- 著者: Eunae You, Patrick Danaher, Chenyue Lu, Siyu Sun, Luli Zou, Ildiko E. Phillips, Alexandra S. Rojas, Natalie I. Ho, Yuhui Song, Michael J. Raabe, Katherine H. Xu, Peter M. Richieri, Hao Li, Natalie Aston, Rebecca L. Porter, Bidish K. Patel, Linda T. Nieman, Nathan Schurman, Briana M. Hudson, Khrystyna North, Sarah E. Church, Vikram Deshpande, Andrew S. Liss, Tae K. Kim, Yi Cui, Youngmi Kim, Benjamin D. Greenbaum, Martin J. Aryee, David T. Ting
- Corresponding author: Martin J. Aryee (Dana-Farber Cancer Institute); David T. Ting (Mass General Cancer Center, Boston, MA, USA)
- 雑誌: Cell
- 発行年: 2024
- Epub日: 2024-10-08
- Article種別: Original Article
- PMID: 39383862
背景
膵管腺癌 (pancreatic ductal adenocarcinoma: PDAC) は米国で最致死性の成人悪性腫瘍であり、5年生存率は12%未満。PDAC progression は腫瘍細胞 intrinsic factors (KRAS/TP53/CDKN2A/SMAD4変異等) と extrinsic factors (癌関連線維芽細胞 [cancer-associated fibroblasts: CAFs]、免疫抑制性微小環境) の組み合わせで駆動される。Single-cell解析でPDAC細胞とCAFsの heterogeneity が判明し、CAFsは少なくとも炎症性CAF (inflammatory CAF: iCAF) と筋線維芽性CAF (myofibroblastic CAF: myCAF) の 2 つの subtype に大別される (Elyada et al. CellMolGastroenterolHepatol 2019 関連)。
Repeat RNAs (LINE-1 [long interspersed nuclear element 1] レトロトランスポゾン、HSATII [human satellite II] pericentromeric satellite、HERV-K / HERV-H [human endogenous retrovirus] 等) は genome 約半分を占め、過去には “junk DNA” とみなされていたが、Ting研究室の先行研究 (Ting et al. NatGenet 2011、Bersani et al. OpenBiol 2017) で多くの上皮癌で aberrant 過剰発現が報告された。特に HSATII は immunosuppressive 腫瘍微小環境 (tumor microenvironment: TME) および脱分化 mesenchymal/neuroendocrine 状態 (metastatic potential と化学療法耐性に関連) と相関する。Repeat RNAs は double-stranded RNA (dsRNA) または特異 motif を形成し、innate immune sensors (RIG-I、MDA5、TLR3、cGAS-STING) を活性化し interferon (IFN) 応答を triggerする「viral mimicry」現象を起こす (Chiappinelli et al. Cell 2015)。
先行研究で何が足りなかったかを整理すると、(1) repeat RNAs の組織内空間分布 (PDAC細胞 vs CAFs vs immune cells での発現パターン) が単一分子解像度で未解明というギャップ、(2) repeat RNAs が PDAC と CAFs の cell state alteration (epithelial→mesenchymal、myCAF→iCAF) をどう駆動するか不明、(3) repeat RNAs 含有 extracellular vesicles (EVs) が cell-cell crosstalk の機能的 vehicle として作用するか未検証、(4) PDAC と CAFs で repeat RNA に対する innate immune response が divergent な分子機構が不明 (PDACでは epithelial-mesenchymal transition [EMT]、CAFs では myCAF→iCAF transition への異なる結果)、(5) interferon regulatory factor 3 (IRF3) など下流転写因子の役割が未解明、という 5 点の knowledge gap が存在した。これらを統合的に解明するには spatial transcriptomics + 機能的 EV transfer 実験 + IRF3 knockdown の組み合わせが必要であった。
目的
