- 著者: Lu
- Corresponding author: Chi-Ming Li (chimingl@amgen.com)
- 雑誌: CancerImmunolRes
- 発行年: 2026
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- DOI: N/A
- category: Clinical-NSCLC-Driver-Other
- topics: KRAS inhibition, Tumor Microenvironment, Immunotherapy, Dendritic Cells, T Cells, Macrophages
- tags: KRASG12C, MEK inhibitor, PD-1 blockade, single-cell RNA-seq, spatial transcriptomics, syngeneic models
- entities: KRAS, MEK, PD-1, cDC, T cell, macrophage, Sotorasib, Mirdametinib
背景
KRAS変異は、がん診断の約7分の1に認められる最も頻繁な癌遺伝子変異であり、KRAS G12C変異を有する癌患者に対する変異特異的KRAS阻害剤が承認されている (Skoulidis et al. 2021; Janne et al. 2022)。これらの薬剤は、約半数の患者で客観的奏効率を示している。しかし、治療効果を最大化するためには、KRAS阻害によって引き起こされる腫瘍内変化について、より深い理解が必要とされている。KRASは、細胞増殖、生存、細胞骨格再編成、遊走など多様なプロセスを制御する転写因子を活性化するGTPaseである。KRAS阻害は、癌細胞にDNA損傷応答の活性化 (Luo et al. 2009; Yang et al. 2021) や細胞外マトリックス (ECM) タンパク質、増殖因子、免疫調節性サイトカインの産生刺激 (Tsai et al. 2022; Fedele et al. 2021; Mugarza et al. 2022) を通じて、その環境に影響を与える。
KRAS阻害は、悪性細胞だけでなく、腫瘍微小環境の免疫細胞や正常常在細胞にも影響を及ぼす。特に、KRAS阻害は腫瘍内で炎症促進性の変化を引き起こし、従来の樹状細胞 (cDC)、T細胞、マクロファージの浸潤を増加させる。また、免疫チェックポイント阻害剤との併用により、マウス癌モデルで長期的な適応T細胞応答を誘導することが報告されている (Canon et al. 2019; Briere et al. 2021; Boumelha et al. 2022)。MAPK経路の下流に作用し、変異癌細胞に選択的ではないMEK阻害剤もT細胞浸潤を促進するが、特定の骨髄系細胞集団の頻度や抗原提示活性を低下させる点でKRAS阻害とは異なる (Mugarza et al. 2022; Canon et al. 2019)。このことは、KRAS阻害が悪性細胞の生存能力、腫瘍免疫原性、宿主免疫のライセンス供与に特異的な特性を与え、癌細胞を排除しやすくすることを示唆している。しかし、標的療法後の腫瘍細胞と免疫細胞間のクロストークのメカニズムは、この文脈ではまだ十分に理解されていない点が課題として残されている。免疫を活性化する、あるいは制限する特定の細胞特性を定義することは、より持続的な患者応答を促進する治療法の改良を可能にする。この点において、KRAS阻害が免疫応答に与える影響の分子メカニズムは未解明な部分が多く、さらなる研究が不足している。
本研究では、単一細胞RNAシーケンス (scRNA-seq)、フローサイトメトリー、空間トランスクリプトミクスを用いて、KRAS阻害とMEK阻害後の細胞変化が免疫応答をどのように異なる形で刺激するかを体系的にプロファイリングした。
目的
