- 著者: Hiroshi Ueki, Yuriko Tomita, Calvin Duong, Hiromichi Mitake, Maki Kiso, Yuri Furusawa, Dongming Zhao, et al., Yoshihiro Kawaoka
- Corresponding author: Yoshihiro Kawaoka (University of Wisconsin-Madison)
- 雑誌: Cell
- 発行年: 2026
- Epub日: 2026-07-09
- Article種別: Original Article (Resource)
- PMID: 42302780
背景
インフルエンザA型ウイルス (IAV: influenza A virus) は年間季節性流行と時に世界的大流行 (パンデミック) を引き起こす重要なRNA (ribonucleic acid: リボ核酸) ウイルスであり、公衆衛生と経済に深刻な影響を与える。IAVは8セグメントのRNAゲノムを持ち、ヘマグルチニン (HA)・ノイラミニダーゼ (NA) の表面糖タンパク質と、ポリメラーゼ複合体 (PB1 [polymerase basic protein 1: ポリメラーゼ塩基性タンパク質1] /PB2/PA)・核タンパク質 (NP) からなるウイルスリボヌクレオプロテイン複合体で構成される。宿主の細胞機構を全サイクルで利用するウイルスの特性から、宿主因子の同定は治療標的探索の観点で重要である。これまでに複数のゲノムワイドRNAi (RNA interference: RNA干渉) スクリーニングが行われ、数百の候補ヒト遺伝子が同定されてきた (Konig et al. 2010; Watanabe et al. 2014; Tripathi et al. 2015)。しかしながら、in vitro細胞培養での結果と全身モデルでの in vivo 病態の乖離が著しく、多くの宿主因子候補は生体内での機能的関連性が未解明のまま残されており、全動物モデルによる体系的なin vivo検証が長年にわたり未検証のまま手が及ばなかった。特に性差による宿主反応の相違はin vitro系では評価不能という限界があった。このような in vitro と in vivo の知識ギャップを埋めるための体系的な全動物モデルスクリーニング基盤は本研究以前には存在しなかった。
目的
インフルエンザA型ウイルス感染における宿主因子を生理的に妥当な文脈で体系的にスクリーニングするため、CRISPR-Cas9を用いた遺伝子改変マウスライブラリーを構築し、in vivo 感染実験により保護効果を与える宿主因子を同定する。さらにその保護機構を個別に解析し、治療標的としての有望性を評価する。
結果
マウスライブラリー構築のための多段階スクリーニング戦略と84系統樹立 (Table 1-3)： 候補遺伝子の選定は3段階で実施した (Fig. 1)。まず先行interactome研究 (Watanabe et al.) から323遺伝子、meta-analysis (Tripathi et al.) から101遺伝子を収集し、重複38遺伝子を含む合計386候補遺伝子を同定した (Table 1)。次に致死性チェックにより生存に必須な遺伝子を除外し290遺伝子に絞り込んだ。第3ステップとしてマウスL929細胞 (ATCC CCL-1、線維芽細胞由来; n=3 independent experiments) をインフルエンザA型ウイルスA/WSN/33 (H1N1) で感染させ、siRNAスクリーニング (各遺伝子の平均ウイルス力価減少 ≥ 10倍 [1 log10] を hit 基準) を実施し、148遺伝子が感染に関与する候補として選定された (Table 2)。これら148遺伝子を対象にC57BL/6J バックグラウンドでフレームシフト変異または大欠失を導入するCRISPR-Cas9法を用いて系統樹立を試み、84系統の遺伝子改変マウスの樹立に成功した: ホモ接合体45系統、ヘテロ接合体39系統 (n=40 F2 mice以上でホモ未取得の系統をヘテロとして使用) (Table 3)。各系統はPCRとSanger配列決定で変異導入を確認した (Table S3)。
