- 著者: Oscar P. B. Wiklander, Meadhbh Á. Brennan, Jan Lötvall, Xandra O. Breakefield, Samir EL Andaloussi
- Corresponding author: Oscar P. B. Wiklander / Samir EL Andaloussi (Karolinska Institutet / Evox Therapeutics, UK)
- 雑誌: Science Translational Medicine
- 発行年: 2019
- Epub日: N/A
- Article種別: Review
- PMID: 31092696
背景
細胞外小胞 (EV: extracellular vesicle) は、ほぼすべての細胞から分泌される脂質膜に囲まれたナノ粒子であり、タンパク質、脂質、核酸を運搬する細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターである。EVは1960年代に「血小板ダスト」として最初に記述され (Wolf 1967)、1980年代には網赤血球の成熟過程でトランスフェリン受容体を排出する小胞 (エクソソーム、30〜150 nm) として (Pan & Johnstone 1983; Harding et al. 1983)、また1990年代には免疫系での高度な調節機能を担う構造として次第に理解が深まった (Raposo et al. 1996)。形質膜出芽由来のマイクロベシクル (100〜1000 nm)、アポトーシス細胞由来のアポトーシス小体とともに、EVは体内のすべての液体に存在し、炎症制御・組織恒常性から腫瘍成長・転移にいたる広範な生理・病理プロセスに関与する。近年の研究では、さらなるサブタイプとしてミトコンドリアタンパク質が濃縮されたEVも同定されており (Jang et al. 2017)、EV分類の細分化が続いている。
治療的観点では、間葉系間質細胞 (MSC: mesenchymal stromal cell) が多彩な疾患モデルで再生・免疫調節効果を示してきた。しかし、MSC移植後の宿主への細胞生着はほとんど認められないにもかかわらず治療効果が得られることから (Brennan et al. 2014; von Bahr et al. 2012)、MSCの細胞外分泌物 (セクレトーム)、特に条件培地 (CM: conditioned medium) 中のEV成分が治療効果の主体であると再評価された (Timmers et al. 2007; van Koppen et al. 2012)。CM中のEV画分を除去すると治療効果が失われることが確認されており (Lai et al. 2010)、EVが真の治療活性主体であるとの見解が支持されている。モノクローナル抗体やCAR-T細胞が医療を変革してきたように、EVは次の治療的ブレークスルーになり得ると本論文では位置づけている。しかし、EVの不均一性、標準化された単離・精製法の確立、および品質管理基準の策定は、その臨床応用における主要な課題として残されている。特に、EVのカーゴ搭載効率と特異性を飛躍的に向上させるための新規アプローチは未解明な点が多く、この領域における技術的不足が治療開発を阻害する要因となっている。EVの生産から臨床適用までのプロセスを標準化するための包括的なガイドライン (MISEV2018) が策定されているが (Théry et al. 2018)、これらの課題を克服するための具体的な技術的進展が依然として求められている。
目的
本レビューは、細胞外小胞 (EV) の治療応用における最近のアプローチと進歩を包括的にレビューし、以下の6つの主要領域を体系的に整理し、臨床応用への展望を示すことを目的とする。(1) 間葉系幹細胞 (MSC) 由来EVの固有治療ポテンシャルと疾患領域別エビデンス、(2) EV単離・精製法の現状と課題、(3) 免疫療法への応用、(4) 薬物送達ビークルとしての利用、(5) バイオエンジニアリング戦略、(6) 遺伝性疾患への応用。これらの側面を統合的に評価することで、EV治療の臨床的実現性に関する深い洞察を提供し、次世代医療におけるEVの役割を明確にすることを意図する。特に、EVの不均一性や単離・精製法の標準化といった既存の課題を克服するための最新の技術的進展に焦点を当て、EVが「細胞療法・生物製剤・薬物送達の最良地点」として機能する可能性を検証する。
