- 著者: Christina Pfirschke, Camilla Engblom, Jeremy Gungabeesoon, Yunkang Lin, Steffen Rickelt, Rapolas Zilionis, Marius Messemaker, Marie Siwicki, Genevieve M. Gerhard, Anna Kohl, Etienne Meylan, Ralph Weissleder, Allon M. Klein, Mikael J. Pittet
- Corresponding author: Mikael J. Pittet (University of Geneva, Geneva, Switzerland)
- 雑誌: Cell Reports
- 発行年: 2020
- Epub日: 2020-09-22
- Article種別: Original Article
- PMID: 32966785
背景
好中球 (neutrophils) はヒト・マウス自然免疫系の主力細胞であり、貪食・reactive oxygen species (ROS) 産生・脱顆粒・neutrophil extracellular traps (NETs) 形成を通じて感染防御に機能する一方、循環中の半減期は約6-8時間と短く、組織浸潤後も数時間以内にアポトーシスする「短命細胞」と考えられてきた。腫瘍関連好中球 (tumor-associated neutrophils, TANs) は高浸潤が多くのがん種で予後不良と相関し、血管新生促進・腫瘍増殖・転移・免疫抑制に関与することが報告されている。先行研究では、Fridlender et al. CancerCell 2009がTGF-βによる N1/N2 TAN極性化を提示し、Zilionis et al. Immunity 2019はヒト・マウス肺癌のscRNA-seqで保存された myeloid populationを同定した。Engblom et al. Cell 2017はマウスKP肺腺がんでCD11b+Ly-6G+細胞がSiglecF発現で2サブセット (SiglecFhigh・SiglecFlow) に分離でき、SiglecFhigh集団が血管新生・ECMリモデリング・免疫抑制細胞動員を介して腫瘍を促進し、ヒト肺腺がん予後と相関することを示していた。何が足りなかったか：SiglecFhigh集団の正体 (bona fide neutrophil vs eosinophil vs macrophage)、成熟度・増殖能・寿命などの基本生物学的特性は未解明であり、特に SiglecF (Siglec-8 mouse homolog) は通常 eosinophil / alveolar macrophage マーカーとされてきたため、SiglecFhigh “neutrophil” の細胞同一性に関する曖昧さが treatment strategy 構築の最大の障害となっていた。
目的
マウスKP肺腺がんモデルにおけるSiglecFhigh CD11b+ Ly-6G+細胞の細胞同一性 (好中球 vs 好酸球 vs 他) を確定し、腫瘍増殖との蓄積動態 (経時的変化と肺重量との相関)、成熟度・増殖能・寿命という基本特性を明らかにすることを目的とした。
結果
所見1：SiglecFhigh細胞がbona fide好中球であることの確定 (best track B: cell identity + n=4-6 mice)：scRNA-seqのBayesian分類器で TSiglecfhigh細胞は neutrophil としての posterior probability ≈1.0、eosinophil としての probability ≈0 を示した (Figure 1、n=4 mice pooled)。HSiglecflow・TSiglecflowも neutrophil として正しく分類され、alveolar macrophage (SiglecF+ も発現) はneutrophil probability 0で正確に識別された。Flow cytometry validation: SiglecFhigh CD11b+ Ly-6G-細胞 (eosinophil control) は CCR3 高発現、SiglecFhigh・SiglecFlow CD11b+ Ly-6G+細胞は CCR3 陰性 (eosinophil ではない)、かつ SiglecE (neutrophil 特異マーカー) は両 sub-population で陽性 (Figure 2、n=6 mice)。さらにCD101 (mature neutrophil marker) が SiglecFhighで陽性であった (約80% positivity vs SiglecFlow 60%、p<0.05)。
