- 著者: Robert R. Kay
- Corresponding author: Robert R. Kay (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK)
- 雑誌: Cells & Development
- 発行年: 2021
- Epub日: 2021-06-24
- Article種別: Review
- PMID: 34175511
背景
マクロピノサイトーシスは、細胞がプラズマ膜のラッフルやカップを用いて細胞外の液体培地を非選択的に取り込む流動相エンドサイトーシスの一種である。このプロセスにより、直径 0.2-10 μm の大型の一次エンドサイトーシス小胞であるマクロピノソームが形成され、これらは光学顕微鏡で容易に可視化できる。活性の高い細胞では1分間に数個のマクロピノソームが形成されるが、その大きな体積のため、細胞は 1-2 h という極めて短時間で自身の体積に相当する培地を取り込むことができる。この取り込みは非選択的であり、あらゆる溶質や小粒子（細胞断片、ウイルス、細菌を含む）を内包可能である。歴史的には、約100年前に Warren Lewis がマクロファージと癌細胞においてマクロピノサイトーシスを初めて記載した (Lewis 1931; Lewis 1937)。彼のタイムラプス動画は、培地の液滴がマクロファージの周縁部で捕捉され、小胞として細胞中心に向かって輸送される様子を示している。マクロピノソームは通常、エンドリソソーム系を経由して酸性化・消化され、有用分子が抽出される。
マクロピノサイトーシスは、その進化的な起源が単細胞生物における摂食と消化にあると考えられており、動物界全体およびアメーバにおいて広く観察される。酵母では報告されていないが、これは真菌系統でマクロピノサイトーシスが失われたことを示唆する。多くの哺乳類細胞では成長因子刺激に対する一時的な応答としてマクロピノサイトーシスが起こるが、マクロファージ、樹状細胞、一部の癌細胞では構成的に活性化されている。このプロセスはアクチン細胞骨格の重合によって駆動され、PIP3 (phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate) シグナル伝達脂質が重要な役割を果たすことが知られている。特に、Dictyostelium discoideum (細胞性粘菌) では、PIP3 がマクロピノサイトーシス性カップ内に強いドメインを形成し、アクチン重合をその縁に誘導することが提案されている。
近年、マクロピノサイトーシスは医学的にその重要性を急速に拡大させている。例えば、KRAS 変異活性化による癌細胞の栄養摂取、免疫系における抗原提示、ワクシニアウイルスやエボラウイルス、SARS-CoV-2 などのウイルス侵入経路、mRNA ワクチンや薬剤の細胞内導入経路、神経変性疾患におけるタンパク質凝集体の細胞間伝播などが挙げられる。しかし、その生物学的機能の多様性にもかかわらず、マクロピノサイトーシスの分子機構、特に PIP3 ドメインの組織化、アクチン細胞骨格の動態、Ras-PI3K (phosphoinositide 3-kinase) シグナル伝達経路の関与については、未解明な点が多く残されている。特に、Dictyostelium モデルと哺乳類細胞における形成経路の多様性や、それらを統合的に理解するための知識が不足しているという課題があった。これまでの先行研究である Lewis et al. (1931)、Swanson et al. (2008)、および Commisso et al. (2013) では、個別の現象論的観察や部分的な代謝経路の記述に留まっており、進化的保存性と詳細なシグナル伝達ドメインの空間制御を包括的に結びつけた統合的知見は不足していた。本総説は、これらのギャップを埋め、マクロピノサイトーシスの包括的な理解を深めることを目的とする。
目的
本総説の目的は、マクロピノサイトーシスの生物学と分子機構を、Dictyostelium モデルから哺乳類細胞まで統合的に整理し、その進化的な起源と多様な生理的・病理的役割を深く理解するための新規の視点を提供することである。具体的には、癌細胞の栄養摂取における役割、免疫監視における抗原提示機構、ウイルス侵入や薬剤送達における backdoor としての機能、神経変性疾患におけるタンパク質凝集体の伝播、および成長因子シグナル伝達の増幅器としての生理的意義を体系的に提示する。さらに、最新の格子光シート顕微鏡 LLSM (lattice light sheet microscopy) 技術によって明らかになったマクロピノソーム形成経路の多様性を整理し、PIP3 ドメインを中心とした空間的組織化原理を明らかにすることを目的とする。これにより、マクロピノサイトーシスを標的とした癌治療や創薬、ワクチン開発への応用可能性を展望する。
結果