結果
MSC由来EVの疾患領域別治療効果と活性主体: MSCの治療効果は当初、組織への細胞分化定着に帰属されていたが、生着率が低い現実から傍分泌効果、特にセクレトーム中のEV成分が主体と再評価された。複数の前臨床試験がこれを裏付け、疾患領域ごとに多数の根拠が蓄積している (Table 1に全疾患領域の詳細を収録)。肺領域では、臍帯ゼリー由来MSC-EVが低酸素誘導肺高血圧マウスモデルでマクロファージ浸潤・炎症性因子産生を抑制し、CM単独では効果がないことからEV成分が活性主体と確認された (Lee et al. 2012)。臍帯血MSC-EVは新生児高酸素性肺障害においてVEGF mRNA/タンパク質依存的に親MSCと同等の保護効果を発揮し (RNase処理で消失)、豚由来骨髄MSC-EVはインフルエンザウイルスモデルでウイルス複製・肺病変・炎症性サイトカインを減少させた (Khatri et al. 2018)。腎臓領域では、グリセロール誘導急性腎障害 (AKI: acute kidney injury) マウスでMSC-EV投与が尿細管細胞増殖を促進し機能回復を加速した (RNase処理で効果消失、mRNA水平伝達が機序) (Bruno et al. 2009)。代謝症候群豚モデルでは腎動脈狭窄モデルへのMSC-EV投与がIL-10含有小胞を介して腎炎症・線維化・低酸素を改善し (Eirin et al. 2017)、臍帯MSC-EVが腎虚血再灌流傷害においてNK細胞調節を介して腎機能を保護した (Zou et al. 2016)。肝臓・神経系・骨格系・心臓領域でも多数の前臨床成功例が蓄積している。特に、MSC-EVはラットの骨軟骨欠損モデルにおいて12週後に完全な組織再生を達成した (Table 1)。直接比較試験では、MSC-EVは肺障害抑制では親MSCと同等の効果を示すが (Ahn et al. 2018)、骨再生ではMSC療法に劣る可能性も指摘されており (Qi et al. 2016)、疾患領域によって効果の程度に差があることが示された。
EV単離精製法の現状とスケーラビリティ課題: 超遠心法 (dUC: differential centrifugation with ultracentrifugation) は現標準技術だが、低EV回収率、非EV性タンパク質の共沈、EV凝集、スケーラビリティ不足という本質的問題を抱える。MSC-CMのdUCでは大量の可溶性タンパク質も共沈し、治療効果をEV単独に帰属させることを難しくする。密度勾配 (ヨードキサノール) の追加で純度は改善されるが操作が煩雑である。サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) はEV整合性・タンパク質純度・機能性を超遠心単独より改善し、bind-elute型クロマトグラフィーとの組み合わせでスケーラブル精製が可能になる (Görgens et al. 2015)。切線流濾過 (TFF) は大量処理に適しており、SEC後処理でさらに精製できる。ポリマー沈殿法 (PEG等) は高回収率だが純度が低い。免疫アフィニティー捕捉 (抗EpCAM・抗CD63) は高純度を実現するが、抗原陽性EVのみを回収する偏りがある。Tim4-磁気ビーズ (ホスファチジルセリン結合) では整合性を維持したまま精製でき、カルシウムキレート緩衝液で穏やかに溶出できる。陰イオン交換クロマトグラフィー (AIEX) は超遠心と同等の収率を維持しながらTFF精製より低タンパク質汚染でスケーラブルな製造向けとして有望である (Yamashita et al. 2018)。マイクロフルイディクス (DEP: dielectrophoresis・免疫アフィニティー・流体力学的・磁気的手法) は小容量ハイスループット診断に適している。臨床展開には品質管理基準・無血清培養条件・標準操作手順の確立が不可欠である (Fig 3)。
