- 著者: Zihao Wang, Mengqi Chang, Yuekun Wang, Yang Qu, Wenbo Wu, Jiahui Liu, Xiaopeng Guo, Yidong Zhou, Wenbin Ma, Yu Wang
- Corresponding author: Yidong Zhou (Department of Breast Surgery, Peking Union Medical College Hospital); Wenbin Ma; Yu Wang (Department of Neurosurgery, Peking Union Medical College Hospital)
- 雑誌: International Journal of Biological Sciences
- 発行年: 2026
- Epub日: 2026-05-29
- Article種別: Original Article
- PMID: 42328433
背景
肺腺癌 (LUAD) は非小細胞肺癌 (NSCLC) の主要な組織型であり、中枢神経系への転移傾向が特に強い。疫学的推定では進行LUAD患者の約38%が脳転移を発症し、脳転移診断後の中央生存期間は一般に12か月未満と極めて不良である。既存の治療選択肢 (外科的切除・放射線療法・化学療法・免疫療法) では脳転移に対する効果は限定的であり、新規分子標的の同定が急務とされている。
著者らの先行研究では、原発巣・脳転移巣のペア単一細胞RNA-seq解析により脳転移巣に特異的に濃縮されるEPCAM陽性上皮細胞サブセット (brain metastasis-associated epithelial cells) を同定し、S100A9がその分子マーカーとなりうることが示された (Wang et al. NeuroOncol 2023)。S100A9はS100ファミリーのEFハンドカルシウム結合タンパク質であり、膵癌肺転移・大腸癌肝転移・骨転移・卵巣癌など多くの悪性腫瘍で転移促進的役割が報告されている。加えてGlioma由来のS100A9がM2ミクログリア分極を誘導してCD8+ T細胞機能を抑制し免疫抑制環境を形成するなど、腫瘍微小環境 (TME) との複雑なクロストークが明らかにされてきた。さらに、S100A9/RAGEシグナルが脳転移病変での放射線抵抗性に寄与し液体生検バイオマーカーとしても注目されることが報告されている (Monteiro et al. NatMed 2022)。
しかしながら、腫瘍細胞内在性S100A9によるBBB破綻機序、およびその上流制御として機能するユビキチン化修飾については未解明の部分が大きく、USP33-S100A9軸の脳転移における役割を直接示すエビデンスが不足していた。脱ユビキチン化酵素 (DUB) USP33はCBX2 (卵巣癌)、TGFBR2 (膵癌)、PFKFB3 (骨肉腫) などの基質に対してK48/K27鎖ユビキチン化を除去してタンパク安定性を高め、各種悪性腫瘍の悪性化を促進することが報告されている一方、脳転移やS100A9との関連は未報告であった。また、III型中間径フィラメントVimentinはEMTマーカーとして遊走・浸潤・薬剤耐性に関与することが知られているが、細胞外分泌Vimentinが脳微小血管内皮細胞 (HBMEC) の機能とBBBに与える影響は不明であった。本研究は、免疫沈降-質量分析 (IP-MS) を用いてS100A9の新規DUBとしてUSP33を同定し、USP33-S100A9-Vimentin軸によるLUAD脳転移機序を解明することを目的とした。
目的
脱ユビキチン化酵素USP33によるS100A9のK48鎖ユビキチン化除去・タンパク安定化、それに続く細胞外Vimentin分泌亢進が、血液脳関門 (BBB) 完全性を損ない血管内皮細胞 (HBMEC) 機能を障害することで、LUAD細胞の脳転移を促進する分子機序を体系的に解明する。
結果
