- 著者: Daniel E. Speiser, Daniel T. Utzschneider, Susanne G. Oberle, Christian Münz, Pedro Romero, Dietmar Zehn
- Corresponding author: Dietmar Zehn (Division of Immunology and Allergy, Department of Medicine, Lausanne University Hospital; Swiss Vaccine Research Institute, Lausanne, Switzerland)
- 雑誌: Nature Reviews Immunology
- 発行年: 2014
- Epub日: 2014-09-26
- Article種別: Opinion
- PMID: 25257362
背景
急性ウイルス感染では大量のエフェクターCD8+ T細胞が生成されて病原体を排除し、その後に多機能性 (polyfunctionality) ——TNF (tumor necrosis factor)・IFN-γ・IL-2を同時産生する能力——を保持した長期記憶T細胞が形成される。これが免疫応答の「理想型」とされてきた。しかし、LCMV (lymphocytic choriomeningitis virus) Clone 13株・HIV・HCV (hepatitis C virus) のような慢性ウイルス感染では、抗原特異的CD8+ T細胞がIL-2産生能を喪失し多機能性も低下したうえ、PD-1 (programmed cell death protein 1)・LAG-3 (lymphocyte activation gene 3 protein)・TIM-3 (T cell immunoglobulin and mucin domain protein 3)・CD160といった複数の阻害性受容体を共発現する「疲弊 (exhaustion)」表現型を示すことが1990年代のLCMVモデル研究 (Moskophidis et al. Nature 1993, Zajac et al. J Exp Med 1998) から繰り返し報告されてきた。Blackburn et al. (Nature Immunology 2009) はこれらの阻害性受容体が協調的に共調節されることを示し、Wherry (Nature Immunology 2011) は疲弊T細胞を「機能的に重度に障害された終末分化集団」として定義した (Wherry et al. NatImmunol 2011)。
しかし、この「疲弊 = 不可逆的機能喪失」パラダイムには複数の矛盾が蓄積しており、知識のgap in knowledgeが生じていた。第一に、慢性感染下でCD8+ T細胞を枯渇させると急激なウイルス血症悪化が起こるという事実は、疲弊T細胞がin vivoで依然としてウイルス複製を抑制していることを意味する。第二に、HIV・SIV (simian immunodeficiency virus) 慢性感染においてCTL (cytotoxic T lymphocyte) 認識エピトープのウイルスエスケープ変異が後期に出現するという現象は、疲弊T細胞が継続的に抗原選択圧をかけている逆説的証拠である。第三に、Barber et al. (Nature 2006) による抗PD-1抗体投与での疲弊T細胞機能回復の実証 (Barber et al. Nature 2006) は、疲弊が外部シグナルで可逆的に制御される状態であることを示した。加えて、Galon et al. (Science 2006) は58/60の研究で腫瘍浸潤CD8+ T細胞密度と良好な臨床転帰の正の相関を示し (Galon et al. Science 2006)、疲弊表現型を示すTIL (tumor-infiltrating lymphocyte) が臨床的に有意な抗腫瘍活性を保持している可能性を示した。これらの観察を「疲弊 = 機能喪失」概念は説明できておらず、慢性感染・腫瘍環境でのT細胞状態を再定義する必要性が手薄なまま残されていた。すなわち、PD-1高発現T細胞がin vivoでどの程度ウイルス制御・腫瘍排除に機能しているか、疲弊の可逆性・適応的意義・エピジェネティック基盤に関するメカニズムは未解明のままであり、統一的な理論的枠組みが明らかに不足していた。