ヒトPDAC原発腫瘍における repeat RNAs (LINE-1 ORF1/ORF2、HSATII、HERV-K、HERV-H) と coding RNAs の spatial distribution を単一分子解像度で同定し、(1) PDAC細胞と CAFs/macrophages/endothelial cells の cell state との相関、(2) EVを介した repeat RNA 細胞間 crosstalk の機能的検証、(3) HSATII等repeat RNA直接トランスフェクションによる myCAF→iCAF と EMT 誘導の機序解明、(4) IRF3 介在 IFN応答による PDAC vs CAF の divergent response 駆動機構、(5) FOLFIRINOX 化学療法によるrepeat RNA + EMT表現型変化、の5点を達成することを目的とした。
結果
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46例 418,224細胞の CosMx SMI 解析で PDAC tumor cells が repeat RNA を最高発現、PanIN ductal が次点、CAFs/immune cells でも aberrant 発現 (Fig 1A-E、Tables S1-S2): NanoString CosMx SMI で 46 PDAC 患者 (3 FFPE whole-block + 4 TMAs)、161 FOVs、22 clusters、418,224 細胞の spatial transcriptomics を実施し、LINE-1 ORF1/ORF2、HSATII、HERV-K、HERV-H の単一分子解像度マッピングを達成した (Fig 1A)。Insitutype algorithm で UMAP clustering (Fig 1B) と FOV別細胞型構成 (Fig 1C)、3 FFPE全組織画像 (Fig 1D) を生成。Mean repeat RNA expression per cell type 解析で PDAC tumor cells が全 4 種 repeat RNA で最高発現、ductal cells (PanIN preneoplastic lesions) が次点、CAFs/macrophages/endothelial cells でも aberrant 発現を検出 (Fig 1E、95% CI 表示)。
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LINE-1 ORF1 high CAFs/macrophages/endothelialで IFNAR2/IL10/IL11/CXCL2 inflammatory遺伝子が co-enriched、myCAF→iCAF transitional state を marker (Fig 2A-M): cancer cells N=87,181 / CAFs N=105,028 / macrophages N=18,746 / endothelial cells N=13,807 を high-LINE-1 ORF1 vs low に二分して differential gene expression解析 (Fig 2A-D volcano plots) し、high群で他 repeat RNAs + MALAT1/NEAT1 + 炎症 cytokines (IFNAR2、IL10、IL11、CXCL2) co-enrichment を確認、cancer cells で epithelial keratin (KRT8、KRT16、CDH1) 発現低下を検出。Poisson regression で CAF gene expression vs PDAC proximity (20-50/50-100/100-200 μm) を解析、repeat RNAs は consistent positive effect (距離増加でも継続)、ECM gene COL3A1 は近距離で positive (Fig 2F-G)。UMAP で COL3A1 は myCAFs に primarily発現、LINE-1 は iCAFs + myCAF/iCAF mixed cluster で高発現 (Fig 2H)、myCAF→iCAF transition state が LINE-1 high (Fig 2I)。Forest plot (Fig 2M): myCAFs で LINE-1 ORF1 expression の <0.05 mm vs >0.1 mm 差は mean -0.47 counts、iCAFs は -0.18、95% CI of difference -0.41 to -0.16、p=0.0001 で myCAFs が tumor近接時のみ LINE-1 high。
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PDAC EVs (1×10⁹/mL、100-200 nm、CD63+/CD9+/Flot-1+) が PDAC/CAF/THP-1/HUVEC で IFNB1 + ISGs を有意誘導 (Fig 3A-J、p<0.005): SECで精製した PDAC3/PDAC6 EVs を Nanosight NTA + TEM + immunoblotting (CD63、CD9、Flotillin-1陽性) で characterization (Fig 3B-D、scale 200 nm)。PDAC3 + PDAC6 EVs 1×10⁹/mL 投与で CAF-1 / PDAC3 / PDAC6 全部で IFNB1 + ISGs の有意上昇 (two-way ANOVA + Tukey、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.005、N=2 biological replicates)、CAF-1 EVs では誘導されず (Fig 3E)。同様に THP-1 マクロファージ + HUVEC でも PDAC3/6 EV処理 2日でISGs 誘導 (Fig 3F)。RT-qPCRで myCAF→iCAF (CAF-1) と上皮→間葉 (PDAC3/6) gene shift を確認 (Fig 3G-I)。抗CD9抗体 (5 μg/mL) 前処理で PKH67-labeled EV uptake を有意低下、ISG induction + iCAF marker発現も阻害、myCAF gene 発現 rescue (Fig 3J、N=3 technical replicates)。CAF-1 を PDAC EV処理すると CAF-1 EV濃度が増加 (size 不変、Fig S3L) し、secondary EV介在 PDAC-CAF crosstalk amplification 機構を実証した。
