- 著者: Dong Guo, Ying Meng, Qingqing Yang, Shudi Luo, Xiaoming Jiang, Yanhua Zheng, Lihui Wu, et al., Jun Xu, Ying Yuan, Zhimin Lu
- Corresponding author: Dong Guo, Ying Yuan, Zhimin Lu (Zhejiang University School of Medicine)
- 雑誌: Immunity
- 発行年: 2026
- Epub日: 2026-07-14
- Article種別: Original Article
- DOI: 10.1016/j.immuni.2026.06.004
背景
腫瘍細胞は豊富な細胞質二本鎖DNAを保有し、cGAS (cyclic GMP-AMP synthase) がこれを検知してcGAMP (cyclic GMP-AMP) を合成する。cGAMPは小胞体膜上の二量体膜貫通タンパク質STING (stimulator of interferon genes) に結合して立体構造変化を誘起し、TBK1 (TANK-binding kinase 1) →IRF3 (interferon regulatory factor 3) リン酸化→I型インターフェロン産生というシグナルカスケードを活性化する。この cGAS-STING 経路は腫瘍免疫監視の中核をなすが、STING アゴニストの臨床試験では明確な有効性が示されておらず、腫瘍細胞が何らかの機構でSTINGシグナルを回避していることが示唆されていた (Kwon & Bakhoum 2020; Chin et al. 2022)。
がんのもう一つの hallmark であるワールブルク効果 (有酸素解糖) では、ピルビン酸が好気的なミトコンドリア酸化ではなく乳酸に変換され、腫瘍微小環境に大量の乳酸が蓄積する。先行研究では、ヘキソキナーゼ2 (HK2) 依存的なIκBαリン酸化→NF-κB活性化→PD-L1発現上昇を介して乳酸が適応免疫逃避を促進することが示された (Guo et al. CellMetab 2022)。しかし、乳酸が自然免疫経路 (cGAS-STING) に直接作用するか否かはこれまで不明であった。また、EGFR (epidermal growth factor receptor) 活性化後にPKM2 (pyruvate kinase M2) がLDHA (lactate dehydrogenase A) をどのようにリン酸化・活性化するかという経路も未解明であり、代謝と自然免疫の統合制御機構に大きな空白が存在していた。
目的
有酸素解糖および乳酸産生がcGAS-STING自然免疫シグナルを調節するかどうかを検討し、その分子機構として EGFR-PKM2-LDHA-乳酸-STING 経路を同定・検証すること。さらに、PKM2 阻害による乳酸依存性 STING 抑制の解除が抗 PD-1 療法との相乗効果をもたらすか評価することを目的とした。
結果
高グルコース・乳酸による STING 活性化抑制：
ヒト GBM (膠芽腫, glioblastoma multiforme) 細胞 (U251、LN229) およびマウス CT2A 細胞、Huh7 HCC (hepatocellular carcinoma, 肝細胞癌) 細胞に HT-DNA (herring testis DNA) または cGAMP を投与して cGAS-STING を活性化したところ、グルコース濃度依存的に TBK1 S172、STING S366 (マウス S365)、IRF3 S396 のリン酸化が著明に減少した (n=3 independent experiments, Fig. 1A, 1B)。乳酸 (20 mM) 処置も同様に cGAMP 誘導性 STING 活性化を抑制した (n=3, Fig. 1C, 1D)。免疫蛍光解析では、高グルコースまたは乳酸処置により cGAMP 誘導性 IRF3 核移行が有意に阻害された (p < 0.0001, Fig. 1E)。定量 RT-PCR では IFNB1 mRNA および IFNβタンパク質の発現が著明に低下した (平均 ± SD、n=3 independent experiments, p < 0.0001, Fig. 1F)。乳酸輸送体 MCT1 (monocarboxylate transporter 1) の阻害薬 MCT1-IN-2 を用いると、細胞外乳酸による STING 抑制が軽減され、乳酸の細胞内取り込みが必要であることが示された。また、LDHA 枯渇 (shRNA) または LDHA 阻害薬 GSK2837808A 投与により、基底状態および cGAMP/HT-DNA 誘導性の TBK1-STING-IRF3 リン酸化が著明に増強された (n=3, Fig. 1G)。
