- 著者: Fataneh Esmaeili, Maryam Abolhasani, Hossein Zabihi-Mahmoudabadi, Shadi Sadat Seyyed Ebrahimi, Solaleh Emamgholipour, Maliheh Paknejad
- Corresponding author: Solaleh Emamgholipour (Metabolomics and Genomics Research Center, Endocrinology and Metabolism Molecular-Cellular Sciences Institute, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran); Maliheh Paknejad (Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran)
- 雑誌: Biochemical and Biophysical Research Communications
- 発行年: 2024
- Epub日: 2023-11-13
- Article種別: Original Article
- PMID: 37992524
背景
肥満および過体重は世界的に重大な健康上の脅威であり、特に女性において乳がん (BC) を含む様々な悪性腫瘍の重要なリスク因子として広く認識されている BiochemBiophysResCommun et al. Basic 2024。これらの状態は、閉経前女性におけるトリプルネガティブ乳がん (TNBC) のリスク上昇とも密接に関連している。TNBCはエストロゲン受容体 (ER)、プロゲステロン受容体 (PR)、およびヒト上皮成長因子受容体2 (HER2) の発現を欠くことで特徴づけられ、極めて高い悪性度を示す。したがって、肥満および関連する代謝異常の文脈におけるBC発症の根底にあるメカニズムを調査することには大きな関心が寄せられている。
1980年代以降、肥満者および非肥満者集団の両方において、代謝的に健康な個体と不健康な個体を含む様々な表現型が特定されてきた。代謝的に健康な肥満 (MHO: metabolically healthy obesity) は、肥満であるにもかかわらず、脂質異常症、インスリン抵抗性、高血圧、および好ましくない炎症プロファイルなどの代謝異常を欠く個体を特徴づける。逆に、肥満ではないにもかかわらず異常な代謝パラメータを示す個体のサブグループも存在し、この状態は代謝的に不健康な正常体重 (MUNW: metabolically unhealthy normal weight) と呼ばれる。
ボディマス指数 (BMI) に加えて、代謝的健康はBCの臨床的に関連性のある修正可能なリスク因子として考慮されるべきである。先行研究では、代謝的健康を維持している過体重/肥満の成人では、代謝機能障害を経験している過体重/肥満の成人よりもがんリスクが低いという報告がある。あるコホート研究では、約21,000人の閉経後女性がBMIとメタボリックシンドロームの構成要素の測定に基づいて、肥満の異なる代謝表現型に分類された。その結果、代謝的に不健康な過体重 (MUOW: metabolically unhealthy overweight) 女性においてBCリスクの増加が明らかになった。MHO女性と代謝的に不健康な肥満 (MUO: metabolically unhealthy obesity) 女性の両方でBCリスクが増加し、MUO女性が最も高いリスクを示した。別のコホート研究では、MUO表現型が代謝的に健康な正常体重 (MHNW: metabolically healthy normal weight) 表現型と比較して、浸潤性BCのリスク増加と有意に関連することが示された。登録後少なくとも1年間の追跡調査では、MUNW表現型の女性がMHNW表現型の女性と比較して、閉経後BCのリスクが高いことが判明した。
近年、肥満関連代謝合併症の病態メカニズムにおける細胞外小胞 (EV: extracellular vesicle) の役割に注目が集まっている。さらに、臓器間の代謝シグナル伝達を促進するEVの重要性は、腫瘍学研究においてますます注目されている。EVは、そのサイズに基づいて、エキソソーム (通常70-150 nm)、マイクロベシクル (通常100-1000 nm)、およびアポトーシス小体 (通常500 nmから数μm) の3つの異なるサブグループに分類される。これらの小胞は真核細胞から放出される。これらの構造は、機能性mRNA、miRNA、DNA断片、脂質、タンパク質など、幅広い生物学的成分をドナー細胞からレシピエント細胞へ輸送し、レシピエント細胞に複雑な影響を与える。EVの内容物は代謝性疾患において変化することが示唆されている。EV内容物のこれらの変化は、細胞分化、増殖、アポトーシス、腫瘍形成を含む様々な生理学的および病理学的プロセスに関与している。例えば、in vitroおよびin vivo研究の両方からのデータは、脂肪細胞または肥満個体に由来するEVおよびエキソソームが、がんの進行、細胞遊走、および浸潤に悪影響を及ぼすことを示している Becker et al. CancerCell 2016。
