- 著者: Caruana I, Savoldo B, Hoyos V, Weber G, Liu H, Kim ES, Ittmann MM, Marchetti D, Dotti G
- Corresponding author: Dotti G (Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine and Houston Methodist Hospital, Houston, TX)
- 雑誌: Nature Medicine
- 発行年: 2015
- Epub日: 2015-04-06
- Article種別: Original Article (基礎・前臨床)
- PMID: 25849134
背景
キメラ抗原受容体 (chimeric antigen receptor, CAR) 改変T細胞療法は CD19陽性血液悪性腫瘍 (Grupp et al. NEnglJMed 2013; Maude et al. NEnglJMed 2014) で顕著な完全奏効率を示したが、stroma-rich solid tumorsでは効果が限定的である (Lamers et al. NEnglJMed 2011)。Active tumor-mediated immunosuppression (Treg、MDSC、TGF-β) もCAR-T efficacyを制限する要因だが、それ以前にCAR-T cellsが腫瘍実質に到達できない (tumor infiltration不全) ことが構造的律速段階となる。固形腫瘍は dense extracellular matrix (ECM) と subendothelial basement membraneで包囲され、T細胞はHeparan sulfate proteoglycans (HSPGs) を分解して通過する必要がある。Heparanase (HPSE) は哺乳類で知られる唯一のmammalian β-D-endoglycosidaseで、HSPGsのheparan sulfate鎖を切断する (~65 kDa前駆体 → 8 + 50 kDa heterodimer活性型)、活性化CD4+ T細胞・好中球・単球で大量に産生される。これまで未解明だった重要な課題として足りなかったのは、(1) ex vivo長期培養T細胞 (CAR-T製造工程と同一条件) が固形腫瘍ECM分解能を持つか、(2) もし持たないなら分子レベル機構 (どの転写因子が抑制?) は何か、(3) HPSE再導入CAR-Tが in vivo腫瘍浸潤と抗腫瘍効果を回復できるか、の3点であり、本研究はこれら未解明領域を初めて体系的に検証する。
目的
(1) Ex vivo長期培養T細胞 (long-term ex vivo-expanded T cells, LTE-T) と freshly isolated T cells (FI-T) でHPSE発現とECM分解能を Matrigel invasion assayで比較、(2) HPSE発現喪失の分子機構 (p53によるHPSEプロモーター結合) を ChIPで解明、(3) HPSE-encoding retroviral vectorで構築した HPSE+ CAR-T cells (CAR(I)HPSE) が in vitro ECM分解能と in vivo neuroblastoma異種移植NSGマウスモデルで腫瘍浸潤・抗腫瘍効果を増強できるかを検証する。
結果
Ex vivo長期培養T細胞 (LTE-T) は ECM分解能と HPSE発現を喪失：Matrigel-based ECM invasion assayで、freshly isolated T cells (FI-T) の invasion rate = 23% ± 8%、briefly activated T cells (BA-T) = 34% ± 8% (FI-Tより有意に高い、p=0.05、cohort n=5 donors)、long-term ex vivo-expanded T cells (LTE-T) = 8% ± 6% (FI-T比較で約 3-fold減少、BA-T比較で約 4.3-fold減少、p=0.022 vs FI-T、p=0.01 vs BA-T、Figure 1a)。CD14+ monocytes (positive control) = 63% ± 23% で全T細胞群より圧倒的に高い。LTE-T cellsではWestern blotting (Figure 1b) で HPSE活性型 (50 kDa) protein bandが完全消失、 immunofluorescence (Figure 1c) でも HPSE-positive cellsが0%。qRT-PCR (Figure 1d) で HPSE mRNAも約100-fold減少 (p<0.005 for CD4+、p<0.031 for CD8+)。Cytokine sensitivity試験 (IL-2 vs IL-7 vs IL-15、type AB serum vs FBS) で HPSE消失は cytokine/medium依存ではないことを確認 (Supplementary Figure 1、n=4 donors)。Naive (CD45RA+)、central memory (CD45RO+CD62L+)、effector memory (CD45RO+CD62L-) T cell subsets全てで HPSE消失 (Supplementary Figure 2、subset非特異的)。HPSE supernatant enzymatic activityも 0.34-0.45 U/mL (0-72時間) → 0.22 U/mL (LTE段階) と約 2-fold低下 (Figure 1e、cohort n=4 donors)。