S100A9高発現がLUAD細胞の腫瘍形成能・脳転移能を亢進させる： 多重免疫組織化学染色により、LUAD脳転移標本においてEPCAM陽性上皮細胞とS100A9の顕著な共局在が確認された (Fig. 1A)。A549・H1975細胞へのレンチウイルス性S100A9過剰発現 (S100A9-OE) ではRT-qPCRおよびWestern blotでS100A9転写・翻訳の有意な上昇と細胞外へのS100A9タンパク分泌増加が確認された (n=3, ***P < 0.001, mean ± SD)。PC-9細胞ではCRISPR-Cas9 (sgRNA S100A9 sg#1) によるノックアウト効率をRT-qPCR・Western blotで確認した。In vitroでは、S100A9-OE群でVector群と比較してCell Counting Kit-8 (CCK-8) 増殖・EdU取込・Transwell遊走/浸潤・コロニー形成が有意に増加し、TUNELアポトーシスは有意に抑制された (Supplementary Fig. 1-3)。In vivoではBALB/cヌードマウスへの皮下接種 (A549/H1975, 5×10⁶ 細胞, n=8/群, day 32) においてS100A9-OE群でVector群と比較して腫瘍重量・腫瘍体積が有意に増加した (*P < 0.05, ***P < 0.001; Fig. 2B-E)。NOD-SCIDマウスへの左心室注射 (1×10⁵ cells, n=6/群) でのin vivoルシフェラーゼイメージングでは、S100A9-OE群において頭蓋内光子束が有意に大きく、S100A9が脳転移を促進することが確認された (Fig. 2F, G)。Evans blue外漏出試験ではS100A9-OE群でVector群と比較してBBB透過性の著明な亢進が確認された (Fig. 2H)。
S100A9はBBBバリア機能を障害しHBMEC機能を多面的に抑制する： Transwell共培養系 (0.4 μm, HBMEC 2×10⁵/cm²、下室LUAD細胞 5×10⁴/cm²、48時間) を用いた解析では、S100A9-OE A549細胞との共培養によりHBMECのF-Na⁺透過性が有意に上昇し (**P < 0.01, n=3; Fig. 3C)、sg-S100A9 PC-9細胞との共培養では逆に有意に低下した (Fig. 3D)。Western blot解析では、S100A9-OE群と共培養したHBMECでタイトジャンクション構成タンパク ZO-1・Occludin・Claudin-5の発現が有意に低下し (**P < 0.01, n=3; Fig. 3E-H)、sg-S100A9群との共培養では有意に上昇した (Fig. 3I-L)。管腔形成アッセイでは、S100A9-OE群との共培養によりHBMECの分岐点数・管腔全長が有意に減少 (*P < 0.05, **P < 0.01, n=3; Fig. 3M-R)し、S100A9ノックアウト群では回復した。CCK-8アッセイでは、S100A9-OE A549細胞と共培養したHBMECが72時間にわたり増殖が持続的に抑制され (****P < 0.0001, n=3; Fig. 3A)、sg-S100A9群では逆に増殖が有意に亢進した。これらの結果は、S100A9が内皮バリア機能障害・管腔形成抑制・増殖抑制を多面的に駆動することを示す。
S100A9はVimentin発現を上昇させ内皮間葉転換 (EndMT) を誘導する： S100A9-OE A549細胞のRNA-seqでは、Vector群と比較して750遺伝子の発現低下・959遺伝子の発現上昇が同定され、Vimentinが最も有意に上昇した遺伝子として筆頭に同定された (adj. P ≤ 0.05, |log₂FC| ≥ 1; Fig. 4A)。KEGGパスウェイ解析では焦点接着・ECMシグナル経路の有意な活性化が確認され、Vimentinがこれらに関与することが示された (Fig. 4B)。RT-qPCRにて、A549・H1975のS100A9-OE群でS100A9およびVimentin RNAが有意に上昇 (***P < 0.001, ****P < 0.0001, n=3; Fig. 4D-G) し、sg-S100A9群では有意に低下した。Western blot解析ではITGB1 (Integrin β1)・FAK・Vimentinタンパク発現がS100A9-OEで有意に増加し (**P < 0.01, ***P < 0.001, n=3)、ITGB1阻害薬投与によりこれら発現と細胞増殖・遊走・浸潤能が有意に低下した (Fig. 4P-W)。siRNA (siVIM-2: 最高サイレンシング効率) によるVimentinノックダウンにより、S100A9-OE状態でのHBMEC F-Na⁺透過性亢進が有意に回復し (**P < 0.01, n=3; Fig. 5D)、ZO-1・Claudin-5・Occludinの免疫蛍光強度とタンパク発現も有意に回復した (****P < 0.0001, n=3; Fig. 5E-I)。