本研究の目的は、KRAS G12C阻害剤とMEK阻害剤が腫瘍微小環境における腫瘍細胞の運命と免疫応答に与える影響を、単一細胞レベルで詳細に解明することである。特に、両阻害剤がMAPK経路を標的とするにもかかわらず、腫瘍細胞の適応、従来の樹状細胞 (cDC) の成熟、T細胞の増殖、マクロファージの分極にどのような異なる影響を与えるかを明らかにすることを目的とした。さらに、KRAS G12C阻害と抗PD-1療法の併用が、抗腫瘍免疫応答をどのように増強し、腫瘍微小環境における細胞間コミュニケーションネットワークにどのような影響を与えるかを評価することも目的とした。これにより、KRAS阻害が抗腫瘍免疫を特異的に活性化する分子メカニズムを特定し、将来の治療戦略の最適化に貢献する枠組みを提供することを目指した。
結果
KRASおよびMEK阻害による腫瘍細胞の転写適応: KRAS G12C阻害剤 (Sotorasib/AMG 510) とMEK1/2阻害剤 (Mirdametinib) は、CT-26 KRAS G12C腫瘍において異なる腫瘍細胞の状態を誘導した。治療後5日間の投与により、Sotorasib群で64%、MEKi群で34%の腫瘍体積減少が認められた (Figure S1B)。scRNA-seq解析により、KRAS G12C阻害剤とMEKiは、代謝および細胞周期制御に影響を与える異なる腫瘍細胞の運命の適応を促進することが示された。KRAS G12C阻害剤はCT26.OgnおよびCT26.Nfat5細胞状態を最も顕著に富化させ、MEKiはCT26.InmtおよびCT26.Cxcl10を富化させた (Figure 1D)。両阻害剤間で63%の差次的発現遺伝子 (DEGs) が共通していたが、細胞周期関連遺伝子 (Cdkn1a, Bax) やDNA修復遺伝子 (Hmgb2) など、KRAS G12C阻害剤またはMEKiに特有の発現プログラムが確認された (Figure 1E-F)。KRAS G12C阻害剤後の上位アップレギュレート遺伝子には、癌の増殖 (Aspn, Cav1) と抑制 (Ogn, Sdpr) に関連するものが含まれた。経路解析では、ECMリモデリングや糖タンパク質/脂質代謝など、複数の腫瘍細胞プロセスが関与していることが示唆された (Figure 1G)。一方、MEKiで治療された腫瘍細胞は、異なる代謝メディエーター (Mgp, Inmt, Eva1b) とインターフェロン応答遺伝子シグネチャ (Isg15, Stat1, Cxcl10) を発現した (Figure 1H)。LL/2腫瘍におけるKRAS G12C阻害剤とMEKiの併用治療は、単剤療法と比較して有意な腫瘍退縮をもたらした (Figure 1L)。
KRASおよびMEK阻害による免疫活性化動態の差異: KRAS G12C阻害剤、KRAS G12C阻害剤と抗PD-1併用療法 (Combination)、またはMEKiで治療されたマウスでは、腫瘍体積が大幅に減少し、浸潤免疫細胞の密度が50%以上増加した (Figure 2B-C)。治療後に腫瘍退縮を示した群では、T細胞の割合が増加し、単球が減少し、他の免疫細胞ではより微妙な変化が認められた (Figure 2F)。T細胞の増加は、主に特定のCD8 T細胞状態の拡大によって引き起こされた (Figure S5B-C)。興味深いことに、マクロファージの割合はPD-1依存的に増加したが、Combination群 (Macro.C1qc) と抗PD-1単独群 (Macro.S100a9) では異なるマクロファージ細胞状態が拡大した (Figure S5D)。KRAS G12C阻害剤はT/NK活性化の調節因子 (Stat4, Itga4, Itgb1)、従来の樹状細胞 (cDC) 活性化の調節因子 (Il12b, Cd40, Cd44)、および骨髄系細胞の持続性 (Zeb2, Traf1) をアップレギュレートしたが、MEKiでは認められなかった。MEKiでは、細胞傷害性リンパ球における特定の炎症性サイトカイン応答遺伝子 (Ifitm2/3, Tnfrsf9, Lgals3)、cDC活性化調節因子 (Prdx5, Lamp1)、およびマクロファージ代謝メディエーター (Slamf9, Ch25h) がKRAS G12C阻害剤よりも高かった (Figure 2H)。