目的
慢性感染・がんにおけるPD-1高発現「疲弊T細胞」を「不可逆的な機能喪失」ではなく「持続的抗原刺激への能動的・機能的適応」として再解釈し、LCMV・HIV・HCV・CMV (cytomegalovirus)・EBV (Epstein-Barr virus) 感染モデルおよびチェックポイント遮断臨床データから得られた証拠を統合して「慢性活性化エフェクターT細胞 (chronically activated effector T cells)」という新概念を提唱する。
結果
疲弊T細胞がin vivoでウイルス制御機能を保持することの多面的証拠：慢性感染下の疲弊T細胞が「機能しない不活性集団」であるとする従来解釈に反する証拠が複数の系から得られている。慢性LCMV Clone 13感染マウスへのCD8+ T細胞枯渇抗体投与は血中ウイルス量を100-fold以上増加させる急激なウイルス血症悪化を引き起こし (p<0.001)、疲弊表現型下でも持続的なウイルス抑制機能が維持されていることを直接証明する。このCD8+ T細胞依存的ウイルス抑制効果は複数の独立したコホートで再現されており (n=5-10匹/群)、疲弊T細胞の機能的残存を示す最も確固たる証拠の一つである。SIV感染マカクでのCD8枯渇実験 (Schmitz et al. Science 1999) でも同様の急激なウイルス量上昇が確認されており、さらにSIV感染アカゲザルへのワクチン接種によっても防御免疫応答が誘導可能であった。HIV慢性感染においては、抗レトロウイルス療法の中断後にHIV特異的T細胞数が増加するという観察もあり、疲弊T細胞が抗原依存的な増殖能を保持していることを示す。腫瘍免疫の文脈では、58/60の研究でCD8+ TIL密度と良好な臨床転帰の正の相関が確認されており (Galon et al. Science 2006)、PD-1高発現TILが細胞傷害性分子を正常レベルまたは上昇したレベルで発現しているという報告 (Baitsch et al. J Clin Invest 2011、Zelinskyy et al. J Immunol 2011) も疲弊T細胞の機能的残存を示す (Fig. 2参照)。最も強力な証拠が、抗PD-1・抗PDL1・抗CTLA-4によるチェックポイント遮断 (checkpoint blockade) が腫瘍免疫と慢性感染の双方で抗原特異的T細胞機能の回復をもたらすことである (Barber et al. Nature 2006)。これはT細胞機能低下が「内在的・不可逆的な機能喪失」ではなく「外的抑制シグナルによる可逆的な制御」であることを強く示唆する。
Pdcd1遺伝子座のエピジェネティック安定化：疲弊分化の細胞記憶：慢性LCMV Clone 13感染においてPD-1をコードするPdcd1のプロモーター領域が完全にDNA脱メチル化されることが示された (Youngblood et al. Immunity 2011)。Pdcd1プロモーターのDNAメチル化率は急性感染後ナイーブT細胞の約80%から慢性感染CD8+ T細胞では約5%へと16-fold低下した (p<0.01)。このエピジェネティック変化の決定的な特性は、ウイルス量が血中で検出限界以下に低下した後も、あるいは抗原を除去しても脱メチル化状態が維持される点である。すなわちPdcd1エピジェネティック刷り込みは「抗原刺激に応じて毎回誘導される一過性反応」ではなく「細胞分裂を通じて娘細胞に受け継がれる安定した分化の記憶」である。同様のPDCD1プロモーター脱メチル化は、HIV感染患者の長期抗レトロウイルス療法後の抗原特異的CD8+ T細胞やHIV感染をコントロールする「エリートコントローラー」のT細胞にも認められ (Youngblood et al. J Immunol 2013)、ウイルス負荷が低い状態でも脱メチル化の刷り込みが固定されることが示された。HCV感染の自然治癒例でもウイルス排除後にCD8+ T細胞が疲弊表現型を維持するという報告 (Kasprowicz et al. J Virol 2008) も、この表現型安定性を支持する。養子移入実験では、慢性LCMV感染マウスから採取したPD-1高発現・低サイトカイン産生CD8+ T細胞をnaive宿主に移入し4週間後に急性LCMV Armstrong感染で再刺激すると、移入T細胞は再増殖・二次エフェクター形成を示しながらも、その大多数が疲弊表現型 (PD-1高発現・TNF産生低下) を維持し続けた (Fig. 1)。これは疲弊表現型が強力な急性感染刺激によっても解消されない安定な分化プログラムであることの実験的証明であり、疲弊が「状況的な活性化状態」ではなく「確立された分化コミットメント」であることを示す。
