- 著者: Annette Becker, Basant Kumar Thakur, Joshua Mitchell Weiss, Han Sang Kim, Héctor Peinado, David Lyden
- Corresponding author: Héctor Peinado (CNIO, Madrid), David Lyden (Weill Cornell Medicine)
- 雑誌: Cancer Cell
- 発行年: 2016
- Epub日: 2016-12-12
- Article種別: Perspective (Review)
- PMID: 27960084
背景
細胞外小胞 (extracellular vesicles; EV) は腫瘍細胞と周囲の間質細胞・免疫細胞・骨髄由来細胞 (bone marrow-derived cells; BMDC) 間の相互コミュニケーションを媒介する重要なメッセンジャーとして認識されるようになった。EVの生物学的役割はWolf (1967) による血小板由来小胞の血液凝固への関与の報告にさかのぼる。Trams ら (1981) はEVが栄養物質・栄養因子の細胞間輸送に必須の役割を担うことを示した。さらに Raposo ら (1996) はB細胞由来エクソソームが抗原提示とT細胞刺激に重要であることを報告し、免疫細胞間コミュニケーションにおけるEVの役割を開拓した。
EVには直径30〜150 nmのエクソソーム、より大型のマイクロベシクル (microvesicle)・エクトソーム (ectosome)・オンコソーム (oncosome)、直径1〜10 μmの大型オンコソーム (large oncosome) など多様なサブタイプが存在するが、これらを明確に区別する確立された手法がなく、多くの研究では「エクソソーム」の語が混在して用いられている。EVはDNA、mRNA、miRNA、タンパク質 (受容体・酵素・ECM タンパク質)、脂質など多彩な生物活性分子をカーゴとして含み、受容細胞の機能を再プログラム可能である。EV同定マーカーとしてはテトラスパニン (CD9、CD63、CD81) と TSG101 (tumor susceptibility gene 101)・シンテニン (syntenin) が用いられてきたが、これらだけでは各 EV サブタイプを厳密に区別するには不十分という課題が未解明のまま残っていた。
従来の研究では、腫瘍由来EVが血管新生促進、凝固亢進、免疫系の調節、間質細胞のリモデリングを通じて腫瘍進展を後押しすることが示されてきた (Peinado et al. 2011; Ciardiello et al. 2016)。しかし、原発腫瘍の局所微小環境での働きから遠隔臓器への「前転移ニッチ (pre-metastatic niche; PMN)」形成への寄与、さらに臨床的なバイオマーカー・治療標的としての意義までを体系的に整理したレビューは不足していた。特に腫瘍EVによる臓器指向性転移の分子機構と、PMN形成の段階的カスケードの統合的理解が手薄であり、本 Perspective は、腫瘍由来EVによる転移カスケードの包括的な機序を統合的に論じることで、この分野の知識的空白を埋めることを目指している。
目的
腫瘍由来EVが原発腫瘍の増殖・浸潤、全身循環中での凝固・免疫調節、遠隔前転移ニッチ形成、および転移確立に果たす多段階の役割を系統的にレビューするとともに、バイオマーカーおよび治療標的としての臨床的可能性を論じることを目的とする。
結果
腫瘍EVによる原発腫瘍微小環境の制御： 腫瘍細胞はEVを介して同一原発腫瘍内の他の腫瘍細胞へ発がん性分子を水平伝播できる。Al-Nedawi ら (2008) は膠芽腫 (glioblastoma multiforme; GBM) 細胞において EGFRvIII (EGF受容体変異体III、リガンド非依存的に低レベルで恒常的に活性化する変異) を発現する細胞が分泌したマイクロベシクルが、EGFRvIII 陰性細胞に EGFRvIII を移送し、MAPK および Akt 経路の活性化を通じて受容細胞の形態変換と増殖加速を誘導することを示した。EGFRvIII は GBM 患者の25〜64%に認められ、EV媒介性の「オンコジーン共有」が腫瘍内不均一性と進展を促進する仕組みを提示している (Fig. 1)。