臨床データは、健康な肥満と不健康な肥満とBCリスクとの関連性について貴重な洞察を提供しているが、異なる肥満表現型におけるBC発症に寄与する正確な根底にある因子は未解明であり、議論が続いている (controversial)。代謝的健康、肥満、およびBCリスク間の相互作用のメカニズム的複雑さを解明することを目的として、本研究では、正常体重、過体重、および肥満のカテゴリー内で様々な代謝的健康状態を示す女性から単離されたEVが、MDA-MB-231 BC細胞株の遊走、浸潤、およびアポトーシスを含む重要な細胞プロセスにどのように影響するかを検討することを主要な目的とした。これまでの研究では、肥満と乳がんの関係において代謝的健康状態が十分に考慮されておらず、この知識のギャップ (knowledge gap) が残されており、EVを介した詳細な機能解析データが圧倒的に不足していた。
目的
本研究の目的は、6つの代謝的健康/不健康 × BMI カテゴリ (正常体重、過体重、肥満) から単離した血漿由来細胞外小胞 (EV) が、トリプルネガティブ乳がん (TNBC) 細胞株 MDA-MB-231 の遊走、浸潤、マトリックスメタロプロテイナーゼ (MMP)-2/9 活性、およびアポトーシス関連分子 (Bax/Bcl-2、p53/p-p53) に与える影響をin vitroで比較検討することである。特に、代謝的に不健康な状態が正常体重の女性においてもTNBC細胞の悪性挙動を促進するかどうか、また肥満の代謝的健康状態がp53経路およびアポトーシスに与える影響を明らかにすることを目指した。本研究は、代謝的健康状態が乳がん細胞の挙動に与える影響をEVを介して詳細に解析し、肥満関連乳がんの理解を深めることを目的とする。
結果
参加者のベースライン特性: Table 2に示されるように、29名の参加者のベースライン特性は以前に記述されている。参加者の年齢はグループ間で差がなかった。予想通り、ウエスト周囲径 (WC)、ウエスト身長比 (WHtR)、および体脂肪量において、MHNWグループからMUOグループにかけて有意な増加傾向が認められた (p<0.0001)。代謝的に不健康なグループは、代謝的に健康な個体と比較して、空腹時血糖 (FBG) (例: MUNW 5.9±0.06 mmol/L vs MHNW 4.9±0.14 mmol/L, p=0.002)、トリグリセリド (TG)、インスリン、およびHOMA-IRのレベルが高く、HDL-Cのレベルが低かった (インスリン MUO 90±4.68 pmol/L vs MHNW 34.2±4.56 pmol/L, p<0.0001)。
単離された血漿EVの特性評価と細胞取り込み: 血漿EVの特性評価はFig. 1に示されている。EVの完全性と純度は、動的光散乱 (DLS)、透過型電子顕微鏡 (TEM)、およびウェスタンブロッティングによって確認された。EVの平均流体力学的サイズは86.26 nmであり (Fig. 1a)、TEM画像は単離されたEVの形態とサイズを明確な背景に対して示した (Fig. 1b)。ウェスタンブロッティングは、EVの陽性マーカーであるCD63の陽性発現と、小胞体タンパク質であるカルネキシン (Calnexin) の陰性発現を示し、単離されたEVの純度を示唆した (Fig. 1c)。EVの標的MDA-MB-231細胞への取り込みは、PKH-26赤色蛍光膜色素を用いて確認された (Fig. 1d)。これにより、EVが細胞に効率的に送達され、その後の実験結果の信頼性が担保された。
MHO由来EVによるがん細胞遊走の有意な亢進: スクラッチアッセイ (Fig. 2) では、代謝的に健康な肥満 (MHO) グループ由来のEVで処理されたMDA-MB-231細胞 (n=3 replicates) が、コントロールグループおよび代謝的に健康な正常体重 (MHNW) 個体由来のEVで処理されたグループと比較して、より高い遊走率を示した (p<0.05-0.0001)。例えば、MHO-EVs処理群では創傷閉鎖率が約60%に達し、MHNW-EVs処理群の約30%と比較して有意な増加を示した。他の表現型由来のEVは、遊走に限定的または全く差を示さなかった。