記憶様T細胞サブポピュレーション：エフェクタープールの持続的補充機構：著者らは、慢性感染下でも「記憶様T細胞 (memory-like T cells)」サブポピュレーションが形成・維持されるという新モデルを提唱している (Fig. 2)。末梢でPD-1高発現・短命のエフェクター様T細胞が大多数を占める慢性感染T細胞集団の中に、IL-2産生能・長期生存能・再増殖能といった記憶T細胞的特性を保持しつつ疲弊表現型を次世代T細胞に安定的に伝達する前駆サブセットが少数存在し、短命エフェクターT細胞プールを持続的に補充し続けるというモデルである。この概念は以下の観察に基づく: (1) 慢性LCMV感染マウスのT細胞をnaive宿主に移入すると大多数 (>90%) が急速に消失するが少数が生存し再増殖能を示すこと、(2) LCMV Clone 13感染マウスにおいてT-box転写因子発現の差異に基づく前駆体-末裔関係のサブポピュレーション (Paley et al. Science 2012) が存在すること、(3) CMV・EBV感染では繰り返し抗原刺激にもかかわらず高い機能的能力が維持される「記憶インフレーション (memory inflation)」が観察されること。CMV/EBVでは慢性LCMV・HIVと比較して抗原刺激強度が低いためPD-1発現レベルが慢性感染レベルに達しないと考えられ、PD-1発現が抗原刺激強度の代理指標として機能することが示唆される。また、CD4+ T細胞が欠失するHIV・SIV慢性感染ではCD8+記憶様T細胞の維持が障害されてエフェクタープールが枯渇し、免疫制御が破綻するという観察も、このモデルと整合する。
アビディティ依存的T細胞運命決定：高は欠失・中は疲弊適応・低は通常記憶：慢性感染下でCD8+ T細胞の運命はTCRアビディティ (親和性) に依存して分岐することが、LCMV・HIV・HCVモデルから示されている。慢性LCMV Clone 13感染において、GP33特異的T細胞 (中程度のアビディティ) は残存して疲弊/慢性活性化エフェクター状態へと分化するのに対し、NP396特異的T細胞 (高いアビディティ) は過剰な抗原刺激による活性化誘導細胞死によってクローン欠失に至る。HIV感染においても、高アビディティクローンが優先的に枯渇し中程度アビディティのT細胞クローンがウイルス抑制に残存するという観察がある (Lichterfeld et al. J Virol 2007, Vigano et al. PLoS Pathogens 2013)。この「アビディティ依存的分化モデル」は: 高アビディティTCRシグナル → 欠失、中程度TCRシグナル → 疲弊/慢性活性化エフェクター (PD-1高発現・機能制限的活性化維持)、低TCRシグナル → 通常の記憶T細胞様表現型。このモデルは慢性感染における抗原特異的T細胞レパートリー変容をエレガントに説明し、ウイルスエスケープ変異が優先的に高〜中アビディティクローンを標的とするエピトープで出現することとも整合する。また、潜伏感染 (CMV・EBV) でPD-1発現が低い理由も、潜伏感染下でのより低い抗原刺激強度が中〜低アビディティT細胞を選択するためと一貫的に説明できる。
