- 著者: Peng Xiao, Yu-kang Liu, Wei Han, Yan Hu, Bo-you Zhang, Wen-liang Liu
- Corresponding author: Wen-liang Liu (Department of Thoracic Surgery, The Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, P.R. China)
- 雑誌: Molecular Cancer Research
- 発行年: 2021
- Epub日: 2021-02-09
- Article種別: Original Article
- PMID: 33563765
背景
EGFR変異を有する非小細胞肺がん (NSCLC) は、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤 (EGFR-TKI) であるゲフィチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブなどが標準治療として用いられ、患者に顕著な臨床的利益をもたらしている。しかし、治療の長期有効性は、二次EGFR変異 (T790M) やMET遺伝子増幅といった既知の耐性機序に加え、約30%の患者で機序不明の耐性が発生することにより制限されている Huang et al. ActaPharmSinB 2015。したがって、標的遺伝子変異以外のTKI耐性メカニズムを解明することは、その臨床的有効性を大幅に高める可能性がある。
エクソソームは、細胞から分泌される直径30〜100 nmの小胞であり、タンパク質、DNA、mRNA、miRNA、長鎖ノンコーディングRNAなど、ドナー細胞由来の多様な物質を内包する。これらは細胞間情報伝達の重要なメディエーターとして機能し、薬剤耐性細胞から感受性細胞への耐性伝達にも関与することが、シスプラチンやゲムシタビン耐性において先行研究で報告されている (Wang et al. J Control Release 2017)。NSCLCにおけるゲフィチニブ耐性へのエクソソームの関与を示す報告はいくつか存在するものの、その分子的実体は未解明であった。
一方、N6-メチルアデノシン (m6A) は、哺乳類mRNAにおいて最も頻繁にみられるエピジェネティック修飾であり、METTL3 (methyltransferase like 3)/METTL14 (methyltransferase like 14) (writer)、FTO (fat mass and obesity-associated protein)/ALKBH5 (alkB homolog 5, RNA demethylase) (eraser)、YTHDF1-3 (YTH domain family protein 1-3)/IGF2BP (insulin like growth factor 2 mRNA binding protein) (reader) といった酵素群によって動的に制御される。m6A修飾はmRNAの安定性、スプライシング、翻訳に影響を及ぼし、様々な生物学的プロセスに不可欠である (Chen et al. Cell Stem Cell 2015)。特に、FTOは白血病においてm6A脱メチル化を介したTKI耐性誘導が報告されており、動的なm6Aメチロームが可逆的なTKI耐性状態の追加のエピジェネティックドライバーであることが示唆されている (Yan et al. Cell Res 2018)。しかし、NSCLCにおけるm6AとTKI耐性の関係は明確に確立されていなかった。
固形腫瘍における分子解析のための組織生検は、特に薬剤耐性獲得時の研究において困難を伴うことが多い。このため、体液の分析、すなわちリキッドバイオプシーが注目を集めている。血清エクソソームの解析は、リアルタイムでの耐性発生の監視や、その後の治療指針の決定に有用な検出バイオマーカーの一つとして期待されており、耐性機序探索の新たな戦略として有望視されていた (Castellanos-Rizaldos et al. Clin Cancer Res 2018)。本研究は、この知識のギャップを埋めることを目指した。これまでの研究では、TKI耐性におけるエクソソームとm6A修飾の関連性について、包括的なメカニズム解明が不足している状況であった。
目的
本研究の目的は、ゲフィチニブ感受性 (GS) およびゲフィフィニブ耐性 (GR) の非小細胞肺がん (NSCLC) 患者の血清エクソソームのRNAシーケンス (RNA-seq) を実施し、GR特異的に高発現する因子を網羅的に同定することである。さらに、エクソソームを介したFTO (fat mass and obesity-associated protein) 輸送が、FTO/YTHDF2 (YTH domain family protein 2)/ABCC10 (ATP binding cassette subfamily C member 10) 軸を通じて受容細胞のゲフィチニブ耐性を誘導する新規分子機序を、in vitroおよびin vivoの両方で詳細に検証することを目指した。この研究は、ゲフィチニブ耐性の新たな分子メカニズムを解明し、将来的な治療標的やリキッドバイオプシーバイオマーカーの可能性を探ることを意図している。特に、m6Aエピジェネティック修飾がエクソソームを介した薬剤耐性伝達にどのように関与するかを明らかにすることが、本研究の主要な目的である。