腫瘍EVは周囲の間質細胞に対しても多面的な影響を及ぼす。TGF-βを内包した腫瘍由来エクソソームは線維芽細胞を筋線維芽細胞 (myofibroblast) へと転換し、血管新生・腫瘍増殖・局所浸潤を促進する (De Wever 2008; Webber 2010)。膵臓がん由来エクソソームはテトラスパニン8 (tetraspanin 8) を介して血管新生関連遺伝子発現を内皮細胞で活性化させる (Nazarenko 2010)。さらに腫瘍由来EVはECM分子フィブロネクチンを含み細胞運動性を促進し、EMMPRIN (extracellular matrix metalloproteinase inducer) を線維芽細胞へ移送して MMP 産生を誘導する (Sidhu 2004)。Rab27b 介在性の HSP90 (heat shock protein 90) エクソソーム放出は MMP2 (matrix metalloproteinase-2) を活性化し ECM 成分を分解、増殖因子を遊離させる (Hendrix 2010)。大型オンコソームもまた ARF6 (ADP-ribosylation factor 6)・カベオリン-1 (Cav-1)・MMP9・MMP2 を豊富に含み、局所浸潤を促進する (Di Vizio 2012) (Fig. 1)。
低酸素環境はEV分泌の量・内容物を大きく変化させる。HIF-1α (hypoxia-inducible factor 1-alpha) の活性化によって乳がん細胞のエクソソーム放出量が増大し、GBM 由来エクソソームは低酸素条件下でサイトカイン・増殖因子分泌を誘導して血管新生とペリサイト遊走を促進する (Kucharzewska 2013)。このように低酸素微小環境がEVカーゴと機能を根本的に変容させ、局所・全身の双方に影響を与えることが強調されている。
腫瘍EVは上皮間葉転換 (EMT) にも関与し、HRAS 過剰発現細胞から分泌されるエクソソームがビメンチン・MMP など間葉系マーカーを含みEMT誘導の可能性が示唆されている。乳がん由来エクソソームは脂肪組織由来間葉系幹細胞を筋線維芽細胞表現型に誘導し、TGF-β・VEGF・SDF-1 (stromal cell-derived factor-1)・CCL5 (C-C motif chemokine ligand 5) の発現を増大させる (Cho 2012)。miRNA を内包するエクソソームが単一エクソソームあたり平均約1分子以下のmiRNAしか含まない可能性も示唆されており (Chevillet 2014)、大規模な遺伝子発現抑制に必要な化学量論的充足に疑問が呈されている (Fig. 1)。
免疫系に対する複雑な二面的調節： 腫瘍由来EVは免疫系に対して促腫瘍的・抗腫瘍的の双方の効果を発揮し、その均衡はEVカーゴと細胞タイプによって規定される。免疫抑制機構として、腫瘍マイクロベシクル上のFas リガンド (FasL) および TRAIL が Jurkat細胞・CD8+ T細胞のアポトーシスを誘導する (Abusamra 2005; Kim 2005)。また腫瘍由来エクソソーム上の Hsp72 が TLR2/MyD88 依存的に STAT3 を活性化し、骨髄由来抑制細胞 (MDSC) の分化・拡大を促進する (Chalmin 2010)。NK細胞の増殖と細胞傷害活性は腫瘍エクソソームによって抑制されうる (Liu 2006)。リンパ節内の傍皮質洞マクロファージバリアが化学療法・免疫療法によって破壊されると、黒色腫EVがB細胞と相互作用して促腫瘍性液性免疫を惹起する (Pucci 2016)。乳がん由来エクソソームは腫瘍関連マクロファージ (TAM) の NF-κB 活性化と炎症性サイトカイン分泌を促し、miR-150 を TAM に移送して VEGF など血管新生因子を増大させ腫瘍増殖を加速する (Liu 2013)。乳がん由来エクソソームはさらに好中球の動員と腫瘍増殖を促進する (Bobrie 2012)。