さらにVimentinノックダウンにより、管腔形成能 (*P < 0.05, ***P < 0.001; Fig. 5J-L)・ROS産生 (Fig. 5M)・ミトコンドリア膜電位 (Fig. 6F-H)・リソソーム酸性化 (Fig. 6I-J)・オートファジーマーカー (P62上昇, p-Beclin1/Beclin1〔オートファジー開始複合体の鍵因子〕比低下, LC3-II/I比低下; *P < 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, n=3; Fig. 6K-N)・EndMTマーカー (VE-Cadherin発現回復, N-Cadherin/α-SMA低下; ****P < 0.0001, n=3; Fig. 5N-Q) が有意に改善した。
USP33がS100A9のK48鎖ユビキチン化を除去しタンパクを安定化する： Co-IP+質量分析 (MASCOT 2.2.06, Swiss-Prot, peptide mass tolerance 10 ppm) により、S100A9の相互作用タンパクとしてUSP33が同定された (Table S2)。HEK293T細胞でV5タグ付USP33-OEとFlagタグ付S100A9-OEを共発現させ両タンパクの強固な結合を確認し (Fig. 8D, E)、A549・PC-9細胞での内因性相互作用もCo-IPで確認した (Fig. 8F, G)。シクロヘキシミド (CHX, 100 μM) チェイスアッセイでは、USP33-OE A549細胞においてVector対照と比較してS100A9タンパクの分解速度が有意に低下した (時点: 0, 4, 8, 12 h; ****P < 0.0001, n=3; Fig. 8J-K)。MG132 (10 μM, プロテアソーム阻害薬) 処理実験でも同様にS100A9半減期の延長が確認された (Fig. 8H-I)。脱ユビキチン化アッセイでは、USP33過剰発現によりS100A9のK48鎖ポリユビキチン化が有意に減少し (Fig. 8L, M)、USP33がS100A9のプロテアソーム分解を抑制してタンパク安定化を行うことが確認された。ELISAでは、A549・H1975のS100A9-OE群でVector群と比較して細胞外Vimentin分泌量が有意に増加し (**P < 0.01, n=3; Fig. 8A-C)、sg-S100A9 PC-9群では有意に低下した。
USP33はS100A9を介してHBMEC機能を多面的に抑制する： PC-9細胞 (sg-NC+USP33-OEまたはsg-NC+Vector) を用いたHBMEC共培養CCK-8アッセイでは、sg-NC+USP33-OE群がsg-NC+Vector群と比較してHBMECのOD450値が0, 24, 48, 72 hいずれにおいても有意に低下した (****P < 0.0001, n=3; Fig. 7A)。EdU・創傷治癒アッセイでもUSP33-OEによるHBMEC増殖・遊走の有意な抑制が確認された (***P < 0.001, ****P < 0.0001, n=3; Fig. 7B-E)。管腔形成アッセイではsg-NC+USP33-OE群で分岐点数・管腔全長が有意に減少し (*P < 0.05, n=3; Fig. 7F-H)、ROS検出ではHBMECのROS産生が有意に増加した (****P < 0.0001, n=3; Fig. 7I-J)。JC-1アッセイではUSP33-OEによりHBMECのミトコンドリア膜電位が有意に低下し (****P < 0.0001, n=3; Fig. 7K-M)、LysoTracker probeによるリソソームpH測定ではUSP33-OE群で有意な酸性化が確認された (****P < 0.0001, n=3; Fig. 7N-O)。S100A9ノックアウト (sg-S100A9+USP33-OE) により、これらのHBMEC機能変化はすべて有意に回復した。これらの一連の知見は、USP33がS100A9の安定化を介してLUAD細胞のBBB破綻能と脳転移能を亢進させることを示す。
考察/結論