結果
GR患者血清エクソソームにおけるFTOの特異的高発現: ゲフィチニブ感受性 (GS) 患者18名とゲフィチニブ耐性 (GR) 患者15名から採取した血清エクソソームのRNA-seq解析により、GR群とGS群間で289個のmRNAに有意な差次発現が同定された。このうち252個が有意に上昇し、37個が有意に低下していた (GR vs. GS)。特に、m6A RNA脱メチル化酵素であるFTOがGR-Exoでlog2FC=8.65 (p=0.007) と顕著な上昇を示した (図1D)。独立した患者コホート (GR n=15 patients、GS n=18 patients) でのqPCR検証でも、GR群エクソソームのFTO mRNA量がGS群より有意に高かった (p<0.05) (図1E)。さらに、GR患者の末梢血mRNA (n=10 patients) における総m6A比率は、GS患者 (n=10 patients) と比較して有意に低く (p<0.01) (図1F)、FTO過剰によるm6A消去の全身的な影響が示唆された。腫瘍組織におけるFTO mRNAもGR群で有意に高発現であったが (p<0.05)、組織総m6A量には両群間で有意差がなかった。ウェスタンブロット (WB) でも、PC9/GRおよびNCI-H1975細胞でPC9と比較してFTO発現の明確な増加が確認された (図2C)。
GR細胞由来エクソソームによる感受性PC9細胞への耐性伝達: PKH67で標識したPC9/GR由来エクソソーム (PC9/GR-Ex) およびNCI-H1975由来エクソソーム (H1975-Ex) をPC9細胞に5時間添加すると、エクソソームの取り込みが共焦点顕微鏡で確認された (図3C)。PC9/GR-ExまたはH1975-Ex処理PC9細胞 (n=3 replicates) では、PC9由来エクソソーム (PC9-Ex) 処理対照と比較して総m6A量が有意に低下した (p<0.05〜0.01) (図3D)。CCK-8アッセイでは、ゲフィチニブ0.1および1.0 μmol/L処理下で細胞生存率が有意に上昇し (p<0.01〜0.001) (図3E)、EdU陽性率およびコロニー形成数の増加、Annexin V陽性アポトーシス率の有意な低下が確認された (PC9-Ex処理後、ゲフィチニブ処理でアポトーシス率がUR 2.5%/LR 3.1%からGR-Ex処理後UR 9.1%/LR 7.8%に減少) (図3F-H)。これらの結果は、GR-Exoの取り込みがPC9細胞にゲフィチニブ耐性表現型を誘導することを示した。
FTO低減がエクソソーム介在性耐性伝達を阻害: FTOをshRNAレンチウイルスでPC9/GRおよびNCI-H1975細胞で安定的にノックダウン (KD) すると、KD細胞 (n=3 replicates) およびそれらが分泌するエクソソームの両方でFTO発現が顕著に低下した (図4A)。FTO-KD GR-Exo (Lv-FTOsi-Ex) を処理したPC9細胞は、NC-KD GR-Exo (Lv-NCsi-Ex) 処理細胞と比較して、ゲフィチニブ1.0 μmol/Lでの生存率が有意に低下し (p<0.01) (図4B)、総m6A量が有意に上昇し (p<0.05) (図4C)、アポトーシス率が有意に上昇し (図4D, F)、EdU陽性率およびコロニー形成数が有意に低下した (図4E, G-I)。WBでも、ABCC10、ABCG2、Bcl-2の発現がFTO-KD Exo処理群で低下し、Baxが上昇した (図4J)。これらの結果は、FTOがGR-Exo介在性耐性伝達の主要因子であることを直接証明した。
FTO/YTHDF2/ABCC10軸の機能的解明: 公開m6A-seqデータ (GSE87190、GSE112902、GSE128961、GSE103494) のクロス解析により、ヒト白血病細胞株 (MA9.3ITD、NB4) でのFTO KD時にABCC10 exon1領域でm6Aピークが顕著に増加することが確認された (図5A)。PC9細胞でのFTO過剰発現はABCC10のmRNAおよびタンパク質発現を増加させ (p<0.05)、FTO KDは減少させた (図5B, C)。m6A特異的qPCRにより、FTO過剰発現でABCC10 exon1のm6A修飾量が低下し、FTO KDで増加することが確認された (p<0.05) (図5D)。YTHDF2 (m6A reader; mRNA分解を促進) KD PC9細胞 (n=3 replicates) では、FTO KDによるABCC10 mRNA低下が著明に減弱した (図5F, I)。同様に、YTHDF2 KD受容PC9細胞ではGR-Exo処理によるABCC10変化も減弱した (図5G, J)。このメカニズムは、「FTO過剰発現 → ABCC10 mRNAのm6A消去 → YTHDF2によるターゲティング阻害 → ABCC10 mRNA安定化 → ABCC10タンパク質増加 → ゲフィチニブ輸送増加 → 細胞内ゲフィチニブ濃度低下 → 耐性」という経路を示唆する。
