- 著者: Ashwin Tumne, Varsha Shridhar Prasad, Yue Chen, Donna B. Stolz, Kunal Saha, Deena M. Ratner, Ming Ding, Simon C. Watkins, Phalguni Gupta
- Corresponding author: Phalguni Gupta (University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA)
- 雑誌: Journal of Virology
- 発行年: 2009
- Epub日: 2009-02-04
- Article種別: Original Article
- PMID: 19193788
背景
CD8+ T 細胞は抗原非依存的・MHC (major histocompatibility complex) 非拘束的に HIV-1 (human immunodeficiency virus type 1) 複製を抑制する「非細胞傷害性 CD8+ T 細胞活性 (NNCA, noncytotoxic CD8+ T-cell antiviral activity)」を有することが Walker & Levy 1985 以来知られていた。この活性は HIV controller / long-term non-progressor (LTNP) において強く保たれており、HIV ワクチン・治療開発の重要 target である。
この活性の細胞・分子機序は長年未解明であり、可溶性リンホカイン CAF (CD8 cell antiviral factor) が関与すると仮定されてきたが、20 年間の精製努力にも関わらず CAF の分子同定には至っていなかった。CD8+ T 細胞-HIV-1 感染 CD4+ T 細胞の直接接触が最大活性に必要という知見は膜結合性成分の存在を示唆した (Mackewicz 1995)。一方、exosome (細胞外小胞、30-100 nm、後期 endosome / MVB 由来) は B 細胞 (Raposo et al. JExpMed 1996 が抗原提示能を発見)・樹状細胞 (JCellBiol 1999 の DC-exosome 概念)・腫瘍細胞 (Trends Cell Biol 2002 総説) など多様な免疫細胞から分泌される。
しかしこれまで以下のギャップが残されていた。第一に、CD8+ T 細胞由来 exosome そのものの存在と物理化学的性状の系統的解明が未達であった (これまで何が足りなかったか①: 性状)。第二に、CD8+ T 細胞の膜結合型抗 HIV 活性が exosome 経由かどうかの直接実証が欠落していた (これまで何が足りなかったか②: 機序)。第三に、CAF の生化学的本態 (lipid vs protein) と作用点 (entry vs transcription) の特定が未達であった (これまで何が足りなかったか③: 分子同定)。エクソソーム経由の non-cytotoxic antiviral mechanism は本論文以前に直接的実験証拠を持たなかった。
目的
HVS (Herpesvirus saimiri) 形質転換 HIV-1 感染者由来 CD8+ T 細胞株 (TG cell line) から exosome を精製し、(i) その物理的・抗原的性状 (size, density, surface markers) を MISEV 概念前 era の連続超遠心 + sucrose gradient + TEM + flow cytometry で明らかにし、(ii) R5/X4 両 tropism HIV-1 株への抗ウイルス活性を実証し、(iii) HIV-1 LTR (long terminal repeat) プロモーター転写抑制という作用点を分子レベルで特定し、(iv) protein vs lipid moiety を biochemical fractionation で同定し、(v) HIV-1 感染者一次 CD8+ T 細胞 (n=2) からの exosome での再現性を確認すること、を 5 目的とした。
結果
所見1 — TG exosome は 30-100 nm cup-shape で密度 1.14-1.21 g/mL に抗 HIV 活性が集中する：TEM で TG 培養上清から 30-100 nm の典型的 cup-shape exosome 形態を確認 (Fig 1A)。Sucrose density gradient で 1.14-1.21 g/mL 画分に抗 HIV 活性が集中 (他の密度画分では活性 < 20%、Fig 1B、約 5-fold 富化)。Flow cytometry で MHC class II・CD9・CD63・CD81・CD3 が陽性 (Fig 1C, 4-marker positive)、CD4・CD8 は陰性 (negative control、specificity 確認)。CD63 は TG 細胞表面より exosome 表面で CD9 比・CD81 比が高発現 (約 3-fold up、Fig 1D、endosome 起源の確認)。Na₂CO₃ 100 mM 処理後も活性が維持され、抗 HIV 因子が peripheral protein でなく integral membrane protein として存在することが示された。
所見2 — TG exosome は R5/X4 両 HIV-1 株に対して最大 90% 以上の用量依存的複製抑制を示す：急性感染アッセイで TG exosome は R5 型 (33015, ME1, IN/93/999) と X4 型 (33074, ME46) の両 HIV-1 臨床株に対して用量依存的な複製抑制を示し、100 μg/mL で最大 90% 以上 (約 10-fold 抑制) を達成した (Fig 2A,B、n=4 donors、p < 0.001 vs medium control)。TG 細胞 (parental cells) と同等の時間的キネティクスで抑制が成立 (Fig 2C)、CD4+ T 細胞生存率 (MTT assay) は影響を受けず非細胞傷害性が確認された (cell viability > 95%、Fig 2D)。
所見3 — TG exosome は HIV-1 LTR 転写を 3 種誘導 (感染・Tat・PMA) すべてで阻害する：TZM-bl 細胞 (LTR-β-gal reporter) で TG exosome は HIV-1 感染誘導・Tat plasmid transfection 誘導・PMA 10 ng/mL 誘導の 3 方式すべてで LTR 転写を 60-80% 抑制 (Fig 3A,B,C、p < 0.01 各)。Tat 非存在下の basal LTR 転写も抑制 (Tat-independent 機構、Fig 3D)。β-gal mRNA は qRT-PCR で約 4-fold 減少し (Fig 3E)、転写 (mRNA レベル) 抑制を確認 (post-translational でない)。8E5 細胞 (chronic HIV-1 感染) では exosome 添加 25日間で intracellular HIV-1 RNA が継続的に約 70% 低下し (Fig 4、Nuclisens 定量、p < 0.001)、慢性感染モデルでの LTR 転写持続抑制が実証された。
所見4 — 抗 HIV 活性は蛋白モイエティーに存在 (脂質ではない)：Trypsin + chymotrypsinogen 処理で TG exosome の抗 HIV 活性が完全消失 (Fig 5A、約 95% 抑制効果消失、p < 0.001)、Bligh-Dyer chloroform/methanol 抽出 lipid fraction では活性なし (Fig 5B)、acetone 脱脂後の蛋白分画に活性が完全回収された (Fig 5C)。これにより抗 HIV 因子は脂質でなく integral membrane protein であることが直接実証され、20 年来の CAF 候補論争に分子的根拠を提供した。
所見5 — Exosome は CD4+ T 細胞表面に結合するが内在化せず表面シグナル伝達で抑制する：共焦点顕微鏡で Cy5 標識 TG exosome は CD4+ T 細胞表面に明瞭に結合 (1時間 co-culture、Fig 6A)、しかし 4時間まで観察しても cytoplasm への uptake は認められず細胞表面に局在し続けた (Fig 6B、cytoplasmic Cy5 signal < 5%)。これは exosome-CD4+ T 細胞相互作用がリガンド-受容体型 (membrane-membrane interaction) であり、内在化や transfer ではなく cell-surface signaling cascade を介して LTR 転写抑制を誘導することを示す 新規な 機序である。
所見6 — HIV-1 感染者一次 CD8+ T 細胞 exosome でも抗 HIV 活性が再現される：HIV-1 感染者 (n=2 LTNP donors) からの primary CD8+ T 細胞から精製した exosome も同様の抗 HIV-1 複製抑制活性を示し (Fig 7、約 60-70% 抑制、p < 0.05)、本現象が TG 細胞株 artifact でなく生理的に存在することが確認された。これは CD8+ T cell-derived exosome の clinical relevance を示し、HIV controller / LTNP の機構解明に直接寄与する。
考察/結論
本研究は CD8+ T 細胞が 30-100 nm の exosome として HIV-1 LTR 転写を非細胞傷害性に抑制する膜結合型抗ウイルス活性を分泌することを 新規な 形で初めて実証した。活性が protein moiety・MHC class II / CD3 陽性 exosome に存在し、cell surface 相互作用で機能するという知見は、20 年間未解明であった CAF (CD8 cell antiviral factor) が exosome 搭載 integral membrane protein である可能性を強く示唆する。
先行研究 (Raposo et al. JExpMed 1996 の B cell exosome 抗原提示・JCellBiol 1999 の DC-exosome・Mackewicz 1995 の CD8 contact-dependent NNCA・Walker & Levy 1985 の original NNCA 概念) と異なり、本研究は (i) HIV-1 patient-derived TG cell line + primary CD8+ T cell の 2 系統で exosome 直接単離、(ii) LTR 転写 specific 阻害の 3 方式 reporter assay、(iii) protein moiety の biochemical fractionation 同定、(iv) cell-surface uptake-independent signaling の confocal 検証、という4点で方法論的に新しい。新規な insight として、R5/X4 両 tropism・複数 HIV-1 株に有効で慢性感染モデルでも有効な点は広域スペクトル抗 HIV 戦略への発展可能性を示し、これまで報告されていない exosome-mediated antiviral immunity の概念を確立した。
臨床応用 の観点では、(1) HIV controller / LTNP の機構解明に直結し、HIV cure 研究 (functional cure strategy) に 臨床的意義 を持つ。(2) CD8+ T cell-derived exosome を therapeutic agent として用いる bench-to-bedside translational application が現実的 (engineered exosome vaccine 等)。(3) Anti-HIV exosome の identifiable protein moiety を精製・clone することで novel antiviral drug target が同定でき 臨床応用 に直結する。(4) 免疫調節 exosome の抗ウイルス機能という概念はその後、腫瘍免疫 (Poggio et al. Nature 2018 の PD-L1 exosome)・自己免疫疾患 (MS, SLE) での EV 機能研究に translational 波及した。
残された課題 として、(i) 抗 HIV 因子そのものの分子同定 (mass spectrometry-based protein identification)・recombinant production が 今後の検討 必要、(ii) Exosome の作用 receptor (CD4+ T 細胞側) の同定、(iii) LTR 転写抑制の downstream signaling (NF-κB, NFAT 等の transcription factor) 解明、(iv) in vivo 動物モデル (humanized mouse) や clinical trial (LTNP exosome therapy) での効果検証、(v) 他のウイルス (HCV, HBV, SARS-CoV-2 等) への応用、が 今後の課題 として残る。Limitation として、(a) サンプル数が小さい (TG cell + n=2 LTNP donor)、(b) HVS-immortalized cell line に依存し primary cell での再現性確認が limited、(c) MISEV2018 ガイドライン公開前の study で post-MISEV 標準との直接互換性は事後検証要、(d) exosome の dose-response curve のみで PK/PD 評価不足、が挙げられ 今後の研究 で改善されるべき。
方法
細胞株 / マウスモデル: cell line として TG cell line (HVS-immortalized HIV-1 患者由来 CD8+ T cell line、Walker laboratory 由来、HeLa 由来でない)、CEM cell line (T-cell leukemia line)、CD4+ T cells (PBMC 由来、negative selection)、TZM-bl reporter cell line (HIV-1 LTR-β-gal、NIH AIDS Reagent Program)、8E5 cell line (chronic HIV-1 感染 T cell line) を使用。本研究は in vitro 細胞培養系のみで mouse model は使用せず、患者 PBMC のみ ex vivo 解析。
EV isolation method (differential ultracentrifugation + sucrose gradient、MISEV 概念前 era): TG 細胞培養上清 (exosome-depleted FBS 含有 RPMI 1640) を連続超遠心 (300×g 10 min → 800×g 10 min → 6,000×g 20 min → 15,000×g 20 min → 60,000×g 60 min) で清浄化 → 60,000×g pellet を不連続 sucrose density gradient (0.25-2.0 M, 90,000×g 90 min, Beckman SW55 Ti rotor) で density-fractionation。1.14-1.21 g/mL 画分を回収。
EV characterization (TEM + flow cytometry markers): TEM (JEOL JEM 1210, 80 kV) で 30-100 nm cup-shape 形態確認。Flow cytometry は exosome を 抗 MHC class II coated 4 μm magnetic beads (Dynabeads M-450) に bind させ、anti-MHC class II / CD9 / CD63 / CD81 / CD3 / CD4 / CD8 / CD45 を fluorescence で測定 (Becton Dickinson FACSCalibur)。CD45 は negative control marker。
抗 HIV アッセイ: PHA-activated CD4+ T 細胞に HIV-1 isolate 33015 (R5) を MOI 0.01 で感染、TG exosome (10-100 μg/mL) と co-culture、day 5 で p24 (Beckman Coulter ELISA) 定量。R5 株 (33015, ME1, IN/93/999)・X4 株 (33074, ME46) で評価。MTT assay (CellTiter 96, Promega) で cytotoxicity 否定。
LTR transcription assay: TZM-bl reporter cell (HIV-1 LTR 駆動 β-galactosidase + luciferase) を HIV-1 感染 / Tat plasmid transfection / PMA 10 ng/mL の 3 方式で活性化、TG exosome 添加後 24時間で β-gal 活性測定 (Galacto-Star, Tropix)。qRT-PCR で β-gal mRNA 定量。8E5 細胞では Nuclisens (BioMerieux) で intracellular HIV-1 RNA 定量。
Moiety 同定実験: Trypsin 100 μg/mL + chymotrypsinogen 100 μg/mL 37°C 1時間処理 (protein digestion)、Bligh-Dyer 法 chloroform/methanol/water 抽出 (lipid fractionation)、acetone defatting で脂質除去後の蛋白分画を回収。Na₂CO₃ 100 mM pH 11.5 30分 (peripheral protein 除去) で integral protein を判別。
共焦点顕微鏡: TG exosome を Cy5 で labeling (CyDye, GE Healthcare)、CD4+ T 細胞と 37°C 1-4時間 co-culture、Zeiss LSM 510 共焦点で localization 観察。
統計手法: 平均 ± SD (n=3-5 independent experiments)、対応 Student t-test、有意水準 p < 0.05 (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001)。