KRAS阻害による従来の樹状細胞 (cDC) の成熟促進: KRAS G12C阻害剤は、cDC1の拡大と、cDC活性化の指標であるmregDCの拡大を促進した (Figure 3A)。差次的発現解析では、mregDCの富化がcDC1の活性化と成熟に起因することが示唆された。KRAS G12C阻害剤群ではcDC1特異的シグネチャの発現が高く、cDC2シグネチャの発現が低かった (Figure 3B, Figure S6F)。擬時間軌跡解析では、KRAS G12C阻害剤腫瘍においてcDCの平均成熟度が高いことが示され、成熟の加速と一致した (Figure S6G)。KRAS G12C阻害剤は、cDC1において成熟関連シグネチャ (Cd80, Fscn1, B2m) をアップレギュレートしたが、インターフェロン応答シグネチャは相対的に減少した (Figure 3C)。KPC KRAS G12C腫瘍担持マウスでも同様の所見が観察された (Figure S7D)。KRAS G12C阻害剤腫瘍では、cDC1/cDC2の両方でCD40のアップレギュレーションが観察されたが、MEKi治療腫瘍では認められなかった (Figure 3F, Figure S7E)。MEKi腫瘍ではCD86のみがアップレギュレートされた (Figure 3G, Figure S7F)。骨髄由来樹状細胞 (BMDC) と癌細胞の共培養実験では、KRAS G12C阻害剤がCD40+CD86-cDC1およびCCR7+cDC1の有意な増加を誘導することが示された (Figure 3H-I)。
KRAS阻害腫瘍における内皮細胞および線維芽細胞を介したシグナル伝達: LIANAを用いた細胞間コミュニケーション解析により、KRAS G12C阻害剤腫瘍では、腫瘍細胞と内皮細胞 (EC) および線維芽細胞との間で最も多くの相互作用が検出された (Figure 4B)。KRAS G12C阻害剤後のcDCに対する上位リガンドの多くは、EC/線維芽細胞によって最も高く発現されていた (Figure S9D)。KRAS G12C阻害剤群におけるECおよび線維芽細胞からの相互作用には、細胞接着 (Itga4, Itga8/Itgb1, Cd44) およびT細胞活性化 (Notch2, Dpp4, Rxra) を媒介するcDC受容体が関与していた (Figure 4E-G)。BMDCと癌細胞の共培養では、KRAS G12C阻害剤がITGA4またはITGB1を差次的にアップレギュレートするには不十分であり、非腫瘍細胞を介した中間シグナル伝達の必要性が示唆された (Figure S12E)。
KRASおよびMEK阻害によるCD8 T細胞増殖とマクロファージ分極の差異: scRNA-seqデータから、CD8T.GzmaおよびCD8T.Cxcr6の2つのCD8 T細胞状態が、KRAS G12C阻害剤およびMEKi後にCD45+細胞の割合として拡大した (Figure 5B)。これらの細胞状態は、エフェクターT細胞集団であり、疲弊前分化状態、クローン的に拡大したヒト腫瘍浸潤T細胞状態との転写相関、高い細胞傷害性遺伝子およびサイトカイン発現、低いナイーブ遺伝子発現によって特徴づけられた (Figure S13D-F)。KPC KRAS G12C腫瘍におけるフローサイトメトリー解析では、KRAS G12C阻害剤後にCD8 T細胞の頻度と細胞傷害性マーカー (GZMB, CD107a) を発現する細胞の割合が増加した (Figure 5D, Figure S14A-C)。特に、KRAS G12C阻害剤後には、MEKiと比較して、CXCR6+CD8 T細胞の活性脱顆粒 (CD107a) を示す割合が有意に高かった (Figure 5E, Figure S14D)。MEKiでは、Ki-67+ T細胞の増殖がKRAS G12C阻害剤と比較して低かった (Figure 5F)。KRAS G12C阻害剤後には、より大きなT細胞クローンタイプとT細胞拡大の程度 (STARTRAC-expansion index) が認められた (Figure 5G, Figure S14H)。