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IVT HSATII transfection で 4,595 CAF cells の scRNA-seq で 8/9 myCAF genes ↓、19/32 iCAF genes ↑ (Pearson χ²=6.549、p<0.05)、CAF migration/contractility 喪失 (Fig 4A-K): IVT HSATII + HERV-K (env) が CAF-1 で最強 IFNB1 induction (Fig 4A)、Dox-induced HSATII/HERV-K (env) CAF-1 で同様 ISG 誘導 (Fig 4B)。3 CAF lines (CAF-1/2/3) + IVT HSATII ssRNA で scRNA-seq 4,595 cells (CAF-1 untreated N=739 / treated N=613、CAF-2 untreated N=1,161/treated N=605、CAF-3 untreated N=877/treated N=600)、UMAP で 2 distinct clusters (cluster 1 untreated = myCAF: ACTA2/TAGLN/POSTN/TPM1高、cluster 2 HSATII treated = iCAF: IL6/CCL2/SOD2/TNFAIP6高) (Fig 4C-E)。HSATII transfection で 8/9 myCAF genes が downregulation、19/32 iCAF genes が upregulation (Fig 4F、Pearson’s χ² test χ²=6.549、df=1)、用量応答性確認 (Fig S4G)。HSATII LPS (10 μg/mL、PAMP control) は IFNB1 誘導するが CAF subtype pattern が異なり、repeat RNA に特異な myCAF→iCAF shift を実証 (Fig 4G)。機能アッセイ: HSATII処理で CAF-1 migration (Boyden chamber、N=6) と collagen gel 収縮性 (SMC assay、HSATII 31.25 fmol、N=3) が有意低下 (unpaired Student’s t、*p<0.05)。HSATII-CAF-1-CM を PDAC3/6 に添加すると EMT genes (CDH1↓ VIM/SNAI1↑) と migration 増強 (Fig 4J-K、one-way ANOVA + Tukey)。
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PDAC3 で HSATII + HERV-K (env) が CDH1↓・mesenchymal markers↑ で EMT 駆動、HSATII内在+外在シグナル combinationで最大 EMT induction (Fig 5A-H): PDAC3 へ IVT HSATII/HERV-K (env)/LINE-1 5’UTR/3’UTR/GFP/ACTB transfection で IFNB1 + ISGs 解析 (Fig 5A、S5A-B)、HSATII + HERV-K (env) のみが CDH1低下 + mesenchymal genes (VIM、SNAI1、SERPINE1) 上昇を強誘導 (Fig 5B、S5C)。これにより PDAC migration が増強 (Fig S5D)。LINE-1 5’/3’UTR は EMT 誘導せず、repeat RNA 種差を実証 (Fig 5C、N=3 biological、two-way ANOVA + Tukey、*p<0.05)。HSATII IVT intrinsic + HSATII-CAF-1-CM extrinsic 両方添加で EMT genes 発現が combined increase (ISGs 増加せず、Fig 5D)、内在+外在シグナルが PDAC EMT acquisition に独立的かつ協調的に寄与することを示した。Halo image analysis platform による multiplexed RNA-ISH (137 untreated + 26 FOLFIRINOX-treated PDAC、Fig 5E-H、scale 100 μm、two-sided Mann-Whitney) で HSATII (red) + CD8/CD163 (brown) + EMT RNA-ISH を統合解析、FOLFIRINOX 治療後で % QM of Epi cells in tumor gland が有意低下 (p=2.8×10⁻⁵)、chemotherapy-induced HSATII expression + EMT acquisition の臨床 in situ 証拠を提示した。
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PDAC vs CAFs の divergent response は IRF3依存的: siIRF3 で IFNB1 誘導消失、CAF myCAF gene rescue、PDAC EMT gene rescue (Fig 6A-I、両群で逆方向効果): CAF-1 + HSATII IVT (31.25 fmol low / 250 fmol high) の innate immune signaling immunoblot で TBK1/IRF3/p-IRF3/p-TBK1 活性化を観察 (Fig 6A)、PDAC3 + PDAC6 で同様の time course 応答 (Fig 6B、250 fmol HSATII)。Cytoplasmic/nuclear fractionation で IRF3 核内移行を 3 cell lines (CAF-1/PDAC3/PDAC6) で定量 (GAPDH 細胞質 / Lamin A/C 核 normalize、Fig 6C)。si-Mock / siTBK1 / siIRF3 で IFNB1 induction が siIRF3 で完全消失 (knockdown効率 immunoblot 確認、Fig 6D、two-way ANOVA + Tukey、**p<0.01、***p<0.005)。HSATII response panel (10+ cell lines) で IFN応答強度の異質性を確認 (Fig 6E)。siIRF3 で CAF-1 + CAF-3 の myCAF genes (ACTA2、TAGLN、POSTN、FN1) が HSATII処理下でも有意 rescue (Fig 6F-G、N=2-3 biological、unpaired t-test、p<0.05、p<0.005)。V5-IRF3 overexpression CAF-1 で myCAF gene 発現低下 (Fig 6H、N=3 biological triplicates、IRF3が直接 myCAF identity を抑制)。一方 PDAC3 では siIRF3 で逆に ACTA2/FN1/SERPINE1 (mesenchymal markers) 発現が増加 (Fig 6I、two-way ANOVA + Tukey、**p<0.05、***p<0.005)、PDAC では IRF3 が EMT を抑制、CAFs では myCAF identity を抑制という cell-context-dependent な divergent response を実証した。
考察/結論
本研究は ヒト PDAC で repeat RNAs (LINE-1、HSATII、HERV-K、HERV-H) が単なる “junk DNA transcripts” でなく、EVs を介して細胞間で transfer され viral-like elements として innate immunity (IRF3 経由) を活性化し、PDAC 細胞と CAFs の cellular plasticity (PDAC: EMT、CAFs: myCAF→iCAF transition) を cell-context-dependent に modulate する全く新しいパラダイムを single-molecule spatial transcriptomics で実証した画期的研究である。Repeat RNA-EV-IRF3 軸は PDAC progression における (1) tumor heterogeneity 駆動、(2) immune escape 機構、(3) chemotherapy resistance 獲得、(4) myCAF→iCAF 形成、を統合的に説明する。
先行研究との違い: これまで Chiappinelli et al. Cell 2015 の DNMT阻害剤による endogenous retrovirus (ERV) 発現誘導 + viral mimicry は in vitro エピジェネティック介入下での現象であり、ヒト原発腫瘍の空間的文脈での repeat RNA 発現と機能は不明であった。本研究はこれと対照的に、46 例実臨床 PDAC 検体の 418,224細胞 spatial transcriptomics で repeat RNA の空間分布を初実証した。Boelens et al. CancerRes 2014 や Nabet et al. CancerCell 2017 の breast cancer での stromal-tumor EV crosstalk と異なり、本研究は PDAC 特異的 repeat RNA cargo (HSATII + HERV-K) を介した bidirectional crosstalk (PDAC→CAF と CAF→PDAC) を実証した点で新規。Ting研究室の 2011-2017 報告 (Ting et al. NatGenet 2011 系列) で repeat RNA bulk expression は示されていたが、空間情報と機能的因果関係は本研究で初めて統合された。
新規性: 本研究で初めて (1) ヒトPDAC 46例で repeat RNAs の単一分子 spatial mapping を 418,224 細胞規模で達成、(2) PDAC EVs が viral-like delivery vehicle として repeat RNA を細胞間運搬する novel な mechanism を実証 (anti-CD9 blockade で uptake と downstream 応答阻害)、(3) PDAC と CAFs で IRF3が逆方向の cell state modulator として機能する divergent response paradigm を提示 (siIRF3 が PDAC で EMT を促進・CAFs で myCAF identity を rescue) — これまで報告されていないcell-context-dependent transcription factor の双方向作用、(4) FOLFIRINOX 化学療法 (137+26 例ヒト検体) で HSATII expression + EMT acquisition が in situ で増加し、化学療法後の腫瘍進展との直接相関を実臨床検体で証明。
臨床応用の含意: (a) repeat RNA expression (特に HSATII) を PDAC subtype 分類・予後・化学療法応答 biomarker として活用、(b) IRF3 阻害剤 (例: BX795、MRT67307) による viral mimicry 阻止治療 (PDAC では EMT を促進する可能性に注意)、(c) repeat RNA-targeted antisense oligonucleotide (HSATII-ASO) の創薬、(d) EV uptake blocking (抗CD9抗体) による cell-cell crosstalk 遮断治療、(e) HSATII高発現患者での免疫療法 (PD-1/PD-L1) 応答性予測、(f) bench-to-bedside の流れで、FOLFIRINOX neoadjuvant 後の EMT 加速を repeat RNA mediated mechanism として説明し、化学療法+IRF3 modulator の combination strategy が臨床現場で検討可能、(g) HSATII RNA-ISH を診断 panel に組み込み、tumor heterogeneity および immune microenvironment 評価への応用が期待される。
残された課題: (1) Repeat RNA の selective EV packaging 機構 (RNA binding protein、sequence motif、secondary structure 等) が未解明で、cargo sorting 分子の同定が今後の検討課題、(2) IRF3 以外の innate immune sensors (RIG-I、MDA5、TLR3、ZBP1、cGAS-STING) との関係と冗長性、特に PDAC vs CAF での sensor活用差の解明が残された課題、(3) PDAC治療 (gemcitabine、nab-paclitaxel、PARP阻害剤) と repeat RNA expression dynamics の時系列追跡、(4) repeat RNA-targeted small molecule drug 開発の前臨床 in vivo 検証、(5) マウス PDAC モデル (KPC、KrasG12D/p53R172H) での IRF3 conditional knockout による in vivo cell-context-dependent EMT/myCAF 制御の検証、(6) 他癌種 (大腸・肺・乳癌・前立腺癌) での repeat RNA spatial mapping の横展開、(7) ヒト PDAC organoid + autologous CAF co-culture での IRF3 mechanism の追加検証、(8) ヒト腫瘍内 repeat RNA-IFN axis を標的とする clinical trial 設計、が limitation として残された課題である。
方法
臨床サンプルと空間トランスクリプトミクス: 46例ヒト PDAC 原発切除腫瘍検体 (3 formalin-fixed paraffin-embedded [FFPE] whole-block: B10, C4, D10 + 4 tissue microarrays [TMAs]: TMA1, TMA28, TMA31, TMA32) をMassachusetts General Hospital + Dana-Farber Cancer Institute IRB 承認下で解析。NanoString CosMx Spatial Molecular Imager (SMI) プラットフォームで cyclic in situ hybridization (ISH) probe を使用し、1,000-plex RNA panel (Universal Cell Characterization panel + 5 spike-in genes) + カスタム repeat RNA プローブ (LINE-1 ORF1、LINE-1 ORF2、HSATII、HERV-K、HERV-H) を統合 imaging。Morphology immunofluorescence (PanCK、CD45、CD68) で細胞型同定を補強。418,224細胞 (22 clusters、161 fields of view [FOVs]) を Insitutype algorithm でアノテーション (B Cell、CAF、Endothelial、Macrophage、Mast Cell、Neutrophil、Plasmablast、T Cell、Tumor cells、ductal cells、acinar cells等)。
EV単離と特性評価 (ISEV2018 framework準拠): 患者由来 PDAC cell line (PDAC3、PDAC6) および CAF cell line (CAF-1) の serum-free 培養上清から size-exclusion chromatography (SEC、qEV Izon) で EVを精製。EV characterization は 3 法併用: (1) Nanosight nanoparticle tracking analysis (NTA) で粒子径と濃度 (~100-200 nm、~1×10⁹ particles/mL)、(2) transmission electron microscopy (TEM、uranyl acetate negative stain) で cup-shape形態、(3) immunoblotting で EV surface markers CD63、CD9、Flotillin-1 陽性確認。Total RNA-seq で EV内 repeat RNA composition を principal-component analysis (PCA) で群間比較。