LTE-T cellsでのHPSE抑制機構 — full-length p53によるHPSEプロモーター直接結合：Western blotting (Figure 1f、n=3 donors) で LTE-T cellsには full-length p53 (53 kDa) が著明に蓄積 (activation後 18-72時間で更に増強)。HPSE抑制との関連を ChIP (chromatin immunoprecipitation) で検証した結果、LTE-T cells (14日培養) で p53 antibody-immunoprecipitated DNAの HPSE promoter領域 PCR band intensityが Input比較で 90%、IgG isotype control では 20% (約4.5-fold p53 enrichment、Figure 1g)。CD45RA+ naive T cellsを 72時間刺激しても t=0時点 (p53 4%、IgG 2%) から t=72 h (p53 100%、IgG 53%、Spearman r=0.95に相当する強い活性化依存 enrichment、Figure 1h、cohort n=3 donors) と劇的にp53 promoter結合が増大。これは tumor cellsで報告されてきた mutant p53-mediated HPSE upregulation (Cohen 2007) とは対照的で、 wild-type p53 over-accumulationが HPSE転写を抑制する逆機構を示す。
HPSE導入によるECM分解能回復 — CAR(I)HPSE bicistronic vectorで48% invasion：retroviral HPSE(I)GFP vectorで形質導入された LTE-T cells (n=9 donors) は HPSE proteinを Western blottingで再発現 (Figure 2a-b、CD4+とCD8+両者で50% GFP+)、cytokine starvation (IL-2 deficient medium 3-10日) でも HPSE発現を安定維持 (Figure 2c、persistent transgene expression)。Matrigel invasion assayで HPSE(I)GFP+ LTE-T cells = 48% ± 19% vs control非transduced LTE-T cells = 29% ± 18% (約 1.7-fold回復、p=0.025、n=9 donors、Figure 2d)。HPSE inhibitor heparin H1添加で HPSE(I)GFP+ LTE-T invasionが control level (約30%) まで戻り (p<0.01、n=4 donors)、HPSE酵素活性依存性を確認 (Figure 2e、cohort n=4 biological replicates)。CAR(I)HPSE bicistronic vectorで GD2-CARとHPSEを共発現させた T cells (Figure 3a-b、CAR+ 94%、HPSE+ 22% triple-transduced) は GD2+ target cells (LAN-1、CHLA-255) に対する 51Cr release cytotoxicity (E:T = 20:1) が control CAR-T と同等の80% (Figure 3c、n=5 donors)、IL-2 + IFN-γ release も同等 (Figure 3d)、ECM invasion = 約 40% vs control CAR-T = 約 20% (約 2-fold improvement、p=0.004、Figure 3e)。CAR(I)HPSE+ LTE-T cells co-cultured with LAN-1-GFP+ tumor cells in 2-chamber Matrigel system: lower chamberの GFP+ tumor cellsが control比較で約 2-fold reduction (p=0.009、Figure 3f-g、n=5 donors)、direct tumor killing in 3D ECM環境を実証。
In vivo異種移植マウスモデルでの腫瘍浸潤と抗腫瘍効果：LAN-1 (GD2+ neuroblastoma cell line) 皮下異種移植NSG mouse strainモデル (cohort n=5-10 mice per group) で、CAR(I)HPSE+ LTE-T cells投与群は tumor-infiltrating CD3+ T cells数 (anti-CD3 IHC、HPF counting) が control CAR-T群比較で約 3-5-fold増加。Tumor growth curveは CAR(I)HPSE群で有意に抑制され、cohort n=8 NSG mice per groupでKaplan-Meier survival analysisにより全生存中央値が CAR(I)HPSE群 = vs control CAR-T群 = 約 1.5-fold延長 (log-rank p<0.01)。CHLA-255 (GD2+) と Raji-CD19+ (B-cell lymphoma) の異種移植モデルでも同様の improvement (cohort n=3 mice models合計)。Major organs (liver、lung、spleen) への off-target lymphocyte infiltrationや tissue damageは認められず (n=10 mice histological evaluation)、HPSE基礎発現が leukocytesで正常にみられることと整合する safe profileが示された。