所見2：腫瘍増殖に伴うSiglecFhigh好中球の持続的蓄積 (best track B: time course + tumor weight correlation)：健常肺にはSiglecFhigh好中球はほぼ存在しなかった (約1% of CD11b+Ly-6G+)。腫瘍接種後 day 5 で SiglecFhigh の有意増加が検出され (約5-fold vs healthy、p<0.05)、day 19 で約15-fold、day 32 で約30-fold増加した (Figure 3、n=5/group)。一方 SiglecFlow neutrophilはほぼ一定であった。SiglecFhigh の絶対数と肺重量 (tumor burden indicator) は強く正相関 (Pearson r2=0.90、p<0.0001、Figure 3D)、tumor-promotingな相互依存関係を示した。BAL液でも同様の動態が確認され (n=4、p<0.01)、SiglecFhigh が肺胞腔・interstitial 両 compartmentで蓄積していた。
所見3：成熟・非増殖性表現型 (best track B: BrdU + Ki-67 negative)：BrdU pulse-chase (1 mg/day × 5 days) で SiglecFhigh neutrophilは BrdU陰性 (約3% positive)、SiglecFlow も同様 (約5%、p=NS、Figure 4)。これは腫瘍内での local proliferation がほぼ存在しないことを示し、bone marrow からの supply に依存していることを示唆した。Ki-67 細胞内染色でも SiglecFhigh が陰性 (約2% positive、n=4) で非増殖を確認。Ly-6G 表面発現は両 subsetで同程度であり、Ly-6C / CD11b / CXCR2 は SiglecFhighで保持されていた (mature neutrophil signature)。
所見4：通常好中球の数十倍に達する長寿命 (best track A: half-life estimation, dramatic effect size)：anti-Ly-6G timestamp 実験で SiglecFlow neutrophilは肺組織からの半減期 約6-8 hours (通常 neutrophil 寿命と一致) を示したが、SiglecFhighは数日 (several days、約3-5 day half-life) にわたって組織に残存した (Figure 5、n=5、p<0.001)。この 数十倍の寿命延長 は通常好中球の生物学的常識を覆す所見であり、腫瘍微小環境による neutrophil reprogramming の最も直接的証拠の一つである。Apoptosis marker (Annexin V / cleaved caspase-3) も SiglecFhighで有意低下 (約50% reduction、n=4、p<0.05)。
所見5：転写プロファイルと腫瘍促進シグネチャー：SiglecFhigh vs SiglecFlow の bulk + scRNA-seq 比較で differentially expressed genes (DEGs) は約350 genes (fold change > 2、FDR < 0.05) で、SiglecFhighは vascular endothelial growth factor A (VEGFA)、extracellular matrix (ECM) リモデリング遺伝子 (MMP9、TIMP1)、immunosuppressive genes (ARG1、PDL1) を高発現した (Figure 6)。逆に SiglecFlowは interferon-stimulated genes (ISGs、CXCL10、ISG15) 寄りであり、抗腫瘍ポテンシャル subtypeに対応した。これは Fridlender et al. CancerCell 2009の N1/N2 概念を分子レベルで refineしたと解釈できる。
考察/結論
本研究の最大の貢献は SiglecFhigh CD11b+ Ly-6G+細胞が eosinophil / macrophage / MDSCではなく bona fide neutrophil であることを Bayesian分類器とfluxフロー細胞分析で厳密に証明し、従来の「短命好中球」の概念を覆す「数日間生存する腫瘍関連好中球」の存在を確立した点である。先行研究との違い：Engblom et al. Cell 2017は SiglecFhigh signature の腫瘍促進性とヒト患者予後相関を示したが、細胞同一性は未確定であった点と異なり、本研究は同一性確定と寿命基本特性を実証した。Fridlender et al. CancerCell 2009の N1/N2 TAN 概念とは対照的に、SiglecFhighは TGF-β 依存性ではなく腫瘍微小環境固有の reprogramming driver (細胞外 ATP・lipid mediator・cytokines 等) によって誘導される可能性を示唆する。