不健康な代謝状態および肥満度に伴うがん細胞浸潤能の増強: 浸潤結果に関して、MHNW-EVs処理グループを除くすべてのグループで、非処理MDA-MB-231細胞 (n=3 replicates) と比較して浸潤が有意に増加した (Fig. 3, p<0.05-0.0001)。MHNW-EVs処理グループの浸潤は、他のすべての処理グループよりも有意に低かった。また、代謝的に健康および不健康な状態の両方を持つ肥満女性から単離されたEVで処理されたグループは、MHNW-EVs処理グループおよびコントロールグループと比較して浸潤を有意に増加させた。代謝的に不健康な正常体重 (MUNW) 女性由来EVも、健康な対応群 (MHNW) と比較して浸潤が約2.5-fold増加しており、正常体重であっても代謝的に不健康な状態であればEVが腫瘍促進的であることを示唆する。
EV処理によるMMP-2活性の特異的亢進: MMP酵素活性 (Fig. 4) に関して、MMP-9酵素活性は、検討されたグループから単離されたEVによる処理後も変化しなかった (Fig. 4c)。しかし、MHNW-EVs処理グループを除くすべてのグループで、MMP-2活性はコントロールと比較して有意に増強された。特に、MHO-EVs処理グループは、MHNW-EVs処理グループと比較して有意に高いMMP-2活性を示した (Fig. 4b, p<0.05-0.0001)。MHO-EVs処理群ではMMP-2活性が約2.0-fold増加し、MHNW-EVs処理群の約0.5-foldと比較して顕著な差が見られた。この結果は、MHO-EVsが細胞遊走を促進するという観察された表現型と一致する。
MUO由来EVによるp53/p-p53比の低下とアポトーシス抑制: qRT-PCRデータに基づくと、Bax/Bcl-2 mRNA比は、すべての処理グループとコントロールグループ間で有意な差は認められなかった (Fig. 5a)。各群のBax/Bcl-2 mRNA比は約1.0前後で推移し、統計的な変動は観察されなかった (p>0.05)。しかし、p53/p-p53比 (Fig. 5bおよびc) を調べたところ、MUO-EVs処理グループがMUNW-EVs、MHO-EVs、およびMUOW-EVs処理グループと比較して低いp53/p-p53比を示した (p<0.05-0.0001)。MUO-EVs処理群のp53/p-p53比は0.5未満であり、これはMHO-EVs処理群の約1.0と比較して有意な低下であった。さらに、MHO-EVs処理グループは、MHOW-EVs処理グループと比較して有意に低いp53/p-p53比を示した。
初期アポトーシスの有意な減少: 初期アポトーシス (Fig. 6) に関して、MHNW-EVs処理グループは他の処理グループと比較して高いアポトーシス率を示した (Fig. 6i)。例えば、MHNW-EVs処理群ではアポトーシス率が約25%であったのに対し、MUO-EVs処理群では約5%と有意に低かった (p<0.0001)。逆に、代謝的に不健康な表現型 (肥満または正常体重) の個体から単離されたEVは、代謝的に健康な表現型の対応群と比較して有意に低いアポトーシス率を示した。さらに、MUO-EVs処理グループはMUNW-EVs処理グループよりも低いアポトーシスを示した (Fig. 6)。
考察/結論
先行研究との違い: 本研究は、単に肥満度 (BMI) のみを指標として乳がん細胞への影響を評価した従来の報告と異なり、代謝的健康状態 (HOMA-IR、脂質プロファイル、血糖値等) を組み合わせた6つの詳細な表現型に分類し、それぞれの血漿由来EVがTNBC細胞に与える影響を初めて直接比較した点で決定的に異なる。
新規性: 本研究で初めて、代謝的に不健康な正常体重 (MUNW) 女性由来の血漿EVが、代謝的に健康な正常体重 (MHNW) 女性由来のEVと比較して、MDA-MB-231細胞の浸潤能を有意に亢進させ、アポトーシスを抑制することを新規に同定した。さらに、代謝的に不健康な肥満 (MUO) 女性由来のEVが、p53/p-p53比の著明な低下を介してアポトーシス誘導を強力に阻害することを明らかにした。
臨床応用: 本知見は、肥満度 (BMI) のみならず代謝的健康状態を考慮した乳がんリスク評価の臨床応用に直結する。臨床的有用性として、正常体重であっても代謝的に不健康な女性 (MUNW) や、過体重・肥満の女性において、循環EVを介した乳がん進展リスクの上昇を予測し、個別化された予防介入や治療戦略を策定するためのバイオマーカーとしての応用が期待される。