一方、抗腫瘍免疫としては樹状細胞 (DC) 由来エクソソームが MHC クラスI・II、共刺激分子を提示し CD4+ および CD8+ T細胞の抗腫瘍応答を活性化しうる (Zitvogel 1998)。加えて熱刺激下のマウスBリンパ腫からは免疫原性分子 (MHC、CD40、CD86、IL-1β) を含むエクソソームが放出され、DC の成熟と CD8+ 細胞傷害性T細胞応答を惹起する可能性がある (Chen 2006)。
血液凝固促進と血管透過性亢進： 組織因子 (tissue factor; TF) を含む腫瘍由来マイクロベシクルは循環中に増加し、血栓リスクの上昇と相関する (Hron 2007; Tilley 2008)。KRAS および TP53 の変異ステータスは結腸直腸がん細胞から分泌される小胞中のTF量と相関し、膵臓がん由来 TF+・SELPLG (P-selectin glycoprotein ligand 1)+マイクロベシクルはマウスへの注射によって出血を抑制することが示されている (Thomas 2009)。これらはがん転移と血栓症の密接な関連を反映し、がん関連凝固を転移の全身的ドライバーとして位置付ける。血管透過性については、miR-105 を含む乳がん由来エクソソームが内皮細胞の密着結合タンパク質 ZO1 (zonula occludens-1) を破壊して肺の血管透過性を亢進し、転移浸潤の感受性を高める (Zhou 2014)。黒色腫由来小胞は S100a8・S100a9・TNF-α の上方調節を介して肺血管の透過性亢進と骨髄前駆細胞の動員を誘導する (Peinado 2012) (Fig. 2)。乳がん由来エクソソームも S100タンパク質のサブセットの上方調節と Src キナーゼシグナルの活性化を介して肺血管透過性を亢進し転移を促進する (Hoshino 2015) (Fig. 2)。
前転移ニッチ (PMN) 形成における臓器特異的 EV 標的化： 2015年の2つのランドマーク研究によりEVによるPMN形成の分子基盤が大幅に明確化された。Hoshino et al. Nature 2015 は腫瘍エクソソームが特定のインテグリンプロファイル (「郵便番号」) を持ち、標的臓器の常在細胞に選択的に取り込まれることを示した。具体的には exosomal α6β4 および α6β1 インテグリンが肺転移と、exosomal αvβ5 が肝転移と、exosomal αvβ3 が脳転移モデルとそれぞれ相関し、転移臓器指向性 (organotropism) を規定する。同研究では腫瘍エクソソームが標的臓器常在細胞において S100 ファミリータンパク質などの炎症性メディエーターを上方調節し、間質細胞のリモデリングと BMDC 動員を誘導することで PMN を完成させることが示された。
Costa-Silva et al. NatCellBiol 2015 は膵臓がん由来エクソソームが MIF (macrophage migration inhibitory factor) を搭載し、肝臓のクッパー細胞に優先的に取り込まれること、クッパー細胞が TGF-β を分泌し隣接する肝星細胞からフィブロネクチン産生を誘導、最終的に BMDC 動員を完成させるというステップワイズの肝転移PMN形成カスケードを解明した。PMN を形成した膵臓がん患者の早期ステージI血清エクソソームは後に肝転移を発症した患者において MIF が高値であり、予後バイオマーカーとしての可能性も示された。
Peinado et al. NatMed 2012 は黒色腫由来エクソソームが肺における PMN 形成を促進すること、メカニズムとして骨髄前駆細胞 (c-Kit+ Tie2+) への Met の上方調節が血管新生促進表現型への転換を引き起こすことを報告した。さらに Met-high 黒色腫サブポピュレーションが BRAF 阻害剤耐性を示し、Met-low 腫瘍細胞への Met 移送が肺転移を促進する連鎖が観察された。