乳酸による STING への直接結合と cGAMP 競合：
乳酸が直接 STING に結合するかどうかを検証するため、ビオチン化乳酸 (biotin-lactate) を用いたストレプトアビジンプルダウン実験を行ったところ、U251 および LN229 細胞の細胞溶解液中および精製 STING CBD (cyclic dinucleotide-binding domain) タンパク質に対してビオチン乳酸が結合し、遊離乳酸 (20 mM) の添加でこの結合が解消された (n=3, Fig. 2C)。タンパク質熱シフトアッセイでは、乳酸 (1 mM) および cGAMP (10 μM) は STING を安定化したがピルビン酸は安定化しなかった (Fig. 2D)。SPR (surface plasmon resonance) アッセイでは、精製 STING CBD タンパク質への乳酸結合親和性は KD ≈ 32.7 μM であり (Fig. 2E)、cGAMP の KD ≈ 7.2 nM と比較して約 4,500 倍低親和性であった。高グルコース条件の GBM 細胞内乳酸濃度は約 2.0-2.75 mM であり KD を大きく超えているため、生理的条件で STING 抑制が成立することが示された。乳酸はピルビン酸とは異なり、用量依存的に精製 His-STING CBD の biotin-cGAMP への結合を阻害した (fold 0.7-0.4 vs 1.0, Fig. 2F)。分子ドッキング解析では、乳酸は STING の Y163、Y167、E260、T263 残基と相互作用する可能性が示された。T263/E260A 二重変異体は乳酸結合能と cGAMP 結合能を共に失い (n=3, Fig. 2I, 2J)、乳酸と cGAMP が STING の同一 CBD 領域を競合的に占有することが確認された。また、乳酸は cGAMP 結合部位ではない膜貫通ドメインに結合するアゴニスト (compound 53) 誘導性 STING 活性化を阻害しなかった (Fig. S2K)。
EGFR 活性化→PKM2-LDHA 複合体形成→LDHA S161 リン酸化→乳酸産生増加：
GBM 細胞の EGFR は約 60% の原発 GBM で過剰発現・変異している。EGF (epidermal growth factor, 100 ng/mL) 処置により U251 および CT2A 細胞で PKM2 と LDHA の免疫沈降による会合が経時的に増加した (n=3, EGF 2h で fold 1.9-3.9、Fig. 3B)。免疫蛍光解析では EGF 処置で HA-LDHA-GFP と FLAG-PKM2-GFP の共局在が有意に増加した (n=10 cells/group, p < 0.0001, Fig. 3C)。PKM2 の exon 10 特異的残基変異解析 (n=8 mutants) により、K433 が LDHA との結合に不可欠であることが判明した (K433E 変異で結合消失, Fig. 3D)。in vitro リン酸化アッセイでは、GST-PKM2 が His-LDHA を S161 でリン酸化したが、PKM1 (pyruvate kinase M1) や PKM2 K367M (kinase-dead 変異体) はリン酸化しなかった (n=3, Fig. 3E)。細胞実験では EGF 処置により WT FLAG-LDHA の S161 リン酸化が約 4.5 倍増加したが (fold 4.5 vs 1.0)、LDHA S161A 変異体では変化なかった (n=3, Fig. 3G)。
LDHA S161 リン酸化→NADH 結合能増強→LDHA 酵素活性・乳酸産生増加：