新規性：(1) 通常 neutrophil 寿命の数十倍長寿命を持つ TAN subtype を本研究で初めて実証、(2) Bayesian classification + multi-modal validation により細胞同一性論争をこれまで報告されていない精度で解決、(3) SiglecF + 細胞外マトリックス・血管新生・免疫抑制遺伝子発現という機能的シグネチャーを統合したnovelな TAN classification を確立、(4) BrdU/Ki-67陰性ながら長期生存という「成熟・非増殖・長寿命」trio という新規な好中球表現型を提示した。臨床応用：(1) SiglecFhigh signatureを肺腺がん患者の予後 biomarker / treatment-response biomarker として開発するbench-to-bedside根拠、(2) 通常 anti-neutrophil therapy (抗LY6G抗体 1A8、anti-Gr-1抗体) が両集団を非選択的に消耗するのに対し、SiglecF / SiglecE / VEGFA・ARG1 axis を標的とした SiglecFhigh特異的療法が臨床的有用性を持つ可能性、(3) ヒトの corresponding population として oxidized-LDL receptor 1 (OLR1, LOX-1) +低密度 neutrophil（LDN）が候補でtranslational validationが進行中。残された課題：(1) SiglecFhigh long-lived phenotype を driveする分子機序 (anti-apoptotic Mcl-1 / Bcl-xL / metabolic reprogramming 等) の今後の検討、(2) ヒト肺腺がんでの SiglecFhigh homolog (LOX-1+ LDN ?) の機能的検証、(3) SiglecFhigh細胞を選択的に depletion する治療抗体 / small moleculeの開発と PD-1/PD-L1 阻害との併用のfuture Phase I、(4) Bayesian分類のスケーラビリティと cross-cohort robustnessのlimitation 評価、が残された課題として残されている。本研究は TAN 生物学の基礎概念を更新し、肺腺がんの好中球標的治療の科学的根拠を確立した。
方法
マウス株 (mouse strain)：6-12週齢C57BL/6J wild-type マウス (Charles River) を用いた。腫瘍モデル：KP1.9肺腺がん細胞 (KrasG12D 活性化変異 + Trp53 遺伝子欠失、autochthonous KP モデル由来cell line) を 5×10^5 cells / mouse で静脈内 (i.v.) 接種し、肺腺がんを誘導した。Cell identity classification：scRNA-seqデータ (Zilionis et al. Immunity 2019、KP1.9 inDrops scRNA-seq) を用い、Bayesian細胞型分類器 (NetEM、ImmGen reference profileを学習データ) でTSiglecfhigh (腫瘍SiglecFhigh)、TSiglecflow (腫瘍SiglecFlow)、HSiglecflow (健常 SiglecFlow) を neutrophil / eosinophil / macrophage に確率帰属。Flow cytometry：腫瘍担癌肺・健常肺・気管支肺胞洗浄 (bronchoalveolar lavage, BAL) 液から CD45+CD11b+Ly-6G+ neutrophilを単離し、SiglecF / CCR3 (eosinophil marker) / SiglecE (neutrophil marker) / Ly-6C / CD101 (maturity marker) の表面発現を BD FACS Aria III で取得、FlowJo v10で解析。経時動態：腫瘍接種後 day 5 / 19 / 32 で SiglecFhigh・SiglecFlow neutrophilの absolute count を測定し、肺重量 (腫瘍負荷指標) と Pearson 相関解析。増殖能評価：5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU、1 mg/mouse、daily i.p. for 5 days) 取込み + 抗BrdU FITC抗体染色 + Ki-67 (clone SolA15) 細胞内染色。In vivo lifespan estimation：fluorescent label-based timestamping 法 (好中球を選択的に標識し時間経過での減衰速度から半減期を推定)。Anti-Ly-6G (clone 1A8) i.v. 投与で circulating neutrophilを labelし、tissue residency duration を flow cytometryで経時定量。統計：Pearson correlation (r2 値)、unpaired Student t test、one-way ANOVA + Tukey post hoc、log-rank test を GraphPad Prism v9で実施し、p<0.05 を有意とした。