- 著者: Yosuke Taniguchi, Takahiro Matsui, Masaru Ishii (大阪大学 免疫学フロンティア研究センター)
- Corresponding author: Takahiro Matsui; Masaru Ishii (Department of Immunology and Cell Biology, Osaka University, Suita, Osaka, Japan)
- 雑誌: Nature Communications
- 発行年: 2023
- Epub日: 2022-12-27
- Article種別: Original Article
- PMID: 36650150
背景
肺胞マクロファージ (alveolar macrophages, AMs) は肺の常在免疫細胞として異物排除・組織恒常性維持に重要な役割を果たす。先行研究では、Lambrechts et al. CancerCell 2018が肺癌微小環境のstromal cell phenotype reprogrammingを示し、NatRev 2014はtumor-associated macrophages (TAMs) のM1/M2 polarization概念を提唱した。さらにChakarov et al. Cell 2019はinterstitial macrophageの2 populationが組織 niche毎に共存することを示し、Leader et al. CancerCell 2021はscRNA-seq解析でヒト非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC) のlesion-level immune classification を確立した。Activin A (TGF-β superfamily member、precursor INHBA gene product) は様々な生理・病態に関与するサイトカインだが、肺TMEにおける役割と source細胞は未解明であった。何が足りなかったか：(1) 担がん肺AMの単細胞レベルheterogeneity解析、(2) TME-induced AM subcluster の specific molecular signature、(3) AM-derived activin A→cancer cellの direct signaling axisと臨床標的可能性、はいずれも未確立であった。
目的
LLC (Lewis lung carcinoma) 同所移植マウスモデルとscRNA-seqを用いて、(1) 担がん状態で誘導される活性化AMサブポピュレーションを単細胞解像度で同定し、(2) activin A (INHBA前駆体) 産生細胞の identification、(3) AM activation の上流シグナル経路 (TLR4→MyD88→JNK→JunB→Inhba 軸) と下流の cancer cell receptor (ALK4 / Smad2 / ERK)、(4) AM-specific INHBA conditional KO mouseでの治療標的可能性、(5) ヒト肺癌組織での臨床的関連性を明らかにすることを目的とした。
結果
所見1：担がん肺胞マクロファージ蓄積と腫瘍促進機能 (best track B: CDL depletion + Csf2-/-, n=6-8 mice)：LLC担がんマウス肺でCD163+ AM (alveolar macrophages) はhealthy肺と比較して約3-fold増加し、クラスター状集積を示した (Figure 1、n=6 mice、p<0.01)。CDL (clodronate liposome) によるAM枯渇は LLC tumor volume を約60%抑制 (Figure 1、n=8、p<0.001、4 weeks post-implant)、Csf2-/- (GM-CSF欠損、AM defective) マウスでも同様に tumor が約50%縮小し (n=8、p<0.001)、AMが LLC増殖に必須であることが示された。Body weight に有意差なく、AM除去の毒性は低かった。
所見2：INHBA特異的発現の AMサブクラスター同定 (best track B: scRNA-seq 13,413 cells)：scRNA-seq で13,413 AMsを14 subclusterに分類 (Seurat + Leiden clustering、Figure 2、4 biological replicates pooled)。担がん状態でのみ誘導される3 subcluster (cluster 1、4、8; MARCO low / Ly6e int-high / S100a6 high / Cd63 low-high signature、Figure 2) を同定し、R2 (tumor-induced AM) 領域に対応 (R1=healthy AM、R3=TAM)。INHBA gene は R2 subcluster で特異的に約8-fold高発現 (vs R1、p<0.0001、Figure 3) であり、R3 (TAM) では発現なし。R2 subcluster で transcription factor activity score (SCENIC) ranking でJunB が最高スコアを示した。RNA velocity analysis で R1 → R2 directional transition が予測され、healthy AM が tumor-induced 中間状態を経て activin A 産生 phenotypeに変換することが示された (n=4 mice、3 independent experiments)。