Fong et al. NatCellBiol 2015 は乳がんマイクロベシクルから miR-122 が間質細胞に移送され、ピルビン酸キナーゼ阻害を介して PMN における間質細胞のグルコース取り込みを低下させ、腫瘍細胞が利用可能なグルコースを増大させる代謝的PMN再プログラム機構を解明した。Zomer et al. Cell 2015 は高転移性細胞由来エクソソームが低転移性細胞・遠隔間質細胞に受容され、転移表現型をコピーする「phenocopying」の in vivo可視化を達成した。
臨床応用: バイオマーカーと治療標的： 循環EVはがん患者の血清・尿・唾液から単離可能であり、診断・予後マーカーとしての価値が急速に明らかにされている (Fig. 3)。EpCAM (epithelial cell adhesion molecule) 陽性エクソソームは卵巣がん患者で良性疾患・健常者より有意に高値を示す (Taylor 2008)。グリピカン-1 (glypican-1) 陽性エクソソームが膵臓がんの診断・予後マーカーとして有望であり (Melo 2015)、Stage I PDAC (膵管腺がん) 患者の中で後に肝転移を発症した群では健常者比べてエクソソーム中 MIF が有意に高値であった (Costa-Silva 2015)。上述の exosomal integrin プロファイルは臓器特異的転移の予測バイオマーカーとなりうる (Hoshino 2015) (Fig. 3)。進行黒色腫 Stage IV 患者では血漿エクソソームに TYRP2 (tyrosinase-related protein-2)・VLA-4 (very late antigen 4)・HSP70・MET オンコプロテインからなるタンパク質シグネチャーが検出された (Peinado 2012)。miRNA シグネチャーとしては、血清エクソソーム中 miR-17-92a クラスター発現が結腸がん再発と相関し、miR-19a は予後不良と関連する (Matsumura 2015)。前立腺がん患者の尿中エクソソーム miR-107 および miR-574-3p が健常者より高値を示し、転移性去勢抵抗性前立腺がんでは血清エクソソーム高 miR-1290・miR-375 が短縮された生存と相関した (Huang 2015; Bryant 2012)。
治療面では、DC (dendritic cell) 由来エクソソームに MHC/腫瘍抗原 (MAGE-A3 等) を搭載した Phase I 試験が進行黒色腫・NSCLC で実施され、安全性と実行可能性が確認された。後続の Phase II 試験 (IFN-γ 成熟 DC エクソソーム) では持続的臨床応答は得られなかったが、一部患者で NKp30 (natural killer cell cytotoxicity receptor 30) 低発現症例における NK 細胞活性増強と PFS 延長の傾向が観察された (Besse 2016) (Fig. 3)。Rab27a ノックダウンによるエクソソーム産生抑制が高転移性黒色腫・乳がんの腫瘍サイズと転移を有意に低下させ、EV 産生経路が治療標的となりうることが実証された。エクソソーム搭載薬剤デリバリーの概念実証として、神経細胞標的化エクソソームへの Bace1 (beta-site APP cleaving enzyme 1) siRNA 搭載は神経細胞において Bace1 mRNA 60%・タンパク質 62% の有意な減少を達成した (Alvarez-Erviti 2011)。抗がん薬耐性のメカニズムとして、アドリアマイシン・ドセタキセル耐性 MCF-7 乳がん細胞由来エクソソームが miR-100・miR-222・miR-30a を薬剤感受性細胞へ移送し、n=3 独立実験で薬剤耐性を有意に増大させることが示された (Chen 2014)。
考察/結論
① 先行研究との違い： 従来の転移研究は腫瘍細胞自律的な運動能・浸潤能に焦点を当ててきたが、本レビューが明示するように、腫瘍由来EV が原発腫瘍微小環境の遠隔事前整備 (PMN) から転移定着まで、「転移の下準備」として機能するという視点はこれまでと異なり、全身システムとしてのがん転移観を提示する。特に Hoshino 2015 のインテグリン「臓器郵便番号」仮説は従来の「種と土壌 (seed and soil)」概念 (Paget 1889) を分子レベルで再解釈するものであり、これまでにない転移臓器選択性の規定機序を提示した点で際立つ。また、血管透過性・凝固亢進・免疫抑制のいずれもが単一の EVシグナルに収束しうる点も、従来の臓器別転移メカニズム論とは対照的である。