in vivo スクリーニングによる17保護宿主因子の同定 (Table 4-5)： 84系統のマウスを致死量 (3 MLD50: 50%致死量の3倍) のパンデミック株インフルエンザA型ウイルス mouse-adapted A/California/04/2009 (H1N1) (MA-CA04) で感染させ、感染後14日間の生存率・体重変化を観察した。保護効果の指標として enhanced protective efficacy (EPE: 拡張保護効率 %) = 遺伝子改変マウス生存率 − 対応野生型 (WT) マウス生存率 を算出した。高信頼性候補基準 (平均EPE ≥ 25%、かつ試験 n ≥ 2回) に基づき17遺伝子を同定した (Table 5)。雌マウスでは Arhgef28 (RGNEF; 平均EPE 65.0%)、Lasp1 (62.5%)、Nelfb (50.0%)、Slc2a12 (45.0%)、Dapk2 (42.5%)、Gprasp2 (33.3%)、Ncapd3 (39.5%)、Psmd2 (27.5%) が顕著な保護効果を示した。雄マウスでは Lasp1 (70.0%)、Hspb1 (51.7%)、Cnih4 (46.3%)、Ncln (37.5%)、Arhgef28 (31.8%)、Cd81 (31.7%)、Igf2bp2 (31.3%)、Ppm1g (30.0%)、Cirbp (29.0%)、Bzrap1 (27.5%)、Myl6 (25.0%) が基準を満たした。このような性差による宿主因子の違いはin vitro研究では検出不可能であった。
Arhgef28 (RGNEF) と Lasp1 (LASP1) の保護機構の解析 (Fig. 2)： 両性で強い保護効果を示した Arhgef28 と Lasp1 の詳細な機構を解析した。まずイムノブロット解析により、各遺伝子改変マウスの肺組織ライセートでRGNEFおよびLASP1タンパク質バンドの消失を確認し、完全ノックアウトを実証した (Fig. 2A)。次に MLD50値を雌雄別に測定した (Fig. 2B): Arhgef28 遺伝子改変マウスの MLD50 は雄 3,162.2 PFU vs 野生型 421.7 PFU (約7.5-fold向上)、雌 237.1 PFU vs 野生型 56.2 PFU (約4.2-fold向上) であった。Lasp1 遺伝子改変マウスの MLD50 は雄 4,217.0 PFU vs 野生型 316.2 PFU (約13.3-fold向上)、雌 562.3 PFU vs 野生型 237.1 PFU (約2.4-fold向上) であった。ウイルス複製への影響を評価するため、感染後3日目 (3 dpi) および6日目 (6 dpi) の肺ホモジネートのウイルス力価を測定した (Fig. 2C): Arhgef28 遺伝子改変マウスでは3 dpiで肺ウイルス力価が有意に低値を示し (野生型と比較)、6 dpiでは有意差消失。対照的に Lasp1 遺伝子改変マウスでは3・6 dpiいずれも肺ウイルス力価に有意差なく (野生型と同程度)、生存率向上にもかかわらずウイルス複製量は変化しないという乖離が認められた。組織病理学的解析では、Arhgef28・Lasp1 遺伝子改変マウスともに3・6 dpiで気管支周囲・肺胞・血管周囲への炎症細胞 (好中球・マクロファージ主体) 浸潤が認められた (Fig. S2A/B)。Lasp1 遺伝子改変マウスでは6 dpiの血管周囲への免疫細胞浸潤が野生型より減少傾向 (統計的有意差なし)。免疫組織化学解析では全系統でウイルス抗原が気管支上皮・肺胞上皮・マクロファージに検出された。
考察/結論
先行研究ではゲノムワイドsiRNAスクリーニングがin vitro細胞系で実施され数百の宿主因子候補が同定されてきたが、全動物モデルでの体系的検証プラットフォームは存在しなかった。本研究はそれらの先行研究と異なり、初めて84系統のCRISPR-Cas9遺伝子改変マウスライブラリーを構築し系統的なin vivo感染スクリーニングを可能にした点が新規な基盤として評価される。本研究で初めて17遺伝子の欠損がインフルエンザA型ウイルス感染に対して保護効果をもたらすことをin vivoで実証した。
RGNEFとLASP1は対照的な保護機構を示す: Arhgef28 (RGNEF: Rho guanine nucleotide exchange factor) 欠損は感染早期 (3 dpi) の肺内ウイルス複製を有意に抑制し、MLD50を雄で約7.5倍向上させることから、RGNEFがウイルス複製に必要なプロウイルス的役割を担うことが示唆された。RGNEFはRhoAを活性化してアクチン細胞骨格の動態・細胞接着・運動性を制御するGEF (guanine nucleotide exchange factor: グアニンヌクレオチド交換因子) であり、NAタンパク質との相互作用を介して新生ウイルス粒子の細胞内輸送・放出を促進すると推測される。これと異なり、Lasp1 (LIM and SH3 domain protein 1) 欠損は肺ウイルス複製を変化させないにもかかわらず生存率を向上させることから、直接的なウイルス複製制御とは独立した新規な保護機構——炎症応答の修飾や組織障害の軽減——が示唆される。in vitro のL929細胞ではLASP1ノックダウンがウイルス複製を減弱させたことから、この乖離は細胞種による役割の差異を反映している可能性がある。