EV機能アッセイ: PDAC3 / PDAC6 由来 EVs (1×10⁹/mL、2 日処理) を CAF-1、PDAC3、PDAC6、THP-1 (マクロファージ)、human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) に投与し、IFNB1 + interferon-stimulated genes (ISGs: ISG15、IFIT1、MX1、OAS1) のRT-qPCR で IFN応答を定量。EV uptake blocking: 抗CD9 抗体 (5 μg/mL、2時間前処理) で EV取り込みを阻害。PKH67 fluorescent labeling で CAF-1 内部 EV uptake を蛍光顕微鏡で可視化。
Repeat RNA 機能解析 (IVT/Dox-inducible): HSATII、HERV-K (env)、LINE-1 (5’UTR、3’UTR) の synthetic in vitro transcribed (IVT) RNAs を作製 (T7 polymerase)、ACTB / GFP mRNAをコントロール。IVT 産物の dsRNA / 5’-triphosphate (5’-ppp) artifact 排除のため: (a) Alexa-fluor 488 (AF488) tagged HSATII で ssRNA structure 確認、(b) 抗dsRNA抗体 (J2) で IF染色 (dsRNA HSATII positive control使用)、(c) Antarctic phosphatase (AnP) 処理で 5’-ppp 除去後にも IFNB1 induction 維持を確認。Doxycycline-inducible HSATII / HERV-K (env) CAF-1株 (pCW57.1 lentiviral vector) も併用。
Single-cell RNA-seq (scRNA-seq): 3 CAF cell lines (CAF-1/2/3) に IVT HSATII ssRNA 31.25-250 fmol を Lipofectamine トランスフェクション、48時間後に 10x Genomics Chromium で 4,595 cells シーケンス、Seurat UMAP clustering で myCAF vs iCAF 状態分析。RT-qPCR で myCAF markers (ACTA2、TAGLN、POSTN、TPM1、FN1) + iCAF markers (IL6、CCL2、SOD2、TNFAIP6、IL11) を定量。
機能アッセイ: (1) Boyden chamber migration assay (CAF-1 ± HSATII IVT、n=6 biological triplicates)、(2) Stressed matrix contraction (SMC) assay で CAF収縮力 (HSATII 31.25 fmol、n=3 biological replicates、collagen gel面積減少%)、(3) Conditioned media (CM) transfer: GFP-CAF-1-CM / HSATII-CAF-1-CM を PDAC3/PDAC6 に添加 → EMT遺伝子 (CDH1、VIM、SNAI1、ZEB1、SERPINE1) RT-qPCR と migration。
IRF3 経路解析: (a) immunoblot で IRF3、TBK1、p-IRF3 (Ser396)、p-TBK1、γH2AX 等の innate immune signaling を時系列追跡 (PDAC3/PDAC6 + HSATII 250 fmol)、(b) cytoplasmic/nuclear fractionation で IRF3 核内移行を定量 (GAPDH = 細胞質マーカー、Lamin A/C = 核マーカー)、(c) si-Mock / siTBK1 / siIRF3 ノックダウンで IFNB1 induction 評価、(d) V5-tagged IRF3 過剰発現 CAF-1 で myCAF gene 発現変化、(e) si-Mock / siIRF3 PDAC3 で ACTA2/FN1/SERPINE1 解析。
FOLFIRINOX 関連解析: 137 例 untreated PDAC + 26 例 neoadjuvant FOLFIRINOX 治療後 PDAC で multiplexed RNA-ISH (HSATII red) + IHC (CD8 / CD163 brown) + EMT RNA-ISH + hematoxylin counterstain。Halo image analysis platform でカラー deconvolutionにより上皮 (Epi) / 間葉 (Mes) marker 比率を quantitative manner (QM) で定量、tumor gland % QM of Epi cells と standard deviation を比較。
統計解析: two-way ANOVA + Tukey’s multiple comparison test、one-way ANOVA + Dunnett’s test、unpaired Student’s t-test、Pearson’s chi-squared test (χ²=6.549, df=1)、two-sided Wilcoxon rank-sum (Mann-Whitney) test、Poisson regression (CAF gene expression vs PDAC proximity)。有意水準 *p<0.05、**p<0.01、***p<0.005。誤差バー mean ± SD または 95% CI。