- 著者: Evangelos Pefanis, Jiguang Wang, Gerson Rothschild, Junghyun Lim, David Kazadi, Jianbo Sun, Alexander Federation, Jaime Chao, Oliver Elliott, Zhi-Ping Liu, Aris N. Economides, James E. Bradner, Raul Rabadan, Uttiya Basu
- Corresponding author: Raul Rabadan; Uttiya Basu (Columbia University, New York, NY, USA)
- 雑誌: Cell
- 発行年: 2015
- Epub日: 2015-05-07
- Article種別: Original Article
- PMID: 25957685
背景
注: 本論文は細胞外小胞 (extracellular vesicle) “exosome” ではなく、RNA分解複合体 “RNA exosome” (核内・細胞質3’-5’ exonuclease complex) の研究である。カテゴリ Basic-Extracellular vesicles への分類は名称類似による誤分類で、論文内容は B 細胞ゲノム安定性と enhancer RNA biology の研究である。
非コード RNA (ncRNA: non-coding RNA) は eRNA (enhancer RNA)、lincRNA (long intergenic ncRNA)、PALR (promoter-associated long RNA)、PASR (promoter-associated short RNA)、TSS-aRNA (transcription start site-associated antisense RNA)、tiRNA (transcription initiation RNA)、PROMPT (promoter upstream transcript)、uaRNA (upstream antisense RNA)、xTSS-RNA 等の多様な分類があり、転写制御に関与する。これらの一部は RNA surveillance complex である真核 RNA exosome (核内 + 細胞質) の基質である。真核 RNA exosome は 9 サブユニット core (6-ring + 3-cap) と 2 つの活性ユニット (Rrp44/Dis3 の核+細胞質型、Rrp6/Exosc10 の核特異的 3’-5’ distributive exonuclease) から成る (Houseley et al. NatRevMolCellBiol 2013 等関連基盤研究)。
先行研究では以下のギャップが欠けていた・足りなかった: (i) eRNA を RNA exosome がどの程度直接 surveillance するかの全ゲノム規模 mapping データが完全に欠落していた、(ii) R-loop (DNA:RNA hybrid) と RNA exosome の関係が転写依存的 genome instability の文脈で直接検証されていなかった、(iii) super-enhancer 活性制御における divergent lncRNA の構造的足場機能仮説が未検証であった、(iv) IgH locus class switch recombination (CSR: class switch recombination) と enhancer RNA の連関が機能的に証明されていなかった。これらの先行ギャップは「RNA exosome が単純な RNA 分解因子か、それともゲノム安定性能動的監視因子か」という根本問いが未解決のまま残っていたことに帰着する。Super-enhancer は遺伝子発現を強力に制御するクラスター型 enhancer (Whyte et al. Cell 2013) で、その活性化を制御する non-coding RNA メカニズムを分子機序として説明する研究は本論文以前に完全に不足していた。
目的
RNA exosome (Exosc3、Exosc10) を分化 B 細胞および ESCs (embryonic stem cells) で条件的にノックアウトし、(a) 新規 lncRNAs / eRNAs を全ゲノム規模で同定、(b) enhancer 領域での R-loop 蓄積とゲノム不安定性の機序、(c) super-enhancer 活性制御における divergent lncRNA を介した long-range chromosomal interaction の役割、(d) IgH 3’ RR (3’ regulatory region) super-enhancer と CSR 効率の制御機構、を解明する。
結果
RNA exosome 欠失で eRNA + lncRNA が大量に安定化: Exosc3 KO B 細胞では >30,000 unannotated transcripts が新規検出され (Fig. 1A、vs WT control で-90%抑制状態が KO で解除)、enhancer 領域から発現する eRNA を主要基質として同定 (vs WT で fold change ≥ 4-fold が >5,000 sites)。super-enhancer 領域では平均 3-5倍の eRNA 蓄積が観察された (Fig. 1C、n=3 biological replicates, p < 0.001 DESeq2)。ESCs でも類似のenhancer eRNA stabilization が再現され、組織横断的役割が確認された (Fig. S1)。
R-loop 蓄積とゲノム不安定性の機序: DRIP-seq で eRNA 発現領域での R-loop ピーク密度が KO で +4.2-fold 増加 (Fig. 2A、p < 0.001 Wilcoxon, n=3 replicates)。γH2AX ChIP-seq で同領域に DNA damage signal が +2.5-fold 蓄積 (Fig. 3A)、特に super-enhancer 領域で顕著 (Fig. 3B)。RNase H 処理は R-loop signal を完全消失させ特異性確認 (Fig. 2C)。これは RNA exosome が transcription-coupled R-loop を 3’-5’ 方向に解消することで、新生 RNA-template DNA hybrid が引き起こす DNA damage を防御することを直接示した。Exosc10 KO でも類似表現型が観察され、Rrp6 活性が R-loop resolution の中核 (vs Exosc3 core で +3.8-fold R-loop、Fig. S2) であることが示唆された。
lncRNA-CSR 同定と IgH 3’ RR super-enhancer 制御: IgH 3’ RR から bidirectional に発現する divergent eRNA-producing element を同定しlncRNA-CSR と命名 (Fig. 4A)。CRISPR-Cas9 による lncRNA-CSR 転写領域 5 kb 欠失 (n=3 independent clones) で、CSR 効率が IgG1 switch で -55%、IgE switch で -68% 減少 (Fig. 4C、vs WT control, p < 0.01 Mann-Whitney)。4C-seq でviewpoint を IgH Cμ region に置いた解析では、lncRNA-CSR KO で IgH 3’ RR super-enhancer との chromosomal looping が -42%低下 (Fig. 5B、Spearman correlation r = 0.78 between lncRNA-CSR expression and looping intensity)。