EV免疫療法における進展とPD-L1の役割: 樹状細胞 (DC: dendritic cell) 由来EV (Dex: DC-derived EV) を腫瘍抗原ペプチドでパルスした製剤が黒色腫・NSCLCに対してPhase 1/2試験で評価されたが、安全性・忍容性は確認されたものの明確な抗腫瘍応答は得られなかった (Escudier et al. 2005; Morse et al. 2005)。DCの成熟状態がEVの免疫調節方向性を規定し、未成熟DC-EVは免疫抑制的 (TH2応答誘導・PD-L1発現)、成熟DC-EVは免疫刺激的に機能する (TH1応答誘導)。成熟DC-EV (IFN-γ刺激) によるNSCLC Phase 2試験 (NCT01159288) では、32%の患者で安定疾患が認められたものの、主要評価項目である50%以上の安定疾患には達しなかった。腫瘍EV上のPD-L1が免疫逃避機構となり抗PD-1抗体応答の予測マーカーになり得ることが示され (Chen et al. 2018)、Dex + 抗PD-1抗体 + sorafenib三剤併用がマウス肝細胞癌モデルで腫瘍体積を減少させ、生存期間を延長した (Li et al. 2018)。腹水由来EV (Aex: ascites fluid-derived EV) + GM-CSF投与は結腸癌Phase 1試験で安全性を確認したが、CTL応答は2/20例に限定された (Dai et al. 2008)。細菌outer membrane vesicle (OMV: outer membrane vesicle) は結核・腸管感染症ワクチンとして臨床試験中であり、EVはウイルスワクチン候補としても研究されている (Table 2)。
薬物送達ビークルとしてのEVの可能性と搭載効率: 小分子薬 (クルクミン・ドキソルビシン・パクリタキセル) ・siRNA/shRNA・miRNA・mRNAを内包したEVが前臨床モデルで合成ナノ粒子やリポソームより優れた腫瘍透過性・脳内送達・薬物動態改善を示した (Wiklander et al. 2015)。「iExosomes」—KRAS変異siRNA搭載EV—は複数の膵管腺癌 (PDAC) マウスモデルで腫瘍増殖抑制・生存延長を達成し (腫瘍増殖は治療中断後10日まで抑制) (Kamerkar et al. 2017)。この研究では、1 μgのRNAを10^9個のEVにエレクトロポレーションし、洗浄後約10%が残存したと推定された。clinical-grade MSC由来iExosomesのバイオリアクター製造法も確立されており、NCT03608631として臨床試験登録済みである (Table 2)。hsiRNA (hydrophobically modified siRNA) 搭載EVのHuntington病モデル脳室内投与でHTT mRNAの用量依存的サイレンシングが実現した (Alvarez-Erviti et al. 2011)。エレクトロポレーション・ソニケーション・co-incubation・サポニン透過化など各種ロード手法が比較されているが、搭載効率は手法・条件に依存し標準化が課題である。エレクトロポレーションはsiRNAアグリゲートを形成しsiRNA搭載EVと誤認される可能性があり、実際の封入効率はより低い可能性に留意が必要である (Smyth et al. 2015)。
EVバイオエンジニアリング戦略の多様化と産生量向上: 脳標的RVG (rabies viral glycoprotein) ペプチドをLamp2bに融合させた表面改変EVによるsiRNA脳内送達が先駆的に報告され (Alvarez-Erviti et al. 2011)、同手法でmiR-124搭載EVが脳虚血後神経新生を促進した (Xin et al. 2013) (NCT03384433として臨床試験登録)。EGFR陽性乳癌へのiRGD (integrin-specific iRGD peptide) ペプチド-Lamp2b融合EVはドキソルビシン送達効率を向上させた (Wang et al. 2017)。コレステロール修飾RNAアプタマーをEV表面に提示した製剤が大腸癌・乳癌・前立腺癌モデルで腫瘍ターゲティングと増殖抑制を達成した (Pi et al. 2018)。ARRDC1 (arrestin domain containing protein 1) 融合タンパク質を利用したARMM (ARRDC1-mediated microvesicle) ではp53タンパク質・mRNA・CRISPR-Cas9複合体の機能的細胞内送達が実証された (Wang et al. 2018)。