① 先行研究との違い： これまでの研究では、S100A9は主として骨髄由来免疫細胞が産生する炎症性分子として解析されており、腫瘍細胞内在性S100A9が脳微小血管内皮機能を障害しBBBを破綻させる機序は不明であった。本研究は腫瘍細胞固有のS100A9発現に焦点を当て、これと異なりUSP33-S100A9-Vimentin軸という新規分子カスケードがBBBを標的として脳転移を駆動することを示した。さらに、Vimentinは従来EMTマーカーとして細胞内機能が中心に研究されてきたが、細胞外分泌Vimentinが脳微小血管内皮細胞のタイトジャンクション・管腔形成・ROS・EndMT・オートファジーを体系的に障害するという事実も対照的に新たな知見である。S100A9/RAGEが放射線抵抗性や液体生検の文脈で議論されてきた先行研究 (Monteiro et al. NatMed 2022) と比較して、本研究はUSP33という上流DUBを標的とした新たな介入層を提示した。
② 新規性： 本研究で初めて、USP33がS100A9のK48鎖ユビキチン化を特異的に除去してタンパク安定化を行うDUBであることをIP-MS・Co-IP・CHXチェイスアッセイ・脱ユビキチン化アッセイの複数手法で同定した。さらに本研究で初めて、USP33-S100A9軸が細胞外Vimentin分泌を亢進させてHBMEC障害を誘導するという新規に分子軸がLUAD脳転移において機能的に重要であることを、in vitro共培養系・in vivo発光イメージング・Evans blue試験の多層的な検証で証明した。これはこれまで報告されていない分子カスケードであり、脳転移BBB破綻機序の理解に新規の視点を加えるものである。
③ 臨床応用： USP33-S100A9-Vimentin軸の薬理学的制御はLUAD脳転移に対する新たな治療標的として臨床応用が期待される。DUB阻害薬や抗Vimentin抗体アプローチ (細胞外Vimentinを抗血管新生免疫療法標的とする戦略が先行研究で報告されている: van Beijnum et al. Nat Commun 2022) との組合せ治療が可能性を持つ。また、S100A9/RAGEシグナルを標的とした放射線増感戦略との統合的アプローチも期待され (Monteiro et al. NatMed 2022)、液体生検での早期検出との組み合わせによる臨床的有用性が見込まれる。さらに、S100A9はTCGAデータでもLUAD組織で有意に高発現し予後と逆相関することが本研究でも確認されており、診断マーカーとしての臨床的意義も示唆される。
④ 残された課題： 残された課題として、本研究では左心室注射モデルを用いているため、肺原発からの自然転移カスケード (局所浸潤・血行性播種・BBB通過) を完全には再現できていないという実験的制限がある。細胞外Vimentinが具体的にどの内皮細胞表面受容体と結合してBBB障害シグナルを伝達するかも今後の検討課題である。USP33がVimentinのユビキチン化をS100A9を介して間接的に制御するのか、直接的に制御する経路も並存するのかについては更なる研究が必要である。また、本研究で用いたLUAD細胞株は限られた数であり (A549, H1975, PC-9)、EGFR変異・KRAS変異などドライバー変異サブグループにおける本軸の機能的意義の検討が今後の研究に残されている。
方法
細胞株・共培養系： LUAD細胞株 (A549 [CL-0016], NCI-H1975 [CL-0298], PC-9 [CL-0668], NCI-H1299 [CL-0165], NCI-H2009; Procell) とヒト脳微小血管内皮細胞 (HBMEC, IM-H206, IMMOCELL) を使用。HBMEC-LUAD Transwell共培養系 (0.4 μm, 上室HBMEC 2×10⁵ cells/cm², 下室LUAD細胞 5×10⁴ cells/cm², 48時間, 37°C, 5% CO₂)。レンチウイルスベクターによるS100A9-OE安定株はプロマイシン選択4週間後RT-qPCR・Western blotで確認。CRISPR-Cas9 (sgRNA S100A9 sg#1: 最高効率) によるS100A9ノックアウトPC-9細胞を構築した。293T細胞 (CL-0005) でのV5-USP33-OE/Flag-S100A9-OEおよびS100A9-Luc/Vector-Luc安定株も作製した。