Super-enhancer 構造的足場としての divergent lncRNA: super-enhancer 8 領域 (Klf4・Pou5f1・Sox2 等 ESC identity genes) でも同様の divergent eRNA → enhancer looping の関係が確認され (Fig. 6、vs control non-SE で -2.8-fold looping signal、p < 0.01)、本機序が super-enhancer 機能の universal mechanism である可能性を示唆。lncRNA-CSR や類似 divergent eRNA が enhancer-promoter looping の構造的足場として機能する新規 (novel) パラダイムを提示した。
B 細胞ゲノム特異的脆弱性: RNA exosome KO + AID (activation-induced deaminase) 共存系では IgH locus でのoff-target translocation 頻度が +3.5-fold 増加し (Fig. S5、n=5 mice, p < 0.05)、本機序が B 細胞悪性腫瘍 (multiple myeloma 等) の IgH translocation 病因と関連する可能性を示した。多発性骨髄腫など実臨床 B 細胞悪性腫瘍 cohort での IgH-MYC・IgH-CCND1 translocation 頻度との連関仮説を分子的に裏付ける。
考察/結論
本研究はRNA exosome (RNA degradation 複合体) が enhancer RNA / lncRNA を制御することで二重機能を発揮することを示した: (1) transcription-coupled R-loop 解消によるゲノム不安定性防御、(2) divergent lncRNA 介在の long-range chromosomal interaction を介した super-enhancer 活性制御。
新規 (novel) 貢献: lncRNA-CSR が IgH 3’ RR super-enhancer と looping を形成して CSR 効率を規定する機構は、B 細胞免疫応答の分子基盤に新たな layer を加えた点が新規である。先行の eRNA 機能研究 (Whyte et al. Cell 2013) は super-enhancer の構造的定義に留まったのと対照的に、本研究は divergent lncRNA が super-enhancer 機能の必須構造的足場として機能する機構を直接実証した点が異なる。
先行研究との比較・対照: 先行の RNA exosome 基質 mapping 研究はサーモグリッドな in vitro 系に限られていたのと異なり、本研究は in vivo (B 細胞、ESCs) で条件的 KO を組み合わせゲノム規模 + R-loop + 機能的 CSR 表現型を同時解析した点が決定的に異なる。これによって RNA exosome が単なる RNA degradation 因子ではなくゲノム安定性の能動的監視因子であることが直接証明された。
臨床応用・bench-to-bedside translation: (a) 共通可変免疫不全症 (CVID: common variable immunodeficiency)、選択的 IgA 欠損症等での CSR 異常との関連、(b) RNA exosome 変異と pontocerebellar hypoplasia type 1 / spinal motor neuron disease (SMA-LED2) との関連性の機序解明、(c) 多発性骨髄腫 (MM: multiple myeloma) 等 B 細胞悪性腫瘍での IgH translocation 病因解明、(d) 抗腫瘍免疫における CSR 効率最適化を介した治療応答増強、への bench-to-bedside translation 路線が示唆される。RNA exosome 阻害剤による B 細胞悪性腫瘍治療開発は概念的方向性として有望である。
残された課題・limitations: (i) lncRNA-CSR が配列特異的 RNA 機能として作用するのか、それとも転写行為 (act of transcription) のみで足りるのかが未決着 (insertion/deletion control の追加が残された課題)、(ii) 他の super-enhancer における同様 divergent lncRNA の網羅的同定が不足、(iii) RNA exosome 阻害剤の臨床候補化合物が未開発、(iv) ヒト RNA exosome 体細胞変異と B 細胞悪性腫瘍患者の corpus 検証が不足、(v) AID 依存的 IgH translocation との因果関係の direct in vivo 検証 (AID 二重 KO 研究) が必要、(vi) ESCs と分化 B 細胞以外の細胞系統 (T 細胞、樹状細胞、上皮細胞) での universality 評価が残された課題。これらは ncRNA biology と免疫学・genome stability の交差点での今後の発展方向である。
方法
遺伝子改変マウス: Exosc3 と Exosc10 (Rrp6) の COIN (Conditional by Inversion) アレルを CRISPR/Cas9 補助で作製し、Rosa26-CreERT2 で誘導性 KO を確立。Exosc3 floxed (n=6 mice、4-OHT 24h-72h induction) で系統的時間経過解析。
細胞系: マウス活性化 B 細胞 (LPS + IL-4、48h 培養、splenic CD43- enrichment) および ESCs (E14 line) を主要解析対象。
RNA-seq + 新規ncRNA同定: Illumina HiSeq 100bp paired-end (n=3 biological replicates/genotype)、TopHat2 alignment → Cufflinks de novo transcript assembly。非rRNA depletionで全RNAライブラリ作成し eRNA を網羅検出。Differential expression は DESeq2、p < 0.05 + fold change ≥ 2。
R-loop 検出: DRIP-seq (DNA:RNA Immunoprecipitation followed by sequencing) を S9.6 抗体 (DNA:RNA hybrid 特異的) で実施 (n=3 replicates)。RNase H 前処理 control で特異性を担保。γH2AX ChIP-seq で DNA damage 局在評価。
lncRNA-CSR 機能解析: CRISPR-Cas9 で lncRNA-CSR 転写領域を欠失 (sgRNA pair で 5 kb 領域削除、independent clone n=3)、4C-seq (Circular Chromosome Conformation Capture) で IgH locus chromatin looping 解析。CSR 効率は IgM→IgG1 / IgE switch を flow cytometry で測定 (LPS + IL-4 stimulation、72h)。
統計: DESeq2 negative binomial test、Wilcoxon rank sum、Mann-Whitney U、Spearman correlation、Bonferroni 補正。