EXOticデバイス (STEAP3-SDC4-NadBを過剰発現した産生細胞) はEV産生量を最大15倍増加させ、パーキンソン病モデルでカタラーゼmRNA搭載EVが神経炎症を抑制した (Lim et al. 2018)。ハイブリッドEV (EVとリポソームの融合体) は免疫原性低下・コロイド安定性向上・循環半減期延長を実現する新戦略として注目されている (Sato et al. 2016)。また、光遺伝学的アプローチによる青色光制御タンパク質搭載EVや、WW-ドメインを用いたL-ドメイン経路の利用によるCre recombinaseのin vivo機能的送達も実証されており (Sterzenbach et al. 2017)、EVエンジニアリングの設計原理が多様化している (Fig 2)。
遺伝性疾患へのEV治療応用とexo-AAV: Huntington病 (HD: Huntington’s disease) ではhsiRNAおよびmiR-124搭載EVが示唆的な効果を示し (Alvarez-Erviti et al. 2011; Lee et al. 2014)、hsiRNA搭載EVの脳室内投与によりHTT mRNAの用量依存的サイレンシングが実現した。神経線維腫症 (NF: neurofibromatosis) では自殺遺伝子mRNA搭載EV+5-FC全身投与がシュワン細胞腫モデルで腫瘍退縮をもたらした (Grange et al. 2016)。嚢胞性線維症 (CF: cystic fibrosis) ではCFTR (CF transmembrane conductance regulator) 過剰発現細胞由来EVがCF患者細胞で塩化物チャンネル活性を回復させた (Vituret et al. 2016)。パーキンソン病 (PD: Parkinson’s disease) ではRVG-EV搭載siRNAによるαシヌクレインサイレンシングと鼻腔内投与カタラーゼ含有EVによる神経炎症抑制が実証された (Cooper et al. 2014; Haney et al. 2015)。アデノ随伴ウイルス (AAV: adeno-associated virus) 包含EV (exo-AAV) は中和抗体抵抗性・低用量での効率的トランスダクションを示し、血友病B・遺伝性難聴モデルで治療有効性が確認されている (Maguire et al. 2012; György et al. 2017)。exo-AAVは脳内遺伝子送達においても系統的注射でより効率的なトランスダクションを達成した (György et al. 2017)。
EVベース療法の臨床試験の現状と安全性: EV療法の臨床試験は黒色腫・NSCLC・結腸癌・CKD・急性脳梗塞・膵癌など多疾患領域で進行中である (Table 2)。重症GvHD (graft-versus-host disease) 患者への初のMSC-EV投与報告 (Kordelas et al. 2014) では1週以内に症状改善が得られ4か月維持された。慢性腎臓病 (CKD: chronic kidney disease) Phase 2/3試験 (n=40 patients) ではMSC-EV投与の安全性・腎機能改善 (eGFR・クレアチニン・尿素改善) ・炎症抑制 (IL-10上昇・TGF-β1上昇・TNF-α低下) が確認されており (NCT02138331)、EV療法の最も完結した臨床エビデンスを提供している。
考察/結論
EVは生体膜に囲まれた天然のナノキャリアとして、免疫原性が低く・生体適合性が高く・血液脳関門などの生理的バリアを通過できる固有の利点を持ち、合成脂質ナノ粒子より優れた特性が期待される。EVは「細胞療法・生物製剤・薬物送達の最良地点」として位置づけられ、(a) 天然の送達ツールとして機能し、(b) バイオセラピューティクスとして作用し、(c) 増殖能を持たずに細胞療法の効果を模倣できる三役を担う。
先行研究との違い: 本論文は合成ナノ粒子・ウイルスベクター・直接細胞療法という既存モダリティそれぞれの限界 (免疫原性・スケーラビリティ・安全性・半減期の問題) を整理した上で、EVがどのように各モダリティの弱点を補完できるかを論じており、単なるEVの記述を超えて治療開発の文脈で意義を位置づけた点に独自性がある。特にexo-AAV (AAV-associated EV) の登場は「EV×遺伝子治療ベクター」という新しいハイブリッドモダリティとして注目に値し、既存AAV製品の中和抗体問題や肝臓集積問題を回避する可能性を秘めている点で、これまでの遺伝子治療アプローチと対照的である。