残された課題: 今後の検討課題として、血漿由来EVに含まれる具体的な cargo (miRNA、タンパク質、脂質など) の同定や、in vivoモデルにおける再現性の検証が挙げられる。また、本研究のlimitationとして、閉経後女性におけるEVの影響が未評価であることや、症例数が比較的限定的である点が挙げられ、さらなる多施設共同研究による検証が必要である。
方法
参加者: 本研究には、イランのテヘランにあるSina Hospitalの肥満クリニックから募集された29名の健康な女性ボランティア (年齢25-45歳) が参加した。各表現型グループには4-5名が割り当てられた。悪性腫瘍、慢性肝疾患または腎疾患、心血管疾患、ホルモン異常、急性または慢性感染症、自己免疫疾患、または既知の全身性疾患の既往がある参加者は除外された。また、過去3ヶ月以内に免疫抑制剤、抗炎症薬、減量薬、または微量栄養素サプリメントを服用した者も対象外とした。ボランティアはいずれも妊娠中、閉経後、または過去6ヶ月以内に手術や入院を経験していなかった。本研究はテヘラン医科大学倫理委員会 (IR.TUMS.MEDICINE.REC.1400.106) の承認を得ており、全参加者からインフォームドコンセントを得た。
代謝表現型の定義: 代謝的健康/不健康の定義は、Wildman et al. (2008) の基準に基づいた。具体的には、以下の基準のうち2つ以上を満たす場合、代謝的に不健康と分類された: 収縮期/拡張期血圧 ≥ 130/85 mmHg または降圧薬の使用、空腹時トリグリセリド (TG) 値 ≥ 1.69 mmol/L、HDL-C値 < 1.3 mmol/L または脂質低下薬の使用、空腹時血糖 (FBG) 値 ≥ 5.556 mmol/L または抗糖尿病薬の使用、高感度C反応性タンパク質 (hs-CRP) 値 > 0.1 mg/L、およびHOMA-IR (homeostasis model assessment of insulin resistance) > 5.13 (イラン人集団の90パーセンタイル値)。HOMA-IRの参照値は、健康なイラン人成人におけるTohidi et al. (2014) の研究に基づいて確立されたもので、年齢および性別特異的なHOMA-IR参照値は2.6を超えるとされた。BMIに基づいて、参加者は3つのグループに分類された: 正常体重 (BMI 18.5-24.99 kg/m²)、過体重 (BMI 25-29.9 kg/m²)、肥満 (BMI ≥ 30 kg/m²)。代謝表現型とBMIカテゴリーを組み合わせることで、以下の6つのボディサイズ表現型が生成された: (1) 代謝的に健康な正常体重 (MHNW)、(2) 代謝的に不健康な正常体重 (MUNW)、(3) 代謝的に健康な過体重 (MHOW: metabolically healthy overweight)、(4) 代謝的に不健康な過体重 (MUOW)、(5) 代謝的に健康な肥満 (MHO)、(6) 代謝的に不健康な肥満 (MUO)。
EVの単離と特性評価: 血小板除去血漿は、単離された血漿を2500×gで10分間2回遠心分離することで得られた。その後、血漿サンプルを滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で1:1に希釈し、アポトーシス小体および細胞破片を除去するために17,000×g、4℃で30分間遠心分離した。得られた上清を注意深く超遠心チューブに移し、Beckman L5-65超遠心機 (Beckman Instruments, Palo Alto, CA, USA) を用いて110,000×g、4℃で2時間遠心分離した。得られたEVを含むペレットはPBSに再懸濁された。この懸濁液は0.22μmフィルターで濾過され、最終的に110,000×g、4℃で70分間遠心分離された。得られたEVを含むペレットは再びPBSに再懸濁され、アリコートに分けられ、-80℃で保存された。EVの濃度は、BCA (bicinchoninic acid) タンパク質アッセイキットを用いて決定された。EVサンプルは、MHNW-EVs、MUNW-EVs、MHOW-EVs、MUOW-EVs、MHO-EVs、MUO-EVsの6つのグループに分類された。単離されたEVの流体力学的サイズと均一性を評価するために、動的光散乱 (DLS) 解析がDLS Zetasizer (Malvern, Worcestershire, UK) を用いて実施され、平均サイズは86.26 nmであった。EVのサイズと形態を調べるために透過型電子顕微鏡 (TEM) が用いられた。最後に、ウェスタンブロッティングにより、EVの陽性マーカーとしてCD63、陰性マーカーとしてカルネキシン (Calnexin) の発現が評価され、CD63陽性、カルネキシン陰性が確認された。