② 新規性： 本 Perspective は腫瘍EV研究の多岐にわたる知見を「転移カスケード」という統一フレームで初めて包括的に整理した点で新規の意義を持つ。特に (a) exosomal integrin による臓器特異的標的化、(b) PMN の段階的形成 (MIF → クッパー細胞 → TGF-β → 肝星細胞 → BMDC) の分子メカニズム、(c) miR-122 による代謝的 PMN 再プログラムという3つのステップワイズ機序を初めて一連の転移ナラティブとして接続した点が本研究で初めて明示された統合的洞察である。また治療標的として Rab27a (EV産生制御)、exosomal integrin (臓器標的性)、腫瘍EVカーゴ (MIF・MET・KIT) が初めて体系化された。
③ 臨床応用： 本レビューは腫瘍由来EVの臨床的有用性を2方向から提示している。バイオマーカーとしては液体生検サンプル中の exosomal integrin プロファイル、miRNA シグネチャー、特定タンパク質 (MIF、EpCAM、グリピカン-1) が転移リスク・臓器指向性・予後の指標となりうる。治療標的としてはEV産生抑制 (Rab27a/b)・特異的オンコジーンカーゴ (MIF・MET・KIT)・transmembrane integrin への介入、さらにEVを活用した siRNA 薬剤デリバリーシステムの開発が臨床翻訳への現実的経路として位置付けられる。DCエクソソームを用いた免疫療法の Phase I/II 試験は概念実証として重要だが、持続的臨床効果の実現には NKp30 発現等の患者選択バイオマーカーの同定が今後の鍵となる。
④ 残された課題： 本レビューは多くの未解決問題を提示している: (1) EV サブポピュレーション (エクソソーム vs マイクロベシクル) の分離・同定手法の標準化が不十分であり、各サブタイプ固有の機能解明が必要、(2) miRNA 移送の定量的意義については単一エクソソームあたり平均1分子以下であることが示唆され (Chevillet 2014)、実際の受容細胞遺伝子発現への寄与は限定的との異論がある、(3) 多くの知見が in vitro モデルに依存しており in vivo の生理的条件下でのEV動態・挙動の解明が不可欠、(4) がん患者における循環EV中の腫瘍由来成分と非腫瘍由来成分の区別法が未確立、(5) EVによる受容細胞の遺伝的・エピジェネティック再プログラムが一時的か永続的かの検討が今後の研究方向性として重要である。
方法
該当なし (Perspective Review)。PubMedをはじめとする文献データベースを通じて収集されたEV生物学・腫瘍生物学・臨床応用に関する主要原著論文を包括的に引用・合成した文献レビューである。EV研究の国際的コンセンサス用語 (Colombo 2014等) に準拠しつつ、各著者が選択した用語を尊重する形で記述している。
本レビューが引用する原著研究では、EV単離法として超遠心分離法 (differential ultracentrifugation; 100,000 × g ペレット) が標準的に採用されており、一部の研究ではサイズ排除クロマトグラフィー (size exclusion chromatography; SEC) や密度勾配遠心法が用いられた。EV同定・特性評価には、テトラスパニンマーカー (CD9、CD63、CD81) と内腔マーカー (TSG101、syntenin) のウェスタンブロット、ナノ粒子トラッキング解析 (NTA) による粒子径・濃度測定、透過型電子顕微鏡 (TEM) による形態確認が行われた。統計解析手法については、各原著論文の記載に依拠しており、臨床試験は通常のログランク検定・Cox 比例ハザードモデルを採用している。