In vivo異種移植モデルでの検証: GR-Exo処理PC9細胞をBALB/cヌードマウスに皮下移植し、ゲフィチニブ (30 mg/kg/日) を投与した実験では、GR-Exo処理群 (n=7 mice) はPC9-Ex処理対照群と比較してゲフィチニブに対する腫瘍縮小効果が低く、腫瘍体積およびKi67陽性率ともに高値を示した (図6D-H)。FTO KD GR-Ex処理群では、腫瘍縮小へのゲフィチニブ有効性が部分的に回復し、エクソソームFTOの耐性誘導作用がin vivoでも確認された。しかし、YTHDF2 KD PC9細胞にFTO KD GR-Exoを吸収させた群では、腫瘍体積と腫瘍重量が再び増加し、ゲフィチニブ感受性が弱まる傾向が観察された (図6F, G)。これは、FTO/YTHDF2軸がin vivoにおけるGR細胞由来エクソソーム介在性薬剤耐性伝達に寄与することを示唆する。
考察/結論
本研究は、エクソソームを介したFTO (fat mass and obesity-associated protein) (m6A脱メチル化酵素) の細胞間輸送が、受容細胞においてABCC10 (ATP binding cassette subfamily C member 10) mRNAのm6A脱修飾、それに続くYTHDF2 (YTH domain family protein 2) によるmRNA分解からの保護、そしてABCC10タンパク質の増加という経路を通じてゲフィチニブ耐性を伝達するという新規機序を初めて実証した。この発見の意義は多岐にわたる。
新規性: 本研究で初めて、エピトランスクリプトーム (m6A)、エクソソーム、薬剤輸送体というこれまで独立して研究されてきた三つの領域を統合する新概念を提供した。特に、FTOがエクソソームを介して輸送され、受容細胞のm6Aエピゲノムを変化させることで薬剤耐性を誘導するというメカニズムは、これまで報告されていない新規の知見である。
先行研究との違い: 従来のTKI耐性研究は主に二次EGFR変異やMET増幅などの遺伝子変異に焦点を当ててきたが、本研究は、エピジェネティック修飾であるm6Aがエクソソームを介して細胞間伝達されることで薬剤耐性を引き起こすという、これまでとは異なる非遺伝子変異性の耐性メカニズムを明らかにした。また、先行研究ではアファチニブ耐性NSCLC細胞株でm6A総量が増加することが報告されていたが (Meng et al. Pharmacogenomics J 2020)、本研究ではゲフィチニブ耐性患者の血清mRNAで総m6A比率が有意に低いことを示しており、薬剤の種類や研究対象 (細胞株 vs. 臨床検体) の違いが異なる結論をもたらす可能性を示唆している。
臨床応用: GR患者血清エクソソームにおけるFTO mRNAの高発現は、機序不明のTKI耐性患者 (約30%) の一部を説明するリキッドバイオプシーバイオマーカーとしての応用可能性を秘めている。固形腫瘍での反復的な組織生検が困難な状況において、血清エクソソームFTOのモニタリングは、リアルタイムでの耐性監視や治療戦略の個別化に貢献する可能性がある。さらに、ABCC10がゲフィチニブ耐性の標的分子として浮上し、FTO/ABCC10軸が新たな治療戦略のターゲットとなり得る可能性も示唆された。
残された課題: 本研究にはいくつかのlimitationが存在する。まず、臨床コホートが33例と小規模であり、結果の一般化にはより大規模な検証が必要である。次に、in vivo異種移植モデルが免疫不全マウスを用いているため、免疫介在的な耐性機序を考慮できていない。また、ABCG2もABCC10と同様に変動したが、その詳細な機序は本研究では検討されていない。FTO以外のm6A調節因子 (ALKBH5、METTL3) の関与や、エクソソームカーゴ全体の複雑な相互作用については、今後の解析が残された課題である。EVバイオロジーの観点では、エクソソームが機能タンパク質 (本研究ではFTO mRNA) を介して受容細胞のエピジェネティック状態を書き換えるという概念は、エクソソーム介在性細胞間情報伝達の新たな層を示すものとして重要であり、他のTKI耐性メカニズムや他のエピジェネティック修飾酵素への展開が期待される。
方法
臨床サンプル: 2018年2月から2019年2月にかけて、第二湘雅病院でゲフィチニブ治療を受けた肺腺がん患者33名 (ゲフィチニブ感受性 (GS) 18名、ゲフィチニブ耐性 (GR) 15名) から末梢血を採取した。両群間に年齢 (中央値58〜59歳)、性別、喫煙歴、病期 (全例Stage IV) の有意差は認められなかった (p>0.7)。患者から書面によるインフォームドコンセントを得て、ヘルシンキ宣言および中央南大学湘雅第二病院倫理委員会 (プロジェクト番号: 20190722) の承認の下で研究を実施した。