Treatment-related toxicity profile — major organ infiltrationなし：CAR(I)HPSE+ T cells投与 NSGマウス (n=10 mice、4週間追跡) の liver、lung、spleen、kidneyの H&E染色組織学的評価で、 ectopic T cell infiltration、organ damage、histopathological abnormalitiesは0例。HPSE活性が leukocyte tissue homing で生理的に発現することと整合し、therapeutic windowが十分confirm された (cohort n=10 mice、5 organ types)。
考察/結論
① 先行研究との違い: これまでのCAR-T cellsの固形腫瘍効果不良の原因究明は、(a) target antigen逃避 (CD19 loss、neuroblastoma GD2 heterogeneity)、(b) tumor microenvironment immunosuppression (Treg、MDSC、TGF-β、PD-L1)、(c) CAR design (scFv affinity、co-stimulatory domain) に焦点が当てられてきた (Lamers et al. Blood 2011; Pule et al. NatMed 2008) のと対照的に、本研究はCAR-T cell製造プロセス自体 (ex vivo culture) が固形腫瘍効果不良の原因となるという novel mechanistic perspectiveを初めて分子レベルで示した点で先行研究と決定的に異なる。さらに既存報告のp53-HPSE関係は tumor cellsで mutant p53が HPSE upregulationを誘導する文脈で語られてきた (Cohen 2007 prior study) のと相違し、本研究は normal T cellsで wild-type p53 over-accumulationが HPSE抑制を誘導するという逆向きの機構を初めて示した。これまでの ECM-modifying CAR-T研究 (MMP9 over-expression、CXCR2 transgenic CAR-T) と比較しても、HPSEは leukocyte trafficking で physiological roleを持つため、安全性プロファイルが optimalである点で対照的。② 新規性: 本研究で初めて、Ex vivo CAR-T製造プロセスが LTE-T phenotypeの HPSE抑制を介してCAR-T cells の固形腫瘍infiltration能を構造的に低下させることを実証した novel evidenceを提供した。これまで報告されていない知見として、(a) full-length p53のHPSE promoter結合による直接転写抑制機構 (ChIP enrichment ~4.5-fold、Figure 1g-h)、(b) CAR(I)HPSE bicistronic vectorによる CAR + HPSE同時導入の安全性 (cytotoxic function、cytokine release保持)、(c) NSGマウスneuroblastoma異種移植モデルでの tumor infiltration 3-5-fold増加 + survival prolongation (約 1.5-fold)、を実証した。新規 therapeutic strategyとして CAR-T製造プロセス改良 (HPSE導入、p53抑制) の方向性を明確化した。③ 臨床応用と意義: 本研究は固形腫瘍CAR-T療法のbench-to-bedside translationalブレークスルーとして極めて大きな意義を持つ。stroma-rich solid tumors (神経芽腫、肉腫、メラノーマ、膵癌、乳癌、卵巣癌、肺癌等) に対するCAR-T臨床応用の boilerplate strategyとなり、第2-3世代CAR design + HPSE-IRES vectorの組み合わせが臨床応用される根拠を確立した。臨床的有用性として翌2016年以降の CAR-T tumor infiltration enhancement strategies (CXCR2 transgenic CAR-T、CCR4-CAR、TGF-β KO CAR-T等) の研究を加速。bench-to-bedside translationalな架け橋として、CAR-T製造プロトコール改良 (より短い ex vivo culture、IL-7/IL-15支配 expansion、CD8+ Tscm enrichment) の重要性も示唆した。④ 残された課題と今後の検討: limitationとして、(1) human clinical trialでのHPSE-CAR-T安全性検証 — 特に metastasis促進可能性 (HPSE activity vs tumor angiogenesis) の懸念は未解決の今後の課題、(2) HPSE-IRES vectorによる long-term HPSE発現が in vivo persistence 上で off-target tissue damageを引き起こさないか long-term追跡が future studyとして必要、(3) p53抑制解除の broad consequence (other tumor suppressor genesへの影響) の解明が今後の研究課題、(4) HPSE inducible expression system (drug-controlled、tetracycline switch) の設計が今後の検討、(5) p53非依存的 HPSE re-induction strategy (chromatin remodelers、epigenetic modulators) の探索が今後の展望、(6) 線維性固形腫瘍 (膵癌、胆道癌、間質腫瘍) への HPSE-CAR-T platform拡張、PD-1 KO + HPSEの combinatorial CAR-T、特異的 ECM degrading enzymes (collagenase、MMP9) との組み合わせが残された課題。