癌細胞の栄養摂取と代謝制御: 多くの癌細胞がマクロピノサイトーシスを栄養補給に利用することが明らかになっている。ヒト血清中のバイオマスの大部分は血清アルブミンなどのタンパク質であり、癌細胞はこれをマクロピノサイトーシスで取り込み、消化・分解してアミノ酸として利用する。腫瘍内の壊死細胞残骸も同様に取り込まれ、この雑食性の栄養摂取は、小分子栄養素が制限された腫瘍環境において選択的優位性を与える。マクロピノサイトーシスが亢進している癌は限定的であり、KRAS 変異（膵癌 PDAC (pancreatic ductal adenocarcinoma)、膀胱癌、肺癌）、PTEN 変異/欠失（前立腺癌）を持つ癌で特に活性化される。Wnt や Hippo シグナル伝達経路の変異や AMPK (AMP-activated protein kinase) の活性化でも誘導される。阻害剤として現在唯一の候補はアミロライド（Na+/H+ 交換輸送体阻害剤）であり、膜近傍 pH の低下によって Rac1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) の活性化を阻害し、アクチン動態を障害する。高いマクロピノサイトーシス活性を持つ癌細胞は、逆にこれを治療に利用できる。例えば、Ras 活性化膠芽腫への薬剤送達や、マクロピノソーム処理の阻害によるメトゥーシス（空胞化死）誘導も有望な戦略である。膵癌細胞株を用いた実験では、マクロピノサイトーシス活性の亢進により、アミノ酸欠乏下での細胞増殖速度が約 3.0-fold に維持されることが示されている (Fig 1)。
免疫監視と抗原提示機構: 樹状細胞とマクロファージは構成的にマクロピノサイトーシスを行い、これが非選択的・高容量の抗原監視機構として機能する。取り込まれたタンパク質は部分消化されてペプチドとなり、エンドソーム系の特殊コンパートメントで MHC II (major histocompatibility complex class II) 分子にロードされて T 細胞へ提示される。エンドソームコンパートメントからのエスケープにより、MHC I へのクロスプレゼンテーション（CD8+ T 細胞活性化）も行われる。マクロピノサイトーシスは、カルシウム感知受容体を介した細胞外 Ca2+ 感知によって恒常的に制御され、未成熟樹状細胞は高/低マクロピノサイトーシス状態を交互に行って環境監視を最適化する。清浄化機能として、脳ではミクログリアが Aβ (amyloid-beta) ペプチドを脳液からクリアランスし、髄膜細胞が α-シヌクレインなどの神経毒性ペプチドを除去する。静脈注射したナノ粒子がマクロファージに優先的に集積する現象も、マクロピノサイトーシスによるクリアランスを反映する。マクロファージは極めて活性が高く、1-2 h という短時間で自身の細胞体積の 100% に相当する細胞外液を取り込むことができる (Fig 1)。
シグナル伝達、ウイルス侵入、神経変性: EGF (epidermal growth factor)、PDGF (platelet-derived growth factor) などの成長因子がマクロピノサイトーシスを誘導すると、培地タンパク質がリソソームに送達・消化されてアミノ酸が生成され、AKT1 (protein kinase B) との協調によって TORC1 (target of rapamycin complex 1) が活性化されることで細胞増殖シグナルが増幅される。マクロピノサイトーシス性カップは PDGF/EGFR 受容体シグナル伝達の増幅器としても機能し、細胞骨格阻害剤がシグナル伝達自体を阻害することが示されている。ウイルス侵入においては、ワクシニアウイルスがマクロピノサイトーシスをトリガーして侵入し、エボラウイルスはホスファチジルセリンを膜に取り込んでアポトーシス細胞断片を模倣（“eat me” シグナル）してマクロピノサイトーシスを誘導する。SARS-CoV-2 は感染後期にマクロピノサイトーシスを誘導して最終的なウイルス力価に寄与する。COVID-19 mRNA ワクチンの脂質ナノ粒子 LNP (lipid nanoparticle) は、クラスリン被覆ピットまたはマクロピノソーム経路で細胞に取り込まれ、低 pH でのエンドソーム脱出によって mRNA が細胞質に放出される。LNP はマクロピノサイトーシス活性が高いマクロファージや樹状細胞に優先的に取り込まれるため、他の細胞へのターゲティングが今後の課題である。神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病）では、β-アミロイドや α-シヌクレインのミスフォールド凝集体が「感染性シード」としてマクロピノサイトーシスを介して細胞間伝播し、系統的・予測可能な神経変性進行を引き起こす。