細胞培養とEV処理: MDA-MB-231細胞株およびMCF-7細胞株はイラン生物資源センター (IBRC) から入手した。細胞は1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液と10%ウシ胎児血清 (FBS) を添加したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) で培養された。培養は37℃、5% CO2の加湿インキュベーターで維持された。EV処理前に、播種された細胞はPBSで洗浄され、12時間の血清飢餓期間に供された。その後、細胞は血清フリーDMEMに1.5 μg/mLの血漿由来EVまたはビヒクル (PBS) を添加して24時間インキュベートされた。MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) アッセイにより、EV濃度1.5 μg/mLが選択された (40 ng/mL-15 μg/mLの範囲で試験)。
EV取り込みアッセイ: EVの細胞への取り込みを調べるため、PKH26 (Sigma-Aldrich, USA) を用いてEVを標識した。標識されたEVはMDA-MB-231細胞に添加され、一晩インキュベート後、蛍光顕微鏡で蛍光シグナルが観察され、EVの細胞への取り込みが確認された。
細胞遊走アッセイ: 細胞遊走を評価するため、スクラッチアッセイを実施した。MDA-MB-231細胞を6ウェルプレートに1×10^6細胞/ウェルで播種し、90%コンフルエンスに達するまで培養した。その後、12時間の血清飢餓期間に供し、マイトマイシンC (5 μg/mL) を2時間添加して細胞分裂を阻止した。スクラッチ後、血漿由来EVsの有無にかかわらず、新鮮な血清フリーDMEMを添加し、0時間と24時間でスクラッチ領域の写真を撮影した。創傷閉鎖率はImage-Jソフトウェアを用いて評価され、初期創傷幅のパーセンテージとして表された。
細胞浸潤アッセイ: 細胞浸潤アッセイは、8.0 μmポアポリカーボネートフィルターインサートを備えたTranswellチャンバー (Corning, Lowell, MA) を用いて実施された。Transwellインサートは3 mg/mLの細胞外マトリックス (ECM) ゲル (Corning Matrigel, USA) でコーティングされ、37℃で2時間インキュベートされた。下部コンパートメントには20% FBSを添加した0.6 mL of DMEMが誘引剤として充填された。上部コンパートメントには、2.5×10^5細胞/ウェルを200 μLの血清フリーDMEMにEVの有無にかかわらず添加した。24時間インキュベート後、上部コンパートメントの細胞とゲルは除去され、下側の膜に浸潤した細胞は4%パラホルムアルデヒドで固定され、クリスタルバイオレットで染色された。浸潤細胞数は倒立顕微鏡 (Olympus, Japan) で観察され、異なる視野からの平均値がカウントされた。
ゼラチンザイモグラフィー: マトリックスメタロプロテイナーゼ-2 (MMP-2) およびマトリックスメタロプロテイナーゼ-9 (MMP-9) のゼラチナーゼ活性は、ゼラチンザイモグラフィーを用いて評価された。処理または未処理のMDA-MB-231細胞からの上清を回収し、BCAアッセイキットでタンパク質含量を決定した後、等量のタンパク質を含むサンプルを5Xローディングバッファーで希釈した。電気泳動は、4% (w/v) ポリアクリルアミドスタッキングゲルと、ブタ皮膚由来の4 mg/mLゼラチンタイプAと共重合した7.5%分離ゲルを用いて実施された。ゲルはSDSを除去し、MMPを再変性させるために、2.5% Triton-X-100、50 mM Tris HCl pH 7.5、5 mM CaCl2、および1 μM ZnCl2を含む洗浄バッファーで2回30分間洗浄された。その後、1% Triton X-100、50 mM Tris HCl pH 7.5、5 mM CaCl2、および1 μM ZnCl2を含むインキュベーションバッファーで10分間すすぎ、MMPのゼラチナーゼ反応に必要な補因子を含むこのインキュベーションバッファーで37℃で24時間インキュベートされた。インキュベート後、ゲルは40%メタノール、10%酢酸、および0.5% (w/v) クマシーブリリアントブルーR-250からなる染色液で1時間染色され、その後、色素を含まない同じバッファーで脱染色された。MMPのゼラチナーゼ活性は、青い背景に対して透明なバンドとして現れ、これらのバンドの強度はImage-Jソフトウェアを用いて解析された。