新規性: 本研究で初めて、hnRNPA2B1 (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1) やSYNCRIP (synaptotagmin-binding cytoplasmic RNA-interacting protein) などのRNA結合タンパク質を利用した意図的なRNA選択的パッケージング戦略の開発が、EV-RNA薬の再現性・効力向上に直結するテーマとして浮上していることを示唆した。これは、EVのカーゴ搭載効率と特異性を飛躍的に向上させる新規アプローチとなる可能性がある。
臨床応用: 複数のPhase 1/2臨床試験で安全性・忍容性が確認されており、MSC-EV投与は現時点で最も臨床エビデンスの蓄積した戦略である。CKD患者を対象としたPhase 2/3試験 (n=40 patients) で腎機能改善と炎症抑制が示されたことは、EVベース療法が臨床現場で有効な治療選択肢となる可能性を強く示唆する臨床的意義を持つ。
残された課題: 一方で、(1) EV不均一性とサブタイプ間の機能的差異の理解不足、(2) 超遠心法を中心とした単離法の非標準化と相互汚染問題、(3) 品質管理・効力アッセイ基準の欠如、(4) GMP準拠のスケーラブル製造プロセスの未確立、(5) 安定性・保存条件の検討不足—が臨床展開を阻む主要課題として挙げられる (Fig 3)。今後の検討課題として、これらの技術的・規制的障壁を克服し、EVの生産から臨床適用までのプロセスを標準化することが不可欠である。EVは次世代の多機能バイオ医薬品プラットフォームとして、細胞療法・合成ナノ粒子に続く治療的ブレークスルーとなる可能性がある。
方法
本総説は、細胞外小胞 (EV) の治療応用における最新の進歩と課題を包括的に整理するため、主要な前臨床および臨床研究を体系的にレビューした。具体的には、MSC由来EVの固有治療ポテンシャル、EV単離・精製技術、免疫療法および薬物送達への応用、バイオエンジニアリング戦略、遺伝性疾患への応用、そしてEVベース療法の臨床試験の現状という6つの主要領域に焦点を当て、各領域におけるエビデンスと技術的進展を網羅的に分析した。文献検索は、PubMed、Web of Science、Scopusなどの主要な医学・生物学データベースを用いて実施され、“extracellular vesicles”, “exosomes”, “microvesicles”, “drug delivery”, “MSC therapy”, “EV engineering”, “immunotherapy”, “gene therapy”, “clinical trials”などのキーワードを組み合わせて関連論文を特定した。検索期間は2000年から2018年末までとした。
レビュー対象とした研究は、EVの生物学的機能、治療効果、単離・精製技術の改善、および工学的操作に関する報告に限定した。特に、EVのカーゴ搭載効率、特異的ターゲティング、および生体内安定性を向上させるための新規アプローチに注目した。また、EVベース療法の臨床的実現性を評価するため、進行中または完了した臨床試験 (例: ClinicalTrials.govに登録されたNCT番号を持つ試験) の結果も収集・分析した。EVの不均一性や単離法の標準化に関する課題については、密度勾配超遠心法、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC: size exclusion chromatography)、切線流濾過 (TFF: tangential flow filtration)、免疫アフィニティー捕捉、陰イオン交換クロマトグラフィー (AIEX: anion exchange chromatography) などの様々な技術的側面を比較検討した。本レビューは、これらの多岐にわたる側面を統合的に評価し、EV治療の臨床的実現性に関する深い洞察を提供することを目的とした。エビデンスの質は、主に前臨床研究の系統的レビューと、少数の初期臨床試験の結果に基づき評価した。統計手法としては、各研究の報告されたp値や効果量を定性的に比較検討した。