KRAS G12C阻害剤腫瘍では、MoMac-TrajectoryBおよびMoMac-TrajectoryCに属する細胞の割合が高かった (Figure 5J)。フローサイトメトリー解析では、KRAS G12C阻害剤後にPD-1+およびPD-1+CD206lowマクロファージ (MoMac-TrajectoryBおよびC) が増加していることが確認された (Figure 5K, Figure S15G-H)。KRAS G12C阻害剤後の単球/マクロファージリガンドとして、免疫抑制性リガンドTgfb1およびNamptがT細胞に対して上位に同定された (Figure 5C, Figure S15J)。
PD-1阻害とKRAS阻害の併用によるT細胞およびマクロファージの抗腫瘍応答の増強: KRAS G12C阻害剤と抗PD-1の併用療法 (Combination) は、GZMA+およびCXCR6+CD8エフェクターT細胞集団をさらに増加させた (Figure 6B-C, Figure S16B-C)。STARTRAC-transition index解析では、Combination治療群ではKRAS G12C阻害剤単独群と比較して、CD8T.GzmaとCD8T.Ccl3/CD8T.Cd200間の分化速度が低下していることが示された (Figure 6E)。これは、Combination治療後の最終分化および細胞死への進行が減速していることを示唆している。また、T細胞における平均擬時間値の低下 (Figure S16G) と、治療前後の時点でのクローンタイプ持続性の増加 (Figure S16H) と一致した。
抗PD-1治療は単球浸潤を増加させたが (Figure 6F)、KRAS G12C阻害剤による癌遺伝子阻害効果なしではマクロファージの分化や浸潤を増加させるには不十分であった (Figure 6G-H)。Combination治療は、KRAS G12C阻害剤単独と比較して、CD11C+マクロファージの数をさらに増加させた (Figure 6G)。Combination治療後のTAMは、MoMac-TrajectoryAに運命づけられたマクロファージの割合が劇的に高かった (Figure 6I-J)。MoMac-TrajectoryAのTAMは、ヒトCRCにおける高C1QC低SPP1遺伝子シグネチャと最も類似しており、これはより良好な予後と関連している (Figure 6M)。
KRAS G12C阻害と抗PD-1の併用による自然免疫シグナル伝達の伝播: Visium空間トランスクリプトミクス解析により、Combination治療後の連続腫瘍切片における免疫活性の増強が確認された (Figure 7A)。スポットの差次的発現解析では、KRAS G12C阻害剤/Combination治療群とVehicle/抗PD-1群の間で、腫瘍細胞適応、免疫細胞活性化、癌持続性に関する同様の発現パターンが示された (Figure 7C)。Combination治療に関連するREACTOME経路解析では、T細胞経路 (ZAP70/CD3リン酸化) および骨髄系活性化 (補体、自然免疫、抗原提示) が抗PD-1と比較して有意に富化していた (Figure S18A-B)。cDCおよび顆粒球は、KRAS G12C阻害剤およびCombination治療後に活性腫瘍領域で増加した (Figure S18D-E)。cDCサブセットの解析では、Combination治療後にcDC1密度がKRAS G12C阻害剤またはVehicleと比較して有意に高かった (Figure 7D)。線維芽細胞/ECとcDC1/mregDC受容体間の共発現もCombination治療後に増加した (Figure 7E-F, Figure S18H)。特に、cDC成熟を調節するNotch2およびRxraは、それぞれのリガンドとの共発現が増加した。
考察/結論
本研究は、KRAS G12C阻害剤とMEK阻害剤という2つのMAPK阻害剤が、腫瘍細胞の運命と従来の樹状細胞 (cDC)、T細胞、マクロファージにおける免疫機能に異なる影響を与えることを体系的にプロファイリングした。