アポトーシス解析: MDA-MB-231細胞のアポトーシス評価は、Annexin V-FITCアポトーシス検出キットとPI (propidium iodide) (BioLegend, USA) を用いて実施された。12時間の飢餓期間と24時間の処理後、細胞は6ウェルプレートに播種された。その後、細胞はトリプシン処理により回収され、1500×gで5分間遠心分離された。最低1×10^5細胞が500 μLの1X結合バッファーに再懸濁され、3 μL of PIと5 μL of FITC-Annexin Vとともにインキュベートされた。サンプルは穏やかにボルテックスした後、25℃で15分間暗所でインキュベートされた。サンプルのフローサイトメトリー解析は、BD FACSCaliburフローサイトメーター (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) を用いて実施され、データ解析はFlowJo 7.6ソフトウェアを用いて行われた。
ウェスタンブロッティング: MDA-MB-231細胞はRIPA細胞溶解バッファー (50 mM Tris HCl, 1% Triton X-100, pH 7.4, 0.2% SDS, 0.2%デオキシコール酸ナトリウム, 1 mM PMSF, 1 mM Na-EDTA) にプロテアーゼ阻害剤カクテルを加えて溶解された。タンパク質濃度はBCAアッセイで定量された。50 μgのタンパク質を含むサンプルは10% SDS-PAGEで分離され、その後ポリビニリデンフルオリド (PVDF) 膜に転写された。膜は5% (w/v) スキムミルクで室温で2時間ブロッキングされ、その後、マウス抗β-アクチン (1:300; sc-47778)、抗p53 (1:300; sc-126)、およびThr55リン酸化p53 (p-p53) (1:300; sc-377553; いずれもSanta Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA) 抗体とともに4℃で一晩インキュベートされた。膜はTBSTバッファーで洗浄され、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 結合二次抗体 (抗ウサギ1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Inc) と60分間プローブされた。ブロットシグナルは、強化化学発光 (ECL) 試薬を用いた化学発光により可視化され、オートラジオグラフィーが実施された。画像はその後フィルムプロセッサーを用いて撮影され、Image-Jソフトウェアを用いて解析された。
定量的リアルタイムPCR: Bcl-2関連Xタンパク質 (Bax) およびB細胞リンパ腫2 (Bcl-2) 遺伝子の発現は、MIQEガイドラインに従って定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (qRT-PCR) を用いて評価された。MDA-MB-231細胞株からの総RNAはRNA精製キット (AnaCell, Tehran, Iran) を用いて抽出された。その後、各サンプルからの1 μgの総RNAはcDNA合成キット (AnaCell, Tehran, Iran) を用いて逆転写された。プライマー配列はTable 1に示されている。Bax、Bcl-2、およびβ-アクチンのmRNA発現レベルは、SYBR Green RealQ Plus 2X Master Mix Green (Ampliqon, Skovlunde, Denmark) を用いたqRT-PCR法により、Rotorgene Real-Time PCR System Cycler (Qiagen, Hilden, Germany) で定量された。すべてのqRT-PCR反応は二重で行われ、β-アクチン発現に対して正規化された。相対遺伝子発現は2^-ΔΔCt法を用いて計算された。
統計解析: すべての連続変数はShapiro-Wilk検定を用いて正規性を検討した。正規分布データの場合、結果は平均 ± 標準誤差 (SEM) として提示された。しかし、歪んだデータの場合、対数変換が適用され、結果は中央値と四分位範囲 (IQR) として提示された。統計解析は、Tukey HSD事後検定を伴う一元配置分散分析 (one-way ANOVA) を用いて実施された。解析に使用された統計ソフトウェアパッケージはSPSSバージョン16.0およびGraphPad Prismバージョン9.5であった。p < 0.05を有意水準とみなした。