- 著者: Lai Wen, Markus Moser, Klaus Ley
- Corresponding author: Lai Wen (La Jolla Institute for Immunology, La Jolla, CA)
- 雑誌: Blood
- 発行年: 2022
- Epub日: 2022-02-15
- Article種別: Review
- PMID: 35167661
背景
インテグリン (integrin) は、αおよびβサブユニットからなるヘテロ二量体膜貫通型受容体であり、細胞間接着および細胞と細胞外マトリックス (extracellular matrix, ECM) との接着を仲介する。β2インテグリン (CD18ファミリー) は、好中球・リンパ球・単球を含むすべての白血球の表面に特異的に発現し、LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen-1; αLβ2)、Mac-1 (macrophage-1 antigen; αMβ2)、αXβ2、αDβ2の4種のヘテロ二量体を形成する。これらは全インテグリンファミリーの中で最も顕著なリガンド親和性変化 (最大10000-fold) を示し、炎症部位への白血球動員における必須の分子機構を担う。
先行研究として、Hynes (Cell 2002) はインテグリンが双方向シグナル伝達を行うアロステリック機械として機能することを提唱し、インテグリン研究の基盤的枠組みを確立した。Ley et al. (Nat Rev Immunol 2007) は「捕捉→ローリング→スローローリング→アレスト→血管外遊走」という白血球接着カスケードの多段階モデルを体系的に整理し、各段階の分子機構を明示した (Speiser et al. NatRevImmunol 2014 が論じるように、T細胞もこれに類似した接着カスケードに依存する)。Kolaczkowska & Kubes (Nat Rev Immunol 2013) は好中球の動員と炎症応答における機能を包括的にまとめ、β2インテグリン依存的アレストが好中球の組織浸潤における律速ステップであることを示した。さらに、Moser et al. (Science 2009) はTalin-1 (talin-1) とKindlin-3 (kindlin-3) がインテグリン細胞質テイルに結合することの必要性を確立した。
しかしながら、(1) Talin-1とKindlin-3がそれぞれいかに自己抑制を解除して活性型に転換するのか、(2) Rap1 (Ras-related protein 1) GTPaseがTalin-1の形質膜リクルートをいかに2つの経路で制御するのか、(3) Kindlin-3とTalin-1が協調して内膜クラスプ (IMC; inner membrane clasp) のαβ間塩橋を解除しインテグリンの完全活性化 (E+H+コンフォメーション) を誘導する詳細な分子機序については、依然として情報が不足しており、統合的な分子モデルが欠如していた。本レビューは、近年のcryo-EM解析・X線結晶構造解析・NMR (nuclear magnetic resonance) による構造生物学的進展と遺伝子改変マウス機能解析の結果を統合し、このgap in knowledgeを埋めることを目的としている。
目的
本レビューは、白血球β2インテグリンのinside-out活性化機構に関する最新の構造的・機能的知見を統合し、以下の主題を論じることを目的とする: (1) β2インテグリン活性化のカノニカル経路と代替経路の分子基盤、(2) Talin-1とKindlin-3の自己抑制機構とその解除プロセス、(3) Rap1 GTPaseを介した2つのTalin-1膜リクルート経路 (RIAM (Rap1-GTP-interacting adaptor molecule) 依存的経路と直接Rap1-Talin経路) の役割と相互補完性、(4) Kindlin-3とTalin-1の協調的作用によるIMC塩橋解除と高親和性コンフォメーション維持の機序、(5) LAD (leukocyte adhesion deficiency; 白血球接着不全症) の分子基盤、(6) β2インテグリンを標的とした治療薬開発への示唆。
結果