PKM2 存在下で WT His-LDHA は LDHA S161A と比較して LDHA 酵素活性が著明に増加し (n=3 independent experiments, mean ± SD, p < 0.001)、EGF 処置では WT FLAG-LDHA 活性が有意に増加したが S161A では変化なかった (n=3, p < 0.01)。リン酸化模倣変異体 LDHA S161D は EGF 非存在下でも高活性を示した (Fig. 4A, 4B)。対応して、EGF 処置では WT LDHA で乳酸産生が有意に増加したが S161A では不変、S161D では EGF 非存在でも高産生を示した (n=3, mean ± SD, p < 0.0001, Fig. 4C)。Cibacron Blue 3GA プルダウン (NADH 結合模倣) アッセイでは、PKM2 存在下の WT LDHA は LDHA S161A に比べて約 5.5 倍高い結合を示した (n=3, fold 5.44 vs 0.95, Fig. 4D)。EGF 処置でも WT FLAG-LDHA の NADH 結合が約 5.4 倍増加したが S161A では不変であった (fold 5.39 vs 1.02, Fig. 4E)。SPR 解析では NADH の S161D-LDHA への結合親和性 (KD = 0.75 μM) は WT-LDHA (KD = 6.05 μM) より約 8 倍高かった (Fig. 4F)。分子動力学 (MD) シミュレーションでは、S161 リン酸化 LDHA-NADH 複合体の結合自由エネルギー (ΔGbinding = -110.85 ± 6.18 kcal/mol) は非リン酸化体 (-55.35 ± 3.26 kcal/mol) より安定であり、水素結合数も 7-10 本 vs 約 3 本と多かった (Fig. 4H, 4I)。U251 細胞での再構成実験では、rLDHA S161A 発現が EGF 誘導性 STING 抑制を解除し TBK1 pS172・STING pS366・IRF3 pS396 が有意に増強、S161D 発現で逆に抑制が増強された (n=3, p < 0.0001, Fig. 4J, 4K)。
乳酸依存性 STING 抑制による腫瘍免疫逃避・腫瘍進展の促進 (in vivo)：
LDHA 枯渇 CT2A 細胞を免疫不全マウスと免疫正常 C57BL/6 マウスに皮下注射すると、いずれのモデルでも腫瘍増殖抑制を示したが、免疫正常マウスでの抑制効果がより顕著であった (各 n=5、p < 0.0001、Fig. 5A, 5B)。フローサイトメトリー解析では、LDHA 枯渇腫瘍で CD3+、CD4+、CD8+ T 細胞浸潤が有意に増加し、活性化 CD8+ T 細胞が増加、M2型マクロファージが減少した (各 n=5, p < 0.001-0.0001、Fig. 5C)。CD8+ T 細胞の枯渇実験により、この免疫依存性腫瘍抑制効果が CD8+ T 細胞に依存することが確認された。頭蓋内注射モデルでは EGFRvIII 発現 CT2A 細胞が腫瘍を著明に増大させ (各 n=6, p < 0.0001)、生存期間を著明に短縮した (n=9, p < 0.0001, Fig. 5E, 5F)。この効果は LDHA S161A 発現により打消され、S161D 発現でさらに増強された。PKM2 阻害剤 PKM2-IN-1 はこれらのマウスの腫瘍増殖を抑制し、抗 PD-1 抗体との併用で相加的な腫瘍増殖抑制・生存延長効果を示した (p < 0.001-0.0001、Fig. 5J, 5K)。
ヒト GBM 臨床検体での検証：
60 例のヒト GBM 組織の IHC 解析では、LDHA pS161 レベルと TBK1 pS172 の間に有意な逆相関が認められた (r = -0.4803、p = 0.0001)。LDHA pS161 と IRF3 pS396 の逆相関も有意であった (r = -0.5078、p < 0.0001)。さらに LDHA pS161 高発現群 (n=30) は低発現群 (n=30) に比べて有意に不良な生存を示した (p = 0.0009、Kaplan-Meier log-rank test、Fig. 6D)。CD8+ T 細胞浸潤も LDHA pS161 と逆相関した (r = -0.4138、p = 0.0010、Fig. 6C)。
考察/結論