先行研究との違い: これまでの研究では、KRAS G12C阻害剤による腫瘍細胞の適応がin vitroで同定されていたが (Xue et al. 2020)、本研究はin vivoにおいて、異なる標的療法が細胞静止/細胞毒性を超えて、腫瘍細胞が腫瘍微小環境とどのように相互作用するかを再構築するメカニズムを分類した点で新規性がある。特に、KRAS G12C阻害剤がcDC1における特定のmregDCマーカーの発現を加速させることで、腫瘍内免疫応答を調節することを示した点は、これまでの報告とは異なる知見である。
新規性: 本研究で初めて、KRAS G12C阻害剤がcDC1の成熟を促進し、CD8 T細胞の増殖とエフェクター機能を高める一方で、MEK阻害剤がT細胞の増殖能力を低下させることを明らかにした。また、KRAS G12C阻害剤と抗PD-1療法の併用が、エフェクターT細胞の状態をさらに拡大し、クローン持続性を高め、抗腫瘍性の炎症性マクロファージを誘導することで、単独療法よりも高い全生存率と抗腫瘍免疫応答の増強をもたらすことを新規に示した。さらに、KRAS阻害腫瘍における内皮細胞および線維芽細胞を介したcDCへのシグナル伝達の重要性を予測した点も新規な発見である。
臨床応用: 本研究の知見は、KRAS変異を有する癌患者に対する治療戦略の最適化に重要な臨床的意義を持つ。KRAS G12C阻害剤とPD-1阻害剤の併用療法が、T細胞およびマクロファージを介した免疫を増強する可能性を示唆しており、これはKRAS G12C変異癌の治療成績向上に繋がる可能性がある。特に、KRAS G12C阻害剤がcDCの成熟を促進し、T細胞の活性化を誘導するメカニズムは、免疫療法との併用戦略を設計する上で重要な情報となる。また、MEK阻害剤がT細胞の増殖を抑制する一方で、免疫抑制性TAMを減少させるという異なる免疫活性化特性を持つことは、MEK阻害剤と組み合わせるべき免疫標的療法の選択に影響を与える。
残された課題: 本研究にはいくつかのlimitationがある。第一に、皮下腫瘍モデルを使用しているため、既存の組織常在免疫細胞集団による交絡効果なしに治療駆動型の免疫浸潤をプロファイリングできる利点がある一方で、腫瘍がscRNA-seqでプロファイリングするには小さくなりすぎる前に免疫動態をプロファイリングできる時間的窓が限られており、腫瘍とネイティブ組織間の相互作用も限定的である。将来の研究では、ヒト腫瘍構造の側面をよりよく反映するオルソトピックモデルや自然発生モデルを用いて、長期的な免疫動態を解明し、非悪性細胞の関与についてより深い洞察を得る必要がある。第二に、単一細胞および空間解析は、KRAS阻害された腫瘍細胞、EC/線維芽細胞、およびcDC間の相互作用が強力な免疫を誘発すると予測したが、各細胞型の機能的寄与を解明するためには、さらなる摂動研究が必要である。最後に、AMG 510のKRAS G12Cに対する生化学的選択性を以前に評価しているが (Canon et al. 2019)、in vivoでのオフターゲット活性を完全に排除することは困難である。今後の研究では、これらの課題を克服し、本研究で同定された分子メカニズムの機能的検証を進める必要がある。
方法
本研究では、KRAS G12C阻害剤 (Sotorasib/AMG 510) およびMEK1/2阻害剤 (Mirdametinib) の腫瘍微小環境への影響を評価するため、CT-26 KRAS G12C腫瘍モデルおよびKPC KRAS G12C腫瘍モデルを用いたin vivo実験を実施した。治療群は、Vehicle、KRAS G12C阻害剤単独、MEKi単独、抗PD-1単独、およびKRAS G12C阻害剤と抗PD-1の併用療法とした。
細胞株と動物モデル: CT-26 KRAS G12C細胞は、CRISPR技術を用いて作製された。KPC M2T2-B2 KRAS G12C細胞株は、親KPC M2T2株のCRISPR編集誘導体である。LL/2 (LLC1) Lewis肺癌細胞株は、KRAS p.G12Cを内在的に発現する。動物実験は、Amgen Institutional Animal Care and Use Committeeのガイドラインに従って実施された。雌性Balb/cマウス (mouse strain) をCT-26研究に、雌性C57BL/6マウスをKPC M2T2-B2およびLL/2研究に使用した。腫瘍は皮下移植され、腫瘍体積は電子デジタルキャリパーで週2回測定された。
単一細胞RNAシーケンス (scRNA-seq): scRNA-seqは、腫瘍細胞およびCD45+免疫細胞の両方に対して実施された。細胞は、10x Genomics Chromium NextGEM Single Cell 5’ v1.1または3’ v3.1化学を用いてカプセル化された。FASTQファイルはcellranger v6.0.0を用いてマウス参照ゲノムにアラインメントされた。外れ値細胞バーコード、低品質細胞、およびダブレットは除去された。データはSoupXおよびDoubletFinderを用いて処理された。細胞の分類は、SingleRを用いたImmGen参照RNA-seqデータへのマッピングと、マーカー遺伝子発現に基づくコミュニティメンバーシップによる分類洗練を組み合わせた多段階アプローチを用いて実施された。細胞状態の分類は、Louvainクラスタリングを用いて最適なクラスタリング解像度を決定することで実施された。細胞型組成の統計解析には、Dirichlet-Multinomial回帰が用いられた。差次的発現解析にはMASTが用いられ、調整p値<0.05およびlog2-fold change>|0.25|の遺伝子が有意とされた。細胞分化軌跡の決定には、SlingshotおよびRNA velocityが用いられた。細胞間コミュニケーション解析にはLIANAが用いられ、NicheNetのパーソナライズされたページランクアルゴリズムを用いて上位リガンドが同定された。TCRクローンタイプ解析は、STARTRACのShannonエントロピー指数を用いて実施された。
フローサイトメトリー: 腫瘍浸潤免疫細胞のフローサイトメトリー解析は、CT-26およびKPC腫瘍から調製された単一細胞懸濁液を用いて実施された。T細胞、マクロファージ、樹状細胞の表現型解析には、特定の抗体パネルが使用された。絶対細胞数は、CountBright™ Absolute Counting Beadsを用いて決定された。データ解析はFlowJoソフトウェアv10を用いて実施された。
バルクRNAシーケンス: KPC腫瘍から分離されたCD45+免疫細胞およびcDCに対してバルクRNAシーケンスが実施された。RNAはRNeasy Micro Kitを用いて単離され、SMART-Seq mRNA LP Kitを用いてcDNAが合成された。ライブラリはNextera XT DNA Library Preparation Kitを用いて調製され、Illumina NextSeq 2000でシーケンスされた。リードはQiagenのOmicsoft OSAアライナーを用いてマウス参照ゲノムにアラインメントされ、DESeq2を用いて差次的遺伝子発現解析が実施された。
空間トランスクリプトミクス: 空間トランスクリプトミクスは、Visium新鮮凍結法を用いてCT-26 KRAS G12C腫瘍に対して実施された。組織は10 µm厚の切片に切断され、Visiumスライドに配置された。シーケンスされたライブラリはSpace Rangerソフトウェアを用いて処理され、Seuratを用いてデータ精製およびクラスタリングが実施された。細胞型空間表現は、Tangramアルゴリズムを用いてscRNA-seqデータをVisiumデータセットに投影することで生成された。差次的発現解析はWilcoxon rank-sum testを用いて実施され、細胞組成差次的解析は片側順列検定を用いて実施された。リガンド-受容体ペアの共発現頻度は、片側Dunn検定を用いて解析された。
in vitro実験: 骨髄由来樹状細胞 (BMDC) は、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド (Flt3L) を用いて分化された。BMDCは、KRAS G12C阻害剤、MEKi、またはVehicleで処理された3種類のKRAS G12C細胞株と共培養された。表現型解析はフローサイトメトリーを用いて実施された。