これらlimitationにもかかわらず、本研究はCAR-T cell製造の概念を「単なる遺伝子導入」から「機能的完全性の復元」へ拡張した novel translational evidence であり、固形腫瘍 adoptive immunotherapyの clinical milestone evidence である。
方法
T細胞調製: 健常者末梢血単核球 (PBMC) 由来CD3+ T細胞を3群に分けた — FI-T cells (freshly isolated resting T cells、何の処理もなし)、BA-T cells (briefly activated T cells、OKT3 + anti-CD28 antibody 24時間刺激)、LTE-T cells (long-term ex vivo-expanded T cells、OKT3 + anti-CD28 で12-14日培養、IL-2/IL-7/IL-15存在下)。HPSE発現解析: Western blotting (anti-HPSE antibody、active form 50 kDa)、immunofluorescence (Alexa Fluor 555、DAPI counterstain、20× magnification)、qRT-PCR (HPSE mRNA、4 donors)、HPSE enzymatic activity assay (supernatant、CD4+ vs CD8+ T cells、time course 0-72 hours)。Positive control cell line: HPSE-transfected 293T cells (cell line)、MCF-7 cells (mouse breast cancer cell line)、CHLA-255 cells (neuroblastoma cell line)、A549 cells (lung cancer cell line)、DU-145 cells (prostate cancer cell line)。ECM invasion assay: Matrigel-based cell invasion assay、5 donors per condition、ANOVA + log-rank (Mantel-Cox) test for multiple comparisons。p53 mechanism解析: full-length p53 protein Western (Activation時点 t=0, 18 h, 72 h)、p53 ChIP (chromatin immunoprecipitation、anti-p53 antibody vs IgG isotype control、HPSE promoter region特異的PCR、Input control)。CAR-T cell engineering: GD2-specific second-generation CAR (14g2a scFv + CD28-CD3ζ intracellular domain、Pule 2008 Pule et al. NatMed 2008) を γ-retroviral vectorに挿入。HPSE(I)GFP retroviral vector (HPSE + IRES + GFP) または CAR(I)HPSE bicistronic vectorで形質導入。In vitro機能評価: Cytotoxic activity = 51Cr-release assay、20:1 effector:target比、target cells = LAN-1 (GD2+ neuroblastoma cell line)、CHLA-255 (GD2+ neuroblastoma cell line)、Raji (GD2- B-cell lymphoma cell line)。IL-2 + IFN-γ release = ELISA。Matrigel invasion assay (n=9 donors)。HPSE inhibitor control: heparin H1 (HPSE-specific inhibitor)。In vivo tumor model: GD2+ neuroblastoma cell line LAN-1-GFP+ 細胞を NSG mouse strain (NOD-SCID-IL2Rγ-null mouse) に subcutaneous異種移植 (n=5-10 mice per group)、tumor establishment後にCAR、CAR(I)HPSE、control T cells (5×10^6 cells/mouse) i.v. infusion。Tumor growth (caliper measurement、weekly)、survival (Kaplan-Meier)、tumor-infiltrating T cells (anti-CD3 IHC、HPF counting) を評価。統計: ANOVA + post-hoc test、Student’s t-test、Kaplan-Meier生存解析 + log-rank検定、p<0.05を有意とした。