① 先行研究との違い：先行研究では、乳酸が cGAS をラクチル化して cGAS の DNA 感知を抑制すること (AARS1/AARS2 依存性ラクチル化、K131/156) が示されていた。本研究はこれと異なり、乳酸が cGAS ではなく STING の cGAMP 結合ドメインに直接結合し、cGAMP と競合して STING の oligomerization および下流シグナルを阻害するという全く独立した機構を提示する。また Guo et al. CellMetab 2022 の HK2-IκBα-PD-L1 経路が適応免疫制御を介した免疫逃避を担うのとは対照的に、本研究は自然免疫シグナル (STING-IRF3) の乳酸依存性直接抑制という新規な接続点を明らかにした。
② 新規性：本研究で初めて、生理的濃度の乳酸 (細胞内 2.0-2.75 mM) が STING CBD (KD ≈ 32.7 μM) に直接かつ競合的に結合して cGAMP 依存性 STING 活性化を阻害することを biochemical、structural、in vivo の複数手法で実証した。また EGFR 活性化→PKM2 (K433 via exon10)→LDHA S161 リン酸化→NADH 結合増強 (KD 6.05 → 0.75 μM) という腫瘍特異的な乳酸産生増強軸も新規に同定した。腫瘍細胞がワールブルク効果を介して自然免疫センサーを乳酸で直接「毒す」メカニズムはこれまでにない知見である。腫瘍微小環境での免疫抑制についての従来の理解 (TME における代謝競合) を超えた、乳酸の直接的な innate immune checkpoint としての役割が確立された。
③ 臨床応用：PKM2 阻害剤 (PKM2-IN-1) と抗 PD-1 抗体の組み合わせが GBM マウスモデルで相加的な腫瘍増殖抑制・CD8+ T 細胞浸潤増加・生存延長を示した点は、臨床的意義が高い。EGFR 過剰発現/変異 (~60% GBM) と LDHA pS161 高発現が生存不良と相関する臨床データ (n=60) は、LDHA pS161 が GBM の予後バイオマーカーとなる可能性を示す。PKM2-LDHA 軸の阻害は LDHA 直接阻害よりも正常細胞への副作用が少なく、より選択的な臨床応用の可能性がある。腫瘍免疫微小環境分類において「cold tumor」とされる GBM を「hot」に転換する metabolic reprogramming 戦略として、PKM2 阻害は有望な標的となりうる。
④ 残された課題：乳酸-STING 結合の共結晶構造解析が未実施であり、T263/E260 残基との相互作用の正確な空間配置の検証が今後の課題である。EGF 刺激による PKM2-LDHA 会合を制御する上流シグナル事象の同定も必要である。また本研究は主に GBM モデルで行われており、他のがん種における乳酸-STING 軸の普遍性および PKM2 阻害+免疫チェックポイント阻害の臨床試験での有効性の検証が今後の研究の方向性として残されている。LDHA 阻害が正常組織に与える影響についても慎重な評価が必要であり、limitation として認識される。
方法
GBM 細胞株 (U251、LN229)、マウス GBM 細胞 (CT2A)、HCC 細胞 (Huh7)、THP-1、HEK-293T を使用した。EGF 100 ng/mL でEGFR を活性化し、HT-DNA (1 μg/mL) または cGAMP (100 nM) で cGAS-STING を活性化した。細胞内乳酸・cGAMP 濃度の測定、免疫沈降、免疫ブロット、免疫蛍光、qRT-PCR を施行。乳酸-STING 結合解析には biotin-lactate プルダウン、タンパク質熱シフトアッセイ、SPR アッセイ (purified His-STING-CBD)、分子ドッキング、および共免疫沈降を実施。LDHA酵素活性は in vitro キナーゼアッセイ後に測定し、NADH 結合は Cibacron Blue 3GA プルダウンおよび SPR で定量。In vivo 実験では CT2A 細胞を C57BL/6 マウス (皮下注射: n=5/群) または頭蓋内注射 (腫瘍体積: n=6/群、生存: n=9/群) で評価。腫瘍浸潤免疫細胞はフローサイトメトリーで解析。ヒト GBM 組織 60 例の IHC を施行し、Pearson 相関、Kaplan-Meier 生存分析 (log-rank test) を適用した。分子動力学シミュレーションは MM-PBSA 法で ΔG を算出した。統計は Student’s t-test、一元配置分散分析 (one-way ANOVA) を使用。試験登録番号は記載なし (基礎研究)。