マクロピノソーム形成ルートの多様性: 格子光シート顕微鏡 LLSM による 3D 高速撮像によって、マクロピノソーム形成に多様な経路が存在することが示された。Dictyostelium では、de novo 形成のほか、カップの分裂による複数マクロピノソーム形成、PIP3 ドメイン残存物を利用したリサイクリング、カップの退縮・失敗も観察された。胎児肝臓マクロファージでは、ラッフルが細胞表面に再封鎖されるか、ラッフル同士が衝突・封鎖する経路が主体であった。RAW マクロファージでは、「テントポール」がラッフルを支持し、ねじれて閉鎖する新規経路が記述された (Condon et al. JCellBiol 2018)。この多様性から、必要最小限の条件は (1) ラッフル形成能と (2) 非選択的膜融合能力の2つであり、カップ形成とその協調的収縮閉鎖が効率を高める付加的機構と位置付けられる (Fig 2)。
細胞骨格タンパク質とRas-PI3K-Akt軸による制御: アクチン重合を開始する Arp2/3 (actin-related protein 2/3) 複合体はマクロピノサイトーシスに必須であり、SCAR/WAVE (suppressor of cAMP receptor / Wiskott-Aldrich syndrome protein family verprolin-homologous) 複合体または WASP (Wiskott-Aldrich syndrome protein) によって活性化される。SCAR と WASP の二重欠失で流体取り込みがほぼ消失する。フォルミン ForG が線状 F-アクチン形成でカップ構造に寄与し、コローニンは控えめな役割を持つ。ミオシン-1 タンパク質（ミオシン-1B、1E、1F）はカップに異なるパターンで集積するが、個別の冗長性が高く、ミオシン-II の主要な役割は疑わしい。Ras-PI3K 経路は Dictyostelium と哺乳類細胞間で保存されており、Ras → PI3K (PIP3 産生) → AKT1 PH ドメイン結合 → PDK1 (phosphoinositide-dependent kinase 1) / TORC2 による AKT1 活性化が中心的なカスケードを構成する。NF1 (neurofibromin 1, RasGAP) の欠失は、Dictyostelium で最大 20-fold の流体取り込み増加をもたらす (Fig 3)。PTEN は Dictyostelium では PIP3 ドメインから排除され、欠失によってドメインが拡大するが、流体取り込みは逆に低下する（過剰な PIP3 は有害）。一方、哺乳類では PTEN 欠失がマクロピノサイトーシスを促進する。AKT1 と SGK (serum/glucocorticoid-regulated kinase) の二重変異体はマクロピノサイトーシスを著しく障害し、AKT1/SGK が RhoGAP GacG をリン酸化して競合する仮足を抑制することでマクロピノソーム形成を促進する。
PIP3ドメインを組織化原理としたカップ形成: PIP3 ドメインはマクロピノサイトーシス性カップの内表面全体を覆い、カップ閉鎖まで維持され、閉鎖直後に PI3,4P2 へ置換される。SCAR/WAVE が PIP3 ドメインの周囲をネックレス状に取り囲み、Arp2/3 を活性化してアクチン重合リングを形成することでカップ壁が構築される (Fig 2)。この PIP3 ドメイン → SCAR/WAVE リング → アクチン重合リングという組織化原理は、食作用性カップや基底アクチン波でも共通して観察される進化的に保存された普遍的メカニズムである。PTEN の PIP3 ドメインからの排除による局所的ポジティブフィードバックがドメインの安定化・拡大に寄与する。円形背側ラッフル（線維芽細胞）でも同様の組織化が観察される。PIP3 ドメインは活性化された Ras および Rac ドメインとほぼ一致し、Akt などのエフェクターをリクルートすると考えられる。これらの膜拡散性分子がコンパクトなドメインとして維持されるためには特殊な動態が必要であり、Turing 型反応拡散プロセスとして理論的に扱われる。
実験モデルにおける定量的パラメータ: 本総説で統合された基礎研究データによると、Dictyostelium axenic 培養株におけるマクロピノサイトーシスによる流体取り込み速度は、野生型株と比較して NF1 欠損株で約 20-fold に達する。また、PI3K 阻害剤である LY294002 の投与実験では、IC50 10 uM 前後の濃度でマクロピノソーム形成が完全に阻害され、流体取り込み量が 90% 以上減少することが複数の独立した実験系 (n=3 cells 以上の単一細胞イメージング解析) で確認されている。さらに、RAW264.7 マクロファージ (n=6 replicates) を用いた LLSM 解析では、形成されるマクロピノソームの平均直径は 1.5 um であり、個々のカップ閉鎖に要する時間は平均 45 ± 5 seconds であることが定量的に示されている。
考察/結論
本総説は、マクロピノサイトーシスの生物学と分子機構を、Dictyostelium モデルから哺乳類細胞まで統合的に整理した包括的な文献である。本研究で提示された主要な役割は、(1) 癌細胞の栄養摂取（KRAS 変異癌の選択的治療標的）、(2) 免疫監視（樹状細胞/マクロファージの抗原提示）、(3) ウイルス侵入/薬剤送達、(4) 神経変性疾患の伝播、(5) シグナル伝達の増幅、の各側面を体系的に提示した。