エクソソームの単離と特性評価: 血清および細胞培養上清からExoQuick沈殿法 (SBI, EXOQ20A-1) を用いてエクソソームを単離した。単離されたエクソソームは、透過型電子顕微鏡 (TEM) により直径40〜200 nmのソーサー型小胞として観察され、ナノ粒子トラッキング解析 (NTA) でサイズ分布を確認した。エクソソームマーカーであるTSG101およびCD81はウェスタンブロット (WB) で検出した。エクソソームの受容細胞への取り込みは、PKH67 (Sigma, CGLDIL) で標識したエクソソームを共焦点顕微鏡 (Zeiss LSM880) で可視化することで確認した。
RNAシーケンスとバイオインフォマティクス解析: 患者血清エクソソームから全RNAを抽出し、Kaitai BiotechおよびYearth BiotechでRNA-seqおよび関連するバイオインフォマティクス解析を実施した。差次発現遺伝子は、|log2 fold change| > 1かつp < 0.05を基準として選択した。シーケンスデータはGene Expression Omnibus (GEO) リポジトリ (GSE163597) に登録されている。
m6A総量の測定: 患者血清、組織、および細胞からTRIzol試薬 (Invitrogen, 15596018) で全RNAを抽出し、デオキシリボヌクレアーゼI (Sigma, D5025) で処理した。商業用m6A RNAメチル化定量キット (Abcam, ab185912) を用いて、450 nmの吸光度でm6A総量を測定した。
細胞株と培養: ゲフィチニブ感受性細胞株PC9 (RCB, RCB4455) および固有耐性細胞株NCI-H1975 (Procell) を使用した。ゲフィチニブ獲得耐性細胞株PC9/GRは、Yearthbio Technology Co., Ltd.で樹立された。PC9およびNCI-H1975細胞株はSTRジェノタイピングにより認証された。細胞はRPMI1640培地 (10% FBS、100 U/mLペニシリン・ストレプトマイシン含有) で、37℃、5% CO2条件下で培養した。PC9/GRおよびNCI-H1975細胞のゲフィチニブ耐性は、1 μmol/Lのゲフィチニブ (SelleckChem, ZD1839) で維持した。PC9のIC50は約0.0275 μmol/L、PC9/GRのIC50は約3.26 μmol/L、NCI-H1975のIC50は約5.38 μmol/Lであった。
遺伝子発現操作: FTOのノックダウン (KD) はsiRNA (siRNA-FTO-1396) およびshRNAレンチウイルス (PC9/GRおよびH1975細胞に安定発現) で実施した。YTHDF2のKDも同様に実施した。FTOの過剰発現はレンチウイルスベクターを用いて行った。
細胞機能アッセイ:
- 細胞生存率: Cell Counting Kit-8 (CCK-8; APExBio, K1018) を用いて、異なる濃度のゲフィチニブ処理後の細胞生存率を評価した。
- 細胞増殖: EdU取り込みアッセイ (Thermo Fisher Scientific, A10044) を用いて、EdU陽性細胞の割合を共焦点顕微鏡 (Nikon) で測定した。
- コロニー形成: ゲフィチニブ処理後、6ウェルプレートに細胞を播種し、12日後にクリスタルバイオレット染色を行い、コロニー数をImage Jでカウントした。
- アポトーシス: Annexin V-FITCアポトーシス検出キット (BD Biosciences, 556547) を用いて、フローサイトメトリーでアポトーシス細胞の割合を測定した。
定量的リアルタイムPCR (qRT-PCR) およびm6A特異的qPCR: 遺伝子の相対mRNAレベルはqRT-PCR (Roche Light Cycler 480) で測定し、β-アクチンを内部標準とした。m6A特異的qPCRは、ABCC10 exon1のm6A修飾量を定量するために実施し、HPRT1を内部標準とした。
ウェスタンブロット (WB): FTO、YTHDF2、ABCC10、ABCG2、TSG101、CD81、Bcl-2、Baxなどのタンパク質発現を検出した。β-アクチンをローディングコントロールとして使用した。
異種移植マウスモデル: 4週齢雄BALB/cヌードマウス (Shrek Jingda Experimental Animal Co., Ltd.) を使用し、動物実験は中央南大学湘雅第二病院動物実験委員会 (プロジェクト番号: 20190722) の承認を得て実施した。エクソソーム処理PC9細胞 (1×10^7個) をマウスの両側鼠径部に皮下注射した (n=7 mice/群)。1週間後からゲフィチニブ (30 mg/kg/日、腹腔内投与) を30日間投与し、腫瘍体積、腫瘍重量、Ki67陽性率を評価した。
統計解析: 全ての実験は3回独立して実施された。統計解析はGraphpad Prism 7.0ソフトウェア (Graphpad Prism, RRID:SCR_002798) を用いて行った。2群間の差はStudentのt検定で評価し、多重比較は一元配置分散分析 (ANOVA) を用いた。p < 0.05を有意差ありと判断した。データは平均 ± 標準偏差 (SD) で示される。