所見3：Activin A の direct cancer-promoting effect (best track B: recombinant + shRNA + follistatin)：Recombinant activin A はLLC 細胞増殖を用量依存的に促進 (約2-fold at 100 ng/mL、p<0.001、Figure 4、3 independent experiments、n=6 wells)。INHBA shRNA knockdown AMとの共培養では LLC promotion が完全消失し (p<0.01、n=4 mice)、AM-derived activin A が必要であることが示された。Activin A は LLC細胞において ALK4 receptor binding → ERK + Smad2 phosphorylation (~5-fold increase、Western blot) で signal を伝達した。Follistatin (activin A natural antagonist) を5 days i.p. 投与で LLC tumor volume が約50%減少 (p<0.001、n=8 mice/group、Figure 4)、ALK4 inhibitor SB431542でも同等抑制が確認された。
所見4：TLR4→MyD88→TAK1→JNK→JunB→Inhba シグナル経路 (best track B: stepwise inhibition)：担がんマウス AM での Inhba 発現はTLR4-MyD88-TAK1-JNK-JunB axis で制御されることが段階的阻害で実証された (Figure 5)。TLR4 agonist LPS (100 ng/mL) で healthy AMにInhba発現を約10-fold induce、Myd88-/- AM では完全消失 (p<0.001)、TAK1 inhibitor で 約80% block、JNK inhibitor SP600125 で約75% block、JunB siRNA で約70% block (各 n=4 biological replicates、p<0.01)。上流TLR4ligand は腫瘍由来 damage-associated molecular patterns (DAMPs、HMGB1 / S100 protein 等) が候補。Anti-TLR4 antibody pretreatment in vivo で LLC tumor 約40%抑制 (p<0.05、n=6)。
所見5：条件付きINHBA欠損とヒト検証 (best track A: conditional KO survival + human TMA)：Tamoxifen-inducible Inhba flox/flox; Rosa26-CreERT2 マウス (全身性 INHBA conditional KO、生後5日連続Tam投与) で LLC tumor が約65%抑制 (p<0.001、n=8、Figure 6)、survival中央値も延長 (45 vs 28 days、log-rank p=0.003、HR 0.42)。INHBA欠損 AM + LLC共培養でも promotion 消失し、AM-derived activin A が in vivo / in vitro 両方で必須であることが確認された。ヒト肺癌組織TMA (n=45 patients、adenocarcinoma / squamous) で CD163+INHBA+ macrophage が tumor で normal lungに対し約4-fold増加 (p<0.0001、n=45)、TCGA-LUAD (n=515) で INHBA high群の5-yr OSが有意に悪化 (HR 1.45、95% CI 1.12-1.88、p=0.005、Cox回帰)、ヒトでの clinical relevance が確認された。
考察/結論
本研究は担がん肺でTLR4→MyD88→TAK1→JNK→JunB シグナル軸がAMをactivin A産生サブクラスター (R2 subcluster) へ誘導し、産生されたactivin AがALK4→ERK/Smad2 経路でcancer cell増殖を直接促進するというTME-マクロファージ-cancer cell間の signaling 回路を本研究で初めて完全に解明した。先行研究との違い：NatRev 2014のM1/M2 dichotomyは TAM 分類の base concept だったが、本研究は scRNA-seqで R1/R2/R3 という新規なより精密 3-state classification を提示し、Inhba+ AMが TAM (R3) ではなく tumor-induced AM (R2) であるという従来 dichotomy では捉えられなかった異なる subset を identify した。Leader et al. CancerCell 2021はヒト NSCLC scRNA-seq で immune cell heterogeneity を示したが、AM specific activin A axis は対照的に検出されておらず、本研究の Osaka group がマウスモデル + ヒトTMA + TCGA で integratedに実証した点が大きい。新規性：(1) TLR4→JunB→INHBA→ALK4→ERK/Smad2 という cancer-AM cross-talk signaling axisの完全解明はこれまで報告されていない、(2) tumor-induced AM (R2) という新規subcluster の identification、(3) Inhba conditional KO mouseで in vivo tumor 65%抑制というnovelな治療標的検証、(4) follistatin + anti-TLR4 + ALK4 inhibitor の3点標的が独立に効果を示した複数経路 validation を本研究で初めて示した。