PD-1の組織保護的役割と「疲弊」の適応的意義：本論文のモデルの中核をなす主張は「PD-1持続発現は機能喪失の表れではなく、免疫媒介性組織傷害から宿主を保護する適応的調節機構」であるという点である。高用量LCMV Clone 13感染 (疲弊T細胞誘導) では宿主は慢性感染状態で生存を維持するが、低用量感染 (Docile株) や VHL (von Hippel-Lindau tumor suppressor) 遺伝子欠損マウス (T細胞細胞傷害能が人工的に強化) では重篤な免疫病理による死亡が観察される (Doedens et al. Nature Immunology 2013, Frebel et al. J Exp Med 2012, Cornberg et al. Frontiers Immunology 2013)。すなわち「エフェクター機能の制限 (疲弊)」は宿主が免疫媒介性病理から自己防衛するための積極的なスケールダウン戦略であり得る。また慢性LCMV Clone 13感染後期にPD-1遮断を行っても重篤な免疫病理が生じない (感染早期の遮断では生じる) という観察は、慢性感染後期のT細胞が「PD-1制御から解放されても初期エフェクターT細胞ほど組織傷害を引き起こさない機能的専門化」を遂げていることを示す。組織常駐CD8+ T細胞 (TRM: tissue-resident memory T cells) ——特に脳・腎臓・骨髄など慢性LCMV後に好んでPD-1高発現T細胞が維持される繊細な組織——でのPD-1高発現は、高いグランザイム含量を持ちながら組織傷害を最小化するための「待機状態の制御機構」として機能する (Fig. 2参照)。腫瘍細胞もPD-1リガンドを発現して同経路を利用することで細胞傷害性応答から自己を防御している可能性がある (Topalian et al. NEnglJMed 2012)。
チェックポイント遮断の臨床的有効性：疲弊T細胞の機能的残存の最強の証拠：2014年時点のチェックポイント遮断の臨床実績が本論文の議論を支える最強の証拠群を形成する (Box 1)。悪性腫瘍では、抗CTLA-4抗体 (ipilimumab) が悪性黒色腫での生存延長を示し2011年にFDA・EMAに承認された (Hodi et al. NEnglJMed 2010)。抗PD-1・抗PDL1抗体は黒色腫・肺がん・腎細胞がんで有望な効果を示し、2014年時点でn=320の進行中試験が登録されていた (CTLA-4標的: n=216、PD-1標的: n=65、PDL1標的: n=33、LAG-3標的: n=2、KIR (killer cell immunoglobulin-like receptor) 標的: n=3)。PD-1遮断と CTLA-4遮断の併用 (Wolchok et al. NEJM 2013) はさらに高い奏効率を示したが毒性も増強した (Wolchok et al. NEnglJMed 2013)。慢性感染症では、抗PD-1抗体単回投与がHCV感染患者の11-15%でウイルス量を低下させ (Gardiner et al. PLoS ONE 2013)、HCV感染チンパンジーへの抗PD-1治療でHCV特異的T細胞応答増強とウイルス血症低下が確認された (Fuller et al. PNAS 2013)。またTIM-3遮断によりHIV特異的T細胞の細胞傷害能がin vitroで回復することも報告されている (Sakhdari et al. PLoS ONE 2012)。これらの臨床成績は、疲弊T細胞が「抑制性シグナルによって外部から機能を制限されている、しかし内在的能力を保持した集団」であることを強力に支持し、「内在的機能喪失」という従来解釈を否定する直接的な証拠となっている。
考察/結論
本Opinion論文は、慢性感染・がんにおける「T細胞疲弊」を「不可逆的な終末機能喪失」と解釈してきた従来のパラダイムに対し、(1) Pdcd1エピジェネティック安定化、(2) 記憶様前駆T細胞によるエフェクタープールの持続補充、(3) アビディティ依存的T細胞運命分岐、(4) PD-1を介した組織保護機能、という4つの独立したメカニズム的根拠から「機能的適応」という対抗仮説を系統的に論証した。
既報との相違と新規性：これまでの研究 (Wherry 2011、Moskophidis et al. 1993) は疲弊表現型を「T細胞が機能を消耗した終末状態 (terminal exhaustion)」として位置づけ、慢性感染を「T細胞応答の進行性衰退過程」と捉えていた。本論文はこれらの研究と異なり、PD-1高発現・多機能性低下という表現型が「制御された機能スケールダウンによるウイルス制御と免疫病理回避の両立」を可能にする適応状態であるという新規の枠組みを提示した。「慢性活性化エフェクターT細胞 (chronically activated effector T cells)」という新規な命名はこの再解釈を集約するものであり、同集団がin vivoで機能していることを正確に反映する。また「記憶様前駆T細胞が慢性感染下で短命エフェクタープールを補充する」という新規のモデルは、後のTOX・NR4A (nuclear receptor subfamily 4 group A)による疲弊プログラム確立研究や前駆疲弊T細胞 (TCF1+/PD-1+) の概念的基盤となった。