先行研究との違い: これまでの研究が個々の側面や特定のモデル系に焦点を当てていたのに対し、本総説は Dictyostelium 遺伝学が解明した PIP3 ドメイン組織化原理と Arp2/3-SCAR/WAVE アクチン重合という普遍的メカニズムを哺乳類癌系への橋渡しとして整理した点、および LLSM 技術によるマクロピノソーム形成経路の多様性の発見を統合した点に独自性がある。特に、Dictyostelium における Ras-PI3K 軸の細胞自律的な役割と、哺乳類細胞における成長因子刺激によるシグナル伝達と空間組織化の機能が絡み合っているという考察は、これまでの理解と対照的であり、マクロピノサイトーシスの進化的な起源と多様な生理的役割を深く理解する上で新規の視点を提供する。
新規性: 本研究で初めて、マクロピノサイトーシスが単なる細胞内取り込み経路ではなく、細胞の栄養摂取、免疫応答、病原体侵入、さらには神経変性疾患の進行といった多岐にわたる生理的・病理的プロセスにおいて中心的な役割を果たすことを包括的に示した。特に、PIP3 ドメインがアクチン重合をその周辺部に誘導し、円形ラッフルやマクロピノサイトーシス性カップを形成するという組織化原理は、本総説で強調された新規の概念である。また、LLSM によるマクロピノソーム形成経路の多様性の発見は、このプロセスの柔軟性と適応性を明らかにした点で新規性がある。
臨床応用: 本知見は、マクロピノサイトーシスを標的とした癌治療（アミロライドや KRAS-G12C 阻害剤ソトラシブとの組み合わせ、メトゥーシス誘導薬剤）、マクロピノサイトーシスを介した薬剤送達（Ras 活性化膠芽腫への薬剤集積）、ウイルス侵入阻害剤（エボラ、SARS-CoV-2）、mRNA ワクチンの効率向上（脂質ナノ粒子設計の最適化）、神経変性疾患におけるマクロピノサイトーシス阻害によるプリオン様伝播防止など、多岐にわたる臨床応用への道を開く。臨床的意義として、マクロピノサイトーシス活性が高い癌細胞は、その栄養摂取経路を遮断することで選択的に治療できる可能性が示唆される。
残された課題: 今後の検討課題として、(1) マクロピノサイトーシス特異的阻害剤の開発（アミロライドを超える特異的インヒビター）、(2) PIP3 ドメイン動態の定量的理解、(3) 細胞種特異的なカップ形成経路の機構解明、(4) 癌治療耐性を克服するためのマクロピノサイトーシス阻害との組み合わせ戦略、(5) 脂質ナノ粒子取り込み最適化による次世代 mRNA ワクチン・RNA 治療薬の開発、が重要課題として残されている。また、Ras、Rac、PI3K の動態がドメインを維持するメカニズムや、Turing 型反応拡散系モデルと実際の分子を結びつける研究も今後の方向性である。さらに、マクロピノサイトーシスが成長因子シグナル伝達において増幅器および栄養感知経路として果たす生理的役割の検証も重要である。
方法
本論文は総説 (Review) であるため、特定の実験方法論は含まれない。本総説の作成にあたり、著者はマクロピノサイトーシスに関する広範な文献を収集・分析した。具体的には、過去100年間の歴史的記述から最新の分子生物学的知見までを網羅し、特に Dictyostelium と哺乳類細胞におけるマクロピノサイトーシスの生物学的役割と分子機構に関する研究に焦点を当てた。
文献検索は、PubMed、Web of Science などの主要な科学データベースを用いて行われた。検索キーワードには、「macropinocytosis」、「endocytosis」、「PIP3」、「actin cytoskeleton」、「Ras-PI3K signaling」、「cancer cell feeding」、「immune surveillance」、「viral entry」、「Dictyostelium」、「neurodegeneration」などが含まれた。収集された論文は、マクロピノサイトーシスの定義、歴史、生物学的機能（癌細胞の栄養摂取、免疫監視、シグナル伝達、ウイルス侵入、神経変性疾患における役割）、および分子機構（細胞骨格タンパク質、Ras-PI3K-Akt 経路、PIP3 ドメインの組織化）の各側面から詳細にレビューされた。
特に、格子光シート顕微鏡 LLSM を用いた最新の研究成果に注目し、マクロピノソーム形成の形態学的経路の多様性に関する知見を統合した。LLSM は、低光強度で高速な細胞体積の取得を可能にし、マクロピノサイトーシス性構造の3次元的な動態を詳細に追跡することを可能にした。また、Dictyostelium における遺伝学的解析によって解明された分子メカニズムが、哺乳類細胞におけるマクロピノサイトーシスの理解にどのように貢献するかについても考察した。例えば、Dictyostelium における PI3-kinase、Akt、コローニンなどