- 著者: Fang Chen, Shengli Zhou, Juke Ma, Hengmin Tao, Peihang Jing, Xuliang Liu, Zhong Shen, Zhichao Liu, Yumei Wei, Zhenghua Lv, Wei Xu
- Corresponding author: Wei Xu; Zhenghua Lv; Yumei Wei (Shandong Provincial ENT Hospital, Shandong University, China)
- 雑誌: Clinical Cancer Research
- 発行年: 2026
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- PMID: 41817286
背景
下咽頭扁平上皮癌 (HPSCC; Hypopharyngeal Squamous Cell Carcinoma) は頭頸部癌の中でも特に予後不良なサブタイプであり、解剖学的に隠れた位置に発生するため、診断時には局所進行例が多い。手術、放射線療法、化学療法の集学的治療にもかかわらず、HPSCCの生存率は他の頭頸部癌に比べて著しく低いことが報告されており (Soo et al. 2005)、この高リスク集団の予後改善に向けたより効果的な治療戦略の開発が喫緊の課題である。
ネオアジュバント化学免疫療法 (nCIT; neoadjuvant chemo-immunotherapy) は、局所進行HPSCCに対する有望な治療戦略として浮上している (Wu et al. 2024)。化学療法による腫瘍細胞死が腫瘍関連抗原を放出し免疫原性を高め、免疫チェックポイント阻害剤が抑制されたT細胞を活性化することで、強力な抗腫瘍免疫応答を相乗的に誘導するという理論的根拠がある (Sinicrope and Turk 2024)。術前期間に免疫療法を導入するこの戦略は、リンパ節やより強固な免疫システムを活用して微小転移を排除し、再発リスクを低減し、臓器温存の可能性を高めることを目指している (Wang et al. 2025)。抗PD-1抗体であるトリパリマブは、非小細胞肺癌、悪性黒色腫、鼻咽頭癌など様々な癌種で有効性と安全性が示されており (Zhang et al. 2021)、頭頸部扁平上皮癌 (HNSCC) におけるトリパリマブベースのネオアジュバントレジメンも有望な活性を示している (Huang et al. 2022)。しかし、HPSCCにおけるトリパリマブベースのネオアジュバント療法に関する専用データは不足しており、患者の応答は不均一であるという課題が残されている (Zhao et al. 2022)。
現在の標準的なバイオマーカーであるPD-L1 combined positive score (CPS) は、患者層別化において信頼性が低いことが示されており (Davis and Patel 2019)、本研究の第II相試験においても、PD-L1 CPSと病理学的奏効との間に有意な相関は認められず (p=0.313)、その予測精度は限定的であるという課題が確認された。腫瘍微小環境 (TME; tumor microenvironment) の免疫状態が治療応答の鍵となるというエビデンスが増加しているが (Binnewies et al. 2018)、前治療TMEの構成成分の中でどの細胞集団が応答を規定するかは未解明であった。特に、好中球はTMEにおいて最も豊富な細胞型の一つであり、その機能的可塑性を示すが (Giese et al. 2019)、特定の好中球サブセットがHPSCCの術前TMEにおける治療結果を決定する上で支配的な役割を果たすかどうかは、これまで報告されていない知識のギャップが残されている。
目的
本研究は、切除可能な局所進行HPSCC患者を対象とした前向き単施設単群第II相試験の枠組みで、ネオアジュバントトリパリマブ、アルブミン結合パクリタキセル、およびネダプラチン療法への応答を予測するTME由来の新規バイオマーカーをマルチオミクス解析により同定することを目的とした。特に、単一細胞RNAシーケンス (scRNA-seq; single-cell RNA sequencing) を用いて前治療TMEの細胞アトラスを系統的に解析し、治療効果に関連する細胞サブセットを特定することを目指した。さらに、同定されたバイオマーカーの予測性能を既存のPD-L1 CPSと比較し、その臨床的有用性を評価するとともに、in vivo機能実験を通じてそのメカニズム的役割を解明することを目的とした。最終的に、HPSCCにおける精密免疫療法を導くための、臨床的に応用可能な予測ツールの開発を目指した。
結果