分子生物学的解析： Co-IP+質量分析 (MASCOT 2.2.06, Swiss-Prot, peptide mass tolerance 10 ppm, fragment ion tolerance 0.6 Da); タンパク半減期アッセイ (CHX 100 μM, MG132 10 μM, 時点: 0, 4, 8, 12 h; Western blot); 脱ユビキチン化アッセイ (Ub-K48特異抗体 ab140601, Abcam; Ub-WT ab134953); RT-qPCR (TRIzol, BioSpectrometer, Tiangen KR118-02 RT kit, StepOnePlus, GAPDH基準, ΔΔCt法); Western blot (PVDF, 5% スキムミルクブロッキング, HRP標識二次抗体, ECL検出; 主要一次抗体: S100A9 PA5-79949, ZO-1 61-7300, Occludin ab216327, Claudin-5 34-1600, ITGB1 ab52971, FAK ab40794, Vimentin ab137321, VE-Cadherin 2500, N-Cadherin 66219-1-Ig, α-SMA ab124964, P62 ab109012, Beclin1 ab302669, LC3 ab192890, USP33 20445-1-AP); RNA-seq (fastp前処理, HISAT2マッピング, featureCounts FPKM定量, DESeq2/edgeR差次発現解析; 有意閾値 adj. P ≤ 0.05, |log₂FC| ≥ 1); KEGG/GO/GSEA解析 (clusterProfilep R package); ELISA (Vimentin分泌量定量, HRP標識抗Vimentin抗体, OD 450 nm)。
細胞機能アッセイ： CCK-8増殖アッセイ (2,000 cells/well, 96-well, OD 450 nm, 0/24/48/72 h); EdU取込アッセイ (2×10⁴ cells/mL, 6-well, 20 μM EdU, 2時間, Nikon Ti2); Transwell遊走 (2×10⁵ cells, 24 h, crystal violet) /浸潤 (Matrigel前処理, 5時間重合, 24 h); 創傷治癒アッセイ (0/24/48 h); コロニー形成アッセイ (14日間, 6-well, gelatin); TUNELアポトーシス評価 (C1090, Beyotime); 管腔形成アッセイ (Matrigel 200 μL/well, 24-well, 1×10⁵ cells/well); F-Na⁺透過性アッセイ (0.2 mL, 1 mg/mL NaF, 2時間, calibration 4-1000 μg/mL); ROS検出 (10 μM DCFH-DA, 488 nm励起/525 nm検出, 20分); JC-1ミトコンドリア膜電位 (C2003, Beyotime, 20分, Leica DM3000 LED); LysoTracker Redリソソーム検出 (60 nM, 60分); 免疫蛍光染色 (ZO-1, Claudin-5, Occludin; AF594標識二次抗体, DAPI核染色)。
In vivoモデル： 皮下腫瘍形成: BALB/cヌードマウス (雌, 6-8週齢, SPF, n=8/群), 5×10⁶ cells右腋窩皮下接種, day 32腫瘍重量・体積評価 (Vernier caliper); 脳転移モデル: NOD-SCIDマウス (雄, 6-8週齢, SPF, n=6/群), 1×10⁵ cells/20 μL左心室注射, 3週間後基質尾静脈投与・in vivoバイオルミネッセンスイメージング; BBB透過性: Evans blue外漏出試験 (1% Evans blue 20 mL/kg + heparinized saline 20 U/mL, tail vein i.v., 経心的灌流後脳標本回収, 実体顕微鏡撮影)。
統計解析： GraphPad Prism 8.0。多群比較: 一元配置ANOVA + Tukey後検定 / 二元配置ANOVA + Bonferroni補正; 2群比較: Student t検定。P < 0.05を統計的有意とした。全実験はn=3の独立生物学的複製 (mean ± SD) で実施。動物実験: 北京協和医科大学病院倫理委員会承認 (K6764, XHDW-2025-133)。