臨床的有用性の観点から、本研究で同定された17遺伝子は「drugable host factor (薬剤標的可能宿主因子)」として将来の抗インフルエンザ薬開発の候補を提供する。特にウイルスの変異による薬剤耐性が問題となるHA・NA・ポリメラーゼを標的とする既存薬と異なり、宿主因子を標的とする治療法は耐性変異リスクが原理的に低く、異なるIAVサブタイプや他のウイルスに対しても有効である可能性がある。さらに本ライブラリーは研究コミュニティに共有されるオープンリソースとして、インフルエンザ以外のウイルス感染研究にも応用可能な汎用プラットフォームとなる。
残された課題として、第一に今回ライブラリーに含まれなかった遺伝子や、致死性のため除外された必須遺伝子の解析がある。今後の検討として条件的ノックアウト技術の活用が必要である。第二に性差による宿主因子の差異の分子機序の解明——雌雄で重複しつつも異なる保護遺伝子セットが同定されたことは、性ホルモン・免疫系・ウイルス病理の複雑な相互作用を反映する可能性があり、性差医学的観点からも重要である。第三に17遺伝子が保護をもたらすメカニズムの多くは未解明であり、それぞれの宿主因子がウイルスライフサイクルのどのステップに関与するかの系統的解析が必要である。
本研究はAltae-Tran et al. Science 2021のCRISPR多様性研究と対照的に、CRISPR-Cas9の実用的な in vivo 機能解析プラットフォームとしての汎用性を実証する重要な事例である。またWilkinson et al. AnnuRevBiochem 2020が明らかにしたスプライシング因子もウイルス感染との関連で本ライブラリーに含まれており、横断的な分子生物学的知見の集積が将来の治療戦略に資すると期待される。さらにCheruiyot et al. NatGenet 2026が示した炎症性サイトカインによる細胞依存性の変化は、IAV感染後の免疫炎症応答で宿主因子の役割が動的に変化しうることを示唆し、本ライブラリーで同定された保護遺伝子の解釈にも関連する。
方法
研究デザイン: 多段階スクリーニング → CRISPR-Cas9マウス樹立 → in vivo 感染スクリーニングの段階的アプローチ。実験動物はすべてC57BL/6J背景 (Jackson Laboratory, stock #000664)。in vitro実験にはマウスL929細胞 (ATCC CCL-1) を使用。
in vitro スクリーニング: マウスL929細胞を使用。ウイルスはインフルエンザA/WSN/33 (H1N1) を感染多重度 (MOI) を調整して使用。siRNA処理後にRT-qPCRでウイルス複製を定量 (各遺伝子にsiRNA IDと特異的qPCRプライマー対を設計、Table 2に全配列掲載)。判定基準: 陰性対照比でウイルス力価 ≥ 10倍 (≥ 1 log10) 減少。
CRISPR-Cas9マウス樹立: フレームシフト変異を誘発する guide RNA設計で初期エクソンまたはエクソン間大欠失を導入。変異確認: 標的ゲノム領域のPCR増幅後Sanger配列決定 (全84系統の詳細はTable S3)。ホモ接合体判定: n ≥ 40 のF2マウスを個体識別・遺伝子型解析。
in vivo 感染実験: マウス適応パンデミック株 MA-CA04 (A/California/04/2009 H1N1) を使用 (臨床的関連性重視; A/WSN/33は神経向性あり除外)。感染量: 3 MLD50 (50%致死量の3倍)。評価期間: 感染後14日間 (毎日生存率・体重変化モニタリング)。統計: EPE (Enhanced Protective Efficacy) = 遺伝子改変マウス生存率 - WT生存率、複数回試験の平均EPE算出 (各試験のWTはそれぞれ個別設定)。高信頼性基準: 平均EPE ≥ 25%かつ試験 n ≥ 2回。
MLD50算出: 段階希釈ウイルス液を雌雄別に接種し、Reed-Müench法で50%致死量を推定。
ウイルス力価測定: 3 dpiおよび6 dpiに肺をホモジナイズ、プラーク形成アッセイで力価を定量 (PFU/mL)。
組織病理学・免疫組織化学: 3 dpi・6 dpiに肺組織を採取し、HE染色で炎症評価、抗ウイルス抗体免疫染色でウイルス抗原分布を確認。炎症スコアは気管支周囲・肺胞・血管周囲領域別に評価した (Fig. S2A/B)。統計はt検定またはMann-Whitney検定等(非パラメトリック) を用いた。