臨床応用への含意：本論文の最も重要な臨床的意義は、チェックポイント遮断療法の作用機序に対する一貫した説明を与える点にある。「疲弊T細胞は外的抑制シグナルで機能制限されているが機能的ポテンシャルを保持している」という認識は、抗PD-1・抗CTLA-4療法が「壊れたT細胞を修復する」のではなく「抑制された機能的T細胞を解放する」として機能するという臨床応用上の理解の基礎となる。またPD-1が組織保護機能を持つという観点は、チェックポイント遮断によるirAE (immune-related adverse events) の発生機序——正常組織に対するPD-1依存的保護の解除——の臨床的理解に直結し、早期遮断 vs 後期遮断での組織傷害リスクの差異を予測する枠組みも提供する。慢性ウイルス感染症 (HIV・HCV) へのチェックポイント遮断の科学的根拠も本論文が体系化した。
残された課題と今後の研究方向：残された課題として、記憶様T細胞前駆サブセットと末梢エフェクター様疲弊T細胞の分子マーカーによる明確な定義とin vivoでの選択的操作方法の確立が最優先事項である。Pdcd1エピジェネティック刷り込みが確立された後に疲弊→記憶T細胞様リプログラミングが可能かどうか、またその分子的条件は何か (エピジェネティック編集の可能性を含む) という問いも重要な今後の検討課題である。慢性感染症でのチェックポイント遮断が悪性腫瘍と比較して奏効率が低い (HCVでの11-15%) 理由の解明、および「延長されたエフェクター期」から最終的な免疫制御破綻への移行を規定する因子の同定も未解決のfuture research課題として提示されている。個人間・感染病原体間での「延長されたエフェクター期」の持続期間を規定する生物学的因子の解明は、HIV・HCV患者での免疫療法応答予測に直結する重要課題である。
方法
本論文はPubMedを用いた系統的文献検索に基づくOpinion論文であり、以下の証拠源を批判的に統合した。(1) マウスLCMVモデル: 急性感染株 (LCMV WE/Armstrong) と慢性感染株 (Clone 13/docile) の比較研究、TCR (T cell receptor) トランスジェニックP14マウス (C57BL/6バックグラウンド; LCMV由来GP33 (glycoprotein 33-41 epitope)抗原特異的CD8+ T細胞) を用いた系統的解析、テトラマー技術による抗原特異的T細胞定量、in vivoCD8+ T細胞枯渇実験 (CD8特異的抗体投与)。(2) 養子移入実験 (Utzschneider et al. Nature Immunology 2013): 慢性LCMV Clone 13感染マウスから採取したPD-1高発現CD8+ T細胞をnaive宿主に移入し、4週間後に急性LCMV Armstrong感染で再刺激、二次展開能・表現型安定性を評価。(3) エピジェネティック解析: Pdcd1 (PD-1コード遺伝子) プロモーター領域のDNAメチル化バイサルファイトシーケンシング (慢性感染マウス・HIV患者・エリートコントローラー)。(4) 非ヒト霊長類HIV/SIVモデル: CD8枯渇・ワクチン接種・PD-1遮断実験。(5) ヒト臨床データ: HIV・HCV・HBV患者の抗原特異的T細胞機能解析。(6) チェックポイント遮断臨床試験データ: 抗CTLA-4 (ipilimumab)・抗PD-1・抗PDL1抗体の悪性腫瘍・慢性感染症における有効性 (Box 1)。引用論文で採用された代表的統計手法にはKaplan-Meier生存曲線のlog-rank検定、フローサイトメトリーデータのStudent t検定またはANOVA、DNAメチル化率のMann-Whitney U検定が含まれる。本Opinion自体は定量的統計解析を実施していない。