第II相試験の有効性：ORR 82.7%、pCR率 29.7%、2年OS率 93%の優れた成績: 70例の評価可能患者において、ネオアジュバント化学免疫療法は客観的奏効割合 (ORR; objective response rate) 82.7% (完全奏効 CR 18.6%、部分奏効 PR 64.2%、安定病変 SD 8.6%、進行病変 PD 8.6%) を示した。手術を施行した64例のうち、pCR率は29.7% (19/64; 95% CI, 18.9%–42.7%)、MPR率は56.3% (36/64; 95% CI, 43.3%–68.4%) であった。観察期間中央値19.1ヶ月において、1年全生存率 (OS) は100%、2年OS率は93% (95% CI, 83.1–100) であった。1年イベントフリー生存率 (EFS) は88.2% (95% CI, 80.8–96.2)、2年EFS率は71.1% (95% CI, 58.1–88.5) であった。ベースラインのPD-L1 CPSはpCRと有意な相関を示さず (p=0.313)、既存バイオマーカーの限界が確認された (Figure 1e, 1f)。
scRNA-seq解析：応答者でCCL3高発現好中球サブセット (Neu_CCL3) が特異的に濃縮: nCITの有効性を解明するため、前治療腫瘍生検サンプル13例 (応答者 R 6例 vs. 非応答者 NR 7例) でscRNA-seq解析を実施し、97,099個の単一細胞トランスクリプトームを取得した (Figure 2a, 2c)。主要な細胞型分画を比較したところ、骨髄系細胞および好中球の割合が応答者で有意に増加していることが示された (Figure 2d)。IHCでも、前治療検体においてCD15+好中球浸潤が応答者群で有意に高く (p < 0.001) (Figure 2e)、CD68+マクロファージ浸潤には有意差がなかった (Figure 2f)。遺伝子セット濃縮解析 (GSEA) では、炎症応答、好中球走化性、好中球媒介性免疫などの免疫経路が応答者で濃縮されていることが示された (Figure 2g)。好中球を3つのサブセットに再クラスタリングしたところ、CCL3高発現サブセット (Neu_CCL3) が応答者で特異的に濃縮されており、非応答者では稀であることが判明した (Figure 4a, 4b)。Neu_CCL3細胞はCXCL8、CCL3、CCL4などの多数のケモカインを高発現しており (Figure 4d)、CellChat解析ではCD8+ T細胞の腫瘍浸潤を促進する「免疫許容的」なTMEを形成していることが示唆された。
Neu_CCL3シグネチャーの予測優越性：AUC=0.788がPD-L1 CPS (AUC=0.621) を上回る独立予測因子: Neu_CCL3サブセットの臨床的予測能を検証するため、前治療腫瘍56例で多重免疫蛍光 (mIF) 染色を実施した。pCR症例においてCCL3+CD15+細胞密度が有意に高いことが示された (p < 0.0001) (Figure 4f, 4g)。また、バルクRNA-seqデータ (n=60) でも、応答者でNeu_CCL3シグネチャースコアが有意に上昇していることが確認された (Figure 4h)。ROC解析では、Neu_CCL3シグネチャーのAUCが0.788であり、PD-L1 CPSのAUC 0.621を有意に上回る予測能を示した (Figure 4i)。多変量ロジスティック回帰分析では、Neu_CCL3スコアの1標準偏差 (SD) 増加あたり、pCRのオッズ比は34.10 (95% CI: 4.99–424.61, p=0.001) であり、年齢、喫煙、飲酒、T病期、N病期、腫瘍部位、CPSといった他のすべての臨床因子を独立して上回る最強の予測因子として確認された (Figure 4j)。
外部コホート検証：NSCLCと悪性黒色腫で汎がん腫的な予測性の確認: Neu_CCL3シグネチャーの汎用性を評価するため、3つの公開された抗PD-1抗体と化学療法を受けた外部検証コホートで検証を行った。非小細胞肺癌 (NSCLC) コホート (n=24) では、応答者でNeu_CCL3シグネチャースコアが有意に高く (p=0.018)、AUCは0.793と良好な識別能を示した。2つの悪性黒色腫コホート (n=49およびn=41) でも同様に、応答者でスコアが高く (それぞれp=0.030およびp=0.021)、一貫してAUC 0.723および0.711の識別性能を示した。これらの結果は、Neu_CCL3シグネチャーが癌種を超えて免疫療法応答を予測する汎用的なバイオマーカーとしての可能性を示唆している。
In vivo機能実験：CCL3補充が好中球枯渇による免疫抑制を逆転: Neu_CCL3が抗PD-1療法の有効性を増強するかを検証するため、MOC1 (高免疫原性) およびMOC2 (免疫抑制性) マウスモデルで好中球枯渇とCCL3補充実験を実施した (Figure 5a)。抗PD-1単独療法は両モデルで腫瘍増殖を控えめに抑制したが、MOC1モデルの方がMOC2モデルよりも効果が強かった。好中球枯渇 (抗Ly6G抗体による) はPD-1抗体の有効性を部分的に減弱させたが、外因性CCL3補充により腫瘍体積および重量が有意に減少し、好中球枯渇によって引き起こされた腫瘍増殖が逆転した (p < 0.05) (Figure 5b-e)。これはCCL3がPD-1免疫療法の有効性を高める可能性を示唆している。MOC1モデルでは、好中球枯渇が抗PD-1誘発CD8+ T細胞浸潤を減少させたが、CCL3補充はこの効果を回復させた (Figure 5f, 5g)。同様に、MOC2モデルでも、好中球、CCL3、抗PD-1の組み合わせがCD8+ T細胞浸潤と抗腫瘍効果を有意に増強した (p < 0.01) (Figure 5h, 5i)。これらの結果は、CCL3+好中球がT細胞浸潤と活性化を促進することで、PD-1療法の有効性を相乗的に高める可能性を示している。
応答者におけるCD69高発現CD8+ T細胞 (TRM様) の存在: T細胞サブセットの解析では、CD8_CD69 T細胞が応答者の前治療腫瘍でより豊富に存在することが示された (Figure 6d)。これらのCD8_CD69 T細胞は、高い細胞傷害性プログラム活性と比較的低い疲弊関連シグネチャーを示し (Figure 6e)、早期活性化および組織定着マーカーであるCD69を高発現していた。これは、CD103で明確に定義されるTRM (tissue-resident memory) ではなく、TRM様CD8+ T細胞の状態と一致する。CD8_CD69 T細胞は、TNF、p53、アポトーシス経路のアップレギュレーションを示し (Figure 6f)、腫瘍細胞殺傷経路 (TNF-TNFRSF1A, GZMA-PARD3, CD6-ALCAM) に関与していた (Figure 6g)。特に、すべてのT細胞サブセットの中で、CD8_CD69 T細胞の浸潤レベルのみがnCIT後の腫瘍縮小率と有意な正の相関を示した (Spearman r = 0.653, p < 0.05) (Figure 6h)。これらの結果は、CD8_CD69 T細胞が早期活性化CD8+ T細胞であり、免疫療法応答を予測する有望なバイオマーカーであることを示唆している。
考察/結論
本研究は、局所進行HPSCCにおけるネオアジュバント化学免疫療法 (nCIT) への応答が、CCL3高発現好中球サブセット (Neu_CCL3) によって前もって規定された免疫構築に依存することを示した。Neu_CCL3細胞は複数のケモカインを介してエフェクターCD8+ T細胞を腫瘍コアに誘導し、「免疫許容的」な腫瘍微小環境 (TME) を形成する中心的コーディネーターとして機能することが示唆された。
先行研究との違い: これまでの研究では、好中球を免疫抑制的な存在として捉えることが多かったが、本研究はCCL3+好中球という特定のサブセットが抗腫瘍免疫を促進し、治療応答を予測するという重要な対比を提示した。PD-L1 CPSがHPSCCにおいて予測精度に限界を示してきた中で、Neu_CCL3シグネチャー (AUC=0.788 vs. CPS AUC=0.621) は臨床的に意義深い改善を示した。
新規性: 本研究で初めて、HPSCCにおけるnCITの有効性が、ベースラインのTMEにおけるCCL3高発現好中球サブセットによって決定されることを明らかにした。このNeu_CCL3遺伝子シグネチャーは、PD-L1 CPSを上回る強力な独立予測因子であり、さらに非小細胞肺癌や悪性黒色腫の外部コホートでも癌種を超えた汎用性が示されたことは新規の知見である。また、MOC1およびMOC2マウスモデルを用いたin vivo機能実験により、CCL3補充が好中球枯渇による免疫抑制を逆転させ、抗PD-1効果を増強するというメカニズム的根拠を初めて提示した。
臨床応用: 本知見は、HPSCC患者のnCITに対する応答予測において、Neu_CCL3シグネチャーがPD-L1 CPSの限界を補完する有望なバイオマーカーとなり得ることを示している。これにより、治療効果が期待できる患者をより正確に選択し、精密免疫療法を推進するための臨床的意義は大きい。さらに、動物実験で示されたCCL3の薬理学的投与によって、非応答者のTMEを「熱い」免疫活性状態に変換する戦略の可能性は、将来的な治療介入の新たな方向性を示唆するものであり、bench-to-bedsideへの応用が期待される。
残された課題: 本研究にはいくつかのlimitationが存在する。第一に、本試験は単施設・単群試験であり、化学療法単独または免疫チェックポイント阻害剤単独の対照群がないため、レジメン特異的な効果を明確に区別することはできない。第二に、Neu_CCL3シグネチャーは単一施設でのネオアジュバント化学免疫療法設定で導出されたものであり、異なる治療レジメン、疾患スペクトル、施設、およびアッセイプラットフォーム間でのトランスポート可能性と、臨床的に実行可能な閾値の較正は今後の検討課題である。第三に、すべての参加者が男性であったため、結果の一般化可能性が制限され、バイオマーカーの性能や治療関連毒性における性差の評価ができなかった。したがって、安全性/忍容性に関する結論は、この文脈で解釈する必要があり、女性を含むコホートでの検証が必要である。第四に、scRNA-seqコホートが比較的小規模 (n=13) であり、生存追跡期間も短く、OSイベントが少ないため、病理学的奏効やNeu_CCL3と長期的なEFS/OSとの強固な関連付けには、より大規模な多施設共同研究と長期的な追跡調査が必要である。
方法
本研究は、中国の山東省耳鼻咽喉科病院で実施された前向き単施設単群探索的第II相試験であり、Chinese Clinical Trial Registry (ChiCTR2400081826) に2024年3月13日に登録された。2023年3月から2024年7月にかけて、未治療の組織学的に確認された切除可能局所進行HPSCC (AJCC第8版臨床病期III-IVA) 患者81例が登録され、そのうち70例が適格基準を満たし、2サイクルのネオアジュバント療法を完了した。患者はトリパリマブ (240 mg、day 1)、アルブミン結合パクリタキセル (125 mg/m²、day 2)、およびネダプラチン (80 mg/m²、day 2) の21日サイクルを2コース施行後、手術を受けた。主要評価項目は病理学的完全奏効 (pCR; pathological complete response) 率であった。
治療効果の評価は、RECIST 1.1 (Eisenhauer et al. 2009) に基づく放射線学的腫瘍応答と、術後病理組織学的検査による病理学的治療効果 (PTE; pathologic treatment effect) に基づいて行われた。PTEは腫瘍床領域における腫瘍壊死の割合として定義され、pCR (PTE = 100%) と主要病理学的奏効 (MPR; major pathological response; PTE ≥ 90%) が評価された。
分子プロファイリングのため、前治療腫瘍生検サンプルが収集された。13例の新鮮腫瘍生検サンプルでscRNA-seqが実施され、97,099個の高品質細胞のトランスクリプトームデータが得られた。scRNA-seqデータはR (v4.3.1) のSeurat (v5.0.3) およびHarmony (v1.2.0) を用いて解析され、CellChat (v1.6.1) を用いて細胞間コミュニケーションが推測された。60例の新鮮腫瘍生検サンプルでバルクRNAシーケンスが実施され、DNBSEQ-T7プラットフォームでシーケンスされた。56例のホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE; formalin-fixed, paraffin-embedded) 腫瘍組織ブロックから組織マイクロアレイ (TMA; tissue microarray) が作製され、免疫組織化学 (IHC; immunohistochemistry) および多重免疫蛍光 (IF; immunofluorescence) 染色が実施された。IHCではCD15とCD68、IFではCD15とCCL3が用いられ、QuPathを用いて定量化された。
外部検証は、公開データベースから取得した3つのネオアジュバント抗PD-1抗体と化学療法を受けたコホート (非小細胞肺癌: GSE207422, n=24; 悪性黒色腫: GSE91061, n=49; PRJEB23709, n=41) で実施された。
機能実験として、マウス口腔癌細胞株MOC1 (高免疫原性) およびMOC2 (免疫抑制性) を用いたin vivo実験が実施された。C57BL/6Jマウスに腫瘍を皮下移植し、抗Ly6G抗体による好中球枯渇、組換えマウスCCL3 (rmCCL3) によるCCL3補充、および抗PD-1抗体による治療が行われた。腫瘍体積と重量が測定され、フローサイトメトリーにより腫瘍内CD8+ T細胞浸潤が評価された。
統計解析はR (v4.3.1) を用いて行われ、群間の数値変数の比較にはWilcoxon rank-sum testまたはt-testが用いられた。ROC曲線が生成され、pROCパッケージ (v1.18.5) を用いてAUCが計算された。多変量ロジスティック回帰分析により、候補バイオマーカーの予測性能が評価された。統計的有意水準はp値または調整p値 < 0.05と設定された。