 ng/ml) の有無にかかわらずCMで前培養し、上部チャンバーに播種した。移動アッセイは16時間、浸潤アッセイは24時間行った。
免疫ブロット解析: 全細胞抽出物を用いて標準的なウェスタンブロッティングを実施した。抗体情報は補足表S1に記載されている。
定量的リアルタイムPCR (qRT-PCR): TRIzol試薬で総RNAを抽出し、逆転写後、SYBR GreenベースのqRT-PCRをQuantStudio™ 3 Real-Time PCR Systemで実施した。mRNAレベルはHprt mRNAレベルで正規化した。プライマー配列は補足表S2に記載されている。
サイトカインアレイ解析: CAF CM、ApoSQ-CAF CM、ApoSQ CMを用いてProteome Profiler Mouse XL Cytokine Array Kit (R&D Systems) でサイトカインアレイ解析を実施した。
免疫蛍光: ガラスカバースリップ上のCAFまたはパラフィン包埋腫瘍組織切片を固定し、透過処理後、一次抗体と蛍光標識二次抗体で染色した。DAPIを含むVECTASHIELD封入剤でマウントし、共焦点顕微鏡または倒立蛍光顕微鏡で観察した。
ELISA: CMおよび血清中のWISP-1およびLIFは、ELISAキット (R&D Systems) を用いて測定した。
一過性トランスフェクションとルシフェラーゼ活性アッセイ: CAFは、WISP-1、LIF、Notch1、またはBAI1を標的とするsiRNAまたはコントロールsiRNAをLipofectamine RNAi MAXでトランスフェクトした。遺伝子過剰発現実験では、マウスWISP-1遺伝子ORF cRNAクローン発現プラスミドまたはpEBB-BAI-FlagプラスミドをLipofectamine 2000でトランスフェクトした。ルシフェラーゼアッセイでは、Notch経路活性化に応答する4×CSLルシフェラーゼプラスミドとRenillaルシフェラーゼプラスミドをトランスフェクトし、Dual-Luciferase Assay System (Promega) で測定した。
WISP-1中和: CAF CMを抗マウスWISP-1中和抗体 (10 μg/ml) またはIgGアイソタイプコントロールと2時間インキュベートした。
フローサイトメトリー: UV照射アポトーシスがん細胞および生存がん細胞の表面Notchリガンド発現は、抗Dll1、Dll3、Dll4、Jag1、Jag2抗体とAlexa 488または594標識二次抗体を用いてフローサイトメトリー (ACEA Novocyte 3000) で解析した。
貪食アッセイ: アポトーシスがん細胞の貪食は、フローサイトメトリーと免疫蛍光解析で評価した。CAFをPKH26 (赤) で染色し、PKH67 (緑) 標識アポトーシス344SQ細胞と1:3の比率で24時間共培養し、貪食率を測定した。
Rac1活性アッセイ: CAFをDAPTまたはNotch1 siRNAで前処理し、ApoSQと共培養後、G-LISA Rac1活性化アッセイキット (Cytoskeleton) を用いてRac1活性を測定した。
マウス実験: 129/Svシンジェニックマウス (n=9-12 mice/group) に344SQ細胞 (1 × 10^6 cells) を皮下注射した。2日後、アポトーシス344SQ細胞 (1 × 10^7 cells) を単回注射した。Notch1阻害実験では、Notch1選択的阻害薬LY3039478 (8 mg/kg) を経口投与した。CM実験では、CAF CMまたはApoSQ-CAF CMを腫瘍内注射した。rWISP-1 (12.5および25 μg/kg) も腫瘍内注射した。6週間後、マウスを安楽死させ、皮下腫瘍の直径と重量、肺転移の有無と結節数、および免疫蛍光染色された原発腫瘍の組織学的特徴を評価した。
Thy1+ CAF、CD326+腫瘍細胞、CD11b+腫瘍関連マクロファージの分離: 腫瘍組織を解離後、抗CD45、CD68、CD31、CD326抗体で非CAF細胞を除去した。上清中のThy1+ CAFはCD90.2 MicroBeadsでソーティングした。CD326+上皮腫瘍細胞とCD11b+腫瘍関連マクロファージ (TAM) は、それぞれCD326およびCD11b MicroBeadsで分離した。
逆転写PCRアレイアッセイ: 分離したCD326+腫瘍細胞の腫瘍転移関連遺伝子と、Thy1+ CAFの細胞外マトリックスおよび接着分子関連遺伝子の発現プロファイリングは、Mouse Tumor Metastasis RT2 Profiler™ PCR ArrayおよびMouse Extracellular Matrix and Adhesion Molecules RT2 Profiler™ PCR Array (Qiagen) を用いて実施した。
統計解析: 2群間比較には両側Studentのt検定、多重比較にはKruskal-Wallis検定後にDunnの事後検定を実施した。p値 < 0.05を有意とした。