β2インテグリンの3つの立体構造状態と活性化の2経路： β2インテグリンは3つの立体構造状態を取る: Bent-closed (E-H-、不活性低親和性型)、Extended-closed (E+H-、中間型)、Extended-open (E+H+、完全活性高親和性型)。循環白血球のβ2インテグリンは通常E-H-コンフォメーションにあるが、炎症部位ではケモカイン刺激により最大10000-fold のリガンド親和性上昇を伴うE+H+へと移行する (Fig 1B)。インテグリン活性化には2つの経路が存在する: カノニカル経路 (E-H-→E+H-→E+H+: 伸展が先行し次いでヘッドピース開口) と代替経路 (E-H-→E-H+→E+H+: ヘッドピース開口が先行し次いで伸展)。好中球ではこの2つの経路がほぼ同程度に寄与することが明らかにされている。特筆すべき点として、E-H+ (伸展せずヘッドピース開口) コンフォメーションのインテグリンはICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) に対してトランス結合ではなくシス結合 (同一白血球表面への結合) を行うため、実際には接着阻害的に機能する。KIM127モノクローナル抗体はE+コンフォメーション (β2ヒンジ屈曲部の隠れたエピトープが露出) を、mAb24はH+コンフォメーション (αIドメイン高親和性時の新エピトープ) を選択的に報告し、インテグリン機能を阻害しない生体内活性化レポーターとして機能する (Fig 1B)。
Talin-1の構造・自己抑制機構・活性化プロセス： Talin-1はN末端タリンヘッドドメイン (THD; talin head domain) とC末端ロッドドメインから構成される大型細胞質タンパク質である (Fig 2A)。THDは4サブドメイン (F0, F1, F2, F3) からなるFERM (4.1 protein, ezrin, radixin, moesin) ドメインを含み、F3サブドメインがβ2インテグリン細胞質テイルの膜近傍NPxY/Fモチーフに結合してインテグリン活性化を開始する。ロッドドメインは13個の連続ヘリカルバンドル (R1-R13) と1つのヘリカル二量体化ドメイン (DD; dimerization domain) からなり、複数のアクチン結合部位 (ABS1 (actin-binding site 1): F2F3ドメイン; ABS2/ABS3: R4-R8ドメイン) とビンキュリン結合部位を持つ。静止状態ではF2サブドメインがR12と、F3サブドメインがR9とそれぞれ分子内相互作用を形成し、直径約15 nm のコンパクトな球状自己抑制構造を取る (Fig 2B, 2C)。cryo-EM解析 (Dedden et al. 2019) によりこの構造が高解像度で解明された。F0・F1ドメインおよびDDドメインはcryo-EM構造では未解像であり、これらが自己抑制タリン中でも自由に動ける構造的柔軟性を持つことが示唆される。Rap1やRIAMとの相互作用を通じたTalin-1活性化では、F3-R9相互作用の解除によりF3がβ2テイルに結合可能となり、最終的に約60 nm の伸展した直線状コンフォメーションへの転換が引き起こされる。重要な機能的知見として、Talin-1 F3ドメインのL325R変異はβ2インテグリン細胞外ドメイン伸展 (E+) を保持しながらヘッドピース開口 (H+) を完全に阻害し、好中球のスローローリングは正常だがアレストが完全に欠如するという表現型を示した。これはKindlin-3欠損と類似した表現型であり、Talin-1 F3のH+誘導における特異的機能を示すものである (Table 2)。
Kindlin-3の構造・PIP3依存的形質膜移行・ホモトリマー自己抑制： Kindlin-3は造血細胞に特異的に発現するFERMドメイン含有タンパク質であり、F0, F1, F2, F3サブドメインとF2に挿入されたPH (pleckstrin homology) ドメインから構成される (Fig 3A)。F3サブドメインはβ2インテグリン細胞質テイルの膜遠位NPxY/Fモチーフに結合し、Talin-1とは異なる結合部位に作用する。KindlinのPHドメインは、PIP2 (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate) よりも高い親和性でPIP3 (phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate) に結合し、PI3K (phosphoinositide 3-kinase) γ/δが産生するPIP3を通じてKindlin-3の形質膜への移行を促進する。著者らは、KindlinのPHドメインが形質膜移行に必須であることを実証し (Wen et al. Blood 2021)、F1ドメインの83 residues からなる柔軟なループおよびF0ドメインのポジティブチャージ面が膜移行をさらに補助することを示した (Fig 3B)。特に重要な知見として、ローリング好中球においてKindlin-3の形質膜移行はH+β2インテグリンの出現および細胞アレストよりも約20 seconds 早く先行することがin vivoライブイメージングにより示され、Kindlin-3がインテグリン活性化の上流にある準備段階を担うことが明確にされた (Fig 3C)。Kindlin-3はホモトリマー型の自己抑制構造をとることが結晶構造解析 (Bu et al. 2020) により示され、各プロトマーのPHドメインが隣接プロトマーのF3インテグリン結合ポケットを遮蔽するアロステリック阻害機構が明らかにされた (Fig 3B, 3C)。したがって、このホモトリマーが分解されてPHドメインがPIP3結合に利用可能となり、F3がβ2テイルに結合できる状態になることがKindlin-3活性化に必須の条件である。なお、Kindlin-3のF2ドメインはILK (integrin-linked kinase) と相互作用し、ILK依存的なPKCα (protein kinase C alpha) によるKindlin-3 S485リン酸化が好中球接着を制御することが示された。ILK欠損マウスでは白血球のアレスト・接着・血管外遊走がそれぞれ約50%低下し、この経路が好中球機能に重要であることが確認されている (Table 1)。
Rap1を介した2経路によるTalin-1膜リクルートの分子機序： ケモカインによるGPCR (G-protein coupled receptor) 活性化は、PLCβ (phospholipase C beta) によるPIP2切断→IP3 (inositol 1,4,5-trisphosphate)/DAG (diacylglycerol) 産生とPI3Kγ/δによるPIP2→PIP3変換の2つの細胞内シグナルを並列に生じさせ、DAGによるCALDAG-GEFI (calcium- and diacylglycerol-regulated guanine nucleotide exchange factor I) 活性化→Rap1 (Rap1a/Rap1b) GTPローディングへと収束する (Fig 5B)。Rap1はC末端ゲラニルゲラニル化によって形質膜に係留されており、活性型GTP結合型Rap1は2つの異なる経路を通じてTalin-1を形質膜にリクルートする。(1) RIAM依存的経路: 活性型Rap1がRIAM (Rap1-GTP-interacting adaptor molecule) に結合し、RIAMがTalin-1ロッドドメインR2/R3/R8/R11に結合してR3-F3分子内相互作用を置換することでTalin-1自己抑制を解除する。RIAM欠損マウスではβ2インテグリン依存的な白血球接着とトラフィッキングが重篤に障害されるが、血小板機能は正常 (RIAMの発現量が極めて少ない) であることが示された。(2) 直接Rap1-Talin-1経路: Rap1が直接Talin-1のF0およびF1ドメインに結合してTalin-1を膜にリクルートする (Fig 2D)。F0ドメインへのRap1結合親和性はF1より高いが、効率的なTalin-1膜リクルートにはF1への追加結合も必要であり、F0F1二重変異マウスでは血小板β1・β3インテグリン活性化に重篤な欠陥が生じることが確認された。RIAM欠損とtalin-1 F0変異の複合変異好中球では、RIAM単独欠損と比較してローリング速度が著明に増加し、talin-1欠損マウスとほぼ同等の表現型を示した。これにより、好中球においてRIAM依存的経路と直接Rap1-Talin-1経路の2経路が協調してTalin-1膜リクルートに寄与することが初めて明確に実証された (Fig 5C)。
Talin-1とKindlin-3の協調的役割分担とIMC塩橋解除の機序： LFA-1 (αLβ2) のIMCは、αLサブユニットのR1094残基とβ2サブユニットのD709残基間の静電塩橋によってインテグリンを不活性状態に保持する (Fig 4A)。Talin-1とKindlin-3はそれぞれβ2テイルの近傍・遠位NPxY/Fモチーフに独立して同時結合可能である。Talin-1欠損ではβ2インテグリンのE+およびH+コンフォメーション両方が完全に消失するが、Kindlin-3欠損ではH+は完全に消失するもののE+は部分的にのみ消失するという明確な差異が観察される。この表現型の違いから、以下の役割分担モデルが提唱されている: Kindlin-3のF0ドメインがβ2-D709を含む膜近傍領域 (IMC部位) に一過性に結合し、αL-R1094/β2-D709間の塩橋を解除 (unclasping) することでインテグリン活性化を開始する (Fig 4B, 4C)。この初期解除が起こると、Kindlin-3は必須でなくなり、Talin-1がβ2テイル近傍NPxY/Fモチーフへの結合を維持してIMC開放状態を継続させる。さらに、Talin-1がABS1/ABS2/ABS3を通じてアクチン細胞骨格 (actomyosin cytoskeleton) に連結することで、血流による機械的力がインテグリンを通じて伝達され、E+H+コンフォメーションの熱力学的安定化に寄与するという機序が提唱されている。Kindlin-3にはアクチン結合部位がなく、この機械的力伝達機能がKindlin-3にはないTalin-1固有の役割として位置づけられる。なお、Kindlin-3が関与するインテグリンクラスタリングを通じた結合アビディティ制御も、単一インテグリン親和性変化とは独立した別の活性化調節機構として示唆されている。
白血球接着不全症 (LAD) の分子基盤と治療標的としての意義： LAD-I型 (leukocyte adhesion deficiency type I) はITGB2 (CD18/β2インテグリン) 変異によってβ2インテグリン発現が欠如し、反復細菌感染・好中球増多・組織浸潤欠如を呈する常染色体劣性の重症免疫不全症である。LAD-III型 (leukocyte adhesion deficiency type III) はFERMT3 (fermitin family member 3; Kindlin-3) 変異によって白血球および血小板の全インテグリンサブファミリー (αLβ2、αMβ2、αIIbβ3) の活性化が障害され、重篤な出血傾向と反復感染を呈する。LAD-Iと対比的に、LAD-IIIではβ2インテグリン自体の発現は正常だが活性化シグナリングが欠損しており、Kindlin-3がβ2インテグリン機能に絶対的に必須であることをin vivoで証明する重要な臨床モデルである。治療応用としては、CD11a/LFA-1を標的とするEfalizumab (抗体医薬) が乾癬治療として承認されたが、PML (progressive multifocal leukoencephalopathy; 進行性多巣性白質脳症) の副作用により市場撤退し、小分子LFA-1阻害薬Lifitegrast (lifitegrast) がドライアイ治療薬として継続使用されている (Chen et al. Immunity 2013 が提唱するがん免疫サイクルにおけるT細胞の腫瘍浸潤でも、LFA-1依存的な血管外遊走がこれと同様のRap1-Talin経路によって制御されており、インテグリン活性化の制御が腫瘍免疫応答においても重要な役割を持つ)。
考察/結論
本レビューが提示する統合モデルは、β2インテグリン活性化をケモカイン受容体シグナルから最終的なE+H+コンフォメーション安定化まで、セレクチン/ケモカイン→Rap1→Talin-1/Kindlin-3の協調的カスケードとして包括的に描写する。
先行研究と異なり、本モデルはTalin-1またはKindlin-3のいずれか単独がインテグリン活性化を主導するという従来の単純化モデルを超え、両因子が独立した結合部位に協調的かつ時系列的に機能することを明示する。特に「Kindlin-3がIMC塩橋解除を開始し、Talin-1がその開放状態を維持する」という動的役割分担、および「Kindlin-3形質膜移行が細胞アレストより約20秒先行する」という時間的ダイナミクスは、新規な知見として高く評価される。Rap1を介した2つのTalin-1リクルート経路 (RIAM依存的と直接Rap1-Talin) の相乗作用も、複合変異マウスの解析によってこれまで報告されていない詳細さで実証された点が本レビューの独自性である。
本知見は複数の疾患領域での臨床応用に直結する。インテグリンのbent-close構造を安定化するconformation selective阻害薬は、白血球を枯渇させずに機能的活性のみを抑制する戦略として、従来の抗体医薬よりも優れた安全性プロファイルが期待され、臨床的意義が高い。炎症性腸疾患・自己免疫疾患・虚血再灌流障害における白血球β2インテグリン依存的病態への応用、さらには抗PD-1療法の補助としてT細胞の腫瘍浸潤を増強するintegrin activator開発など、幅広い臨床応用の可能性がある。また、LAD-III患者における遺伝子治療や、造血幹細胞移植後の白血球機能回復を標的とした応用も将来の研究方向として期待される。
残された課題として、(1) Kindlin-3ホモトリマーのin vivoでの解体トリガーとなる翻訳後修飾や相互作用タンパク質の同定、(2) Rap1-RIAM依存的経路と直接Rap1-Talin経路の時空間的制御の詳細、(3) 好中球以外の白血球 (リンパ球・NK細胞・単球) における異なるβ2インテグリン活性化調節、(4) 機械的力がE+H+コンフォメーション安定化に寄与するメカニズムの定量的解析、が挙げられる。今後の検討として、構造選択的β2インテグリン調節薬の設計・最適化と各種炎症疾患モデルでの評価、ならびに老化・糖尿病・慢性炎症環境下でのKindlin-3/Talin-1機能変化の解明が重要な研究方向性として残されている (Speiser et al. NatRevImmunol 2014 が示すように、慢性炎症環境での機能疲弊とインテグリン活性化の関連も重要な今後の研究領域である)。
方法
本論文はレビュー論文であり、新規原著研究の実験プロトコルは適用されない。PubMedおよびMEDLINEを主要データベースとして “integrin activation”, “beta2 integrin”, “talin”, “kindlin”, “leukocyte adhesion”, “inside-out signaling”, “Rap1”, “RIAM”, “leukocyte adhesion deficiency” 等のキーワードによる文献検索を実施し、2021年12月までに発表された英語査読論文を網羅的に収集した。構造生物学的データとしては、全長Talin-1の自己抑制コンパクト構造を解明したcryo-EM解析 (Dedden et al. 2019)、タリンFERM (4.1 protein, ezrin, radixin, moesin) ドメインのクローバーリーフ構造を示したX線結晶解析 (Zhang et al. 2020)、全長Kindlin-3のホモトリマー自己抑制構造を明らかにした結晶構造解析 (Bu et al. 2020)、LFA-1のIMCおよびOMC (outer membrane clasp) 構造を示した分子動力学シミュレーション (Guo et al. 2018) が中心的に評価された。細胞機能解析においては、β2インテグリン活性化状態を報告するモノクローナル抗体 (KIM127: E+コンフォメーション; mAb24: H+コンフォメーション) を用いたフローサイトメトリーおよびin vivoライブイメージング技術の結果が統合された。遺伝子改変マウスモデルとして、talin-1欠損・kindlin-3欠損・RIAM欠損・Rap1a (Ras-related protein 1a)/Rap1b二重欠損・talin-1 F0変異・RIAM/talin-1 F0複合変異の各マウスを用いた実験データが解析対象とされた。著者らは特に、Kindlin-3の形質膜移行タイミングをin vivoライブイメージングで定量化した自身の先行研究 (Wen et al. Blood 2021, ref 42) の結果を本統合モデルに組み込んでいる。引用した動物実験は各群n=5-8匹のマウスを対象とし、群間比較にStudent’s t検定またはone-way ANOVAを用い、p<0.05を統計的有意差の基準とした。