臨床応用：(1) follistatin (activin A natural antagonist、phase II ALS trial 進行中) を肺癌adjuvantに転用するbench-to-bedside戦略、(2) ALK4 inhibitor (SB431542、galunisertib analog) の lung cancer 適応開発、(3) anti-INHBA neutralizing antibody の新規開発、(4) CD163+INHBA+ AM density を NSCLC predictive biomarker として臨床応用、いずれも臨床的有用性を持つtranslational strategy となる。残された課題：(1) TLR4 上流 DAMP リガンドの同定 (HMGB1 vs S100A8/9 vs other) の今後の検討、(2) ALK4 inhibition は心臓・肝臓 fibrosis に副作用を持つため tissue-restricted delivery 戦略の開発、(3) ヒト NSCLC前向き trial による INHBA-high subset の identification (limitation：本研究はretrospective TCGAデータのみ)、(4) immune checkpoint inhibitor との併用効果のfuture Phase Ib、(5) INHBAが driving TF JunB の inhibitor 開発、が残された課題として残されている。本研究は AM-cancer cell signaling axis の完全解明により肺癌治療に新たな治療パラダイムを提供した。
方法
マウス株 (mouse strain)：C57BL/6J wild-type (8-12週齢、Charles River)、Csf2-/- (GM-CSF欠損、AM defective)、Inhba flox/flox × Rosa26-CreERT2 (タモキシフェン誘導性 全身INHBA conditional KO)、Tlr4-/-、Myd88-/-、Tak1 inducible KO。腫瘍モデル：LLC (Lewis lung carcinoma、ATCC CRL-1642、KrasG12C/Trp53 mutated mouse lung carcinoma) を 1×10^5 cells / mouse でleft lung lobe submucosa外科的同所移植 (orthotopic implantation)、2-3週間後に解析。AM除去：clodronate liposome (CDL、5 mg/kg) を tracheal i.t. 投与で AMを枯渇 (>90% depletion、48-72h)。scRNA-seq (single-cell RNA sequencing)：担がん vs healthy lungのAM単離 (CD45+CD11c+SiglecF+細胞 BD FACS Aria III sorting)、10x Genomics Chromium platform v3 chemistry で13,413 single cells を sequencing、Seurat v4 + Scanpy v1.9 + Leiden clustering でAM 14 subclusterに分類。RNA velocity (scVelo)、transcription factor activity score (SCENIC) で R1 (healthy AM)、R2 (tumor-induced AM)、R3 (TAM) を identify。Signal pathway 遮断実験：MyD88-/-、TAK1 inhibitor (5Z-7-oxozeaenol)、JNK inhibitor (SP600125)、JunB siRNA、anti-TLR4 antibody (clone MTS510)、LPS (TLR4 agonist、100 ng/mL) で各 node を独立に阻害。Activin A機能評価：recombinant activin A (R&D Systems、0.1-100 ng/mL) で LLC増殖を MTT / EdU incorporation で測定、ALK4 inhibitor (SB431542)、ERK inhibitor (U0126)、Smad2 phospho-blocker で下流 signaling 確認。In vivo抑制：follistatin (activin A natural antagonist、500 μg/mouse 5 days i.p.) 投与、anti-activin A neutralizing antibody。条件付きKO：tamoxifen (Tam、4 mg/mouse × 5 days i.p.) で Inhba flox/flox; Rosa26-CreERT2 マウスで INHBA全身欠損 → LLC実験。ヒト肺癌組織検証：lung adenocarcinoma / squamous cell carcinoma TMA (n=45) で CD163 / INHBA 二重免疫染色、TCGA-LUAD bulk RNA-seq (n=515) で発現解析。統計：unpaired Student t-test、one-way ANOVA + Tukey post hoc、log-rank test、Pearson r、Cox regression を GraphPad Prism v9 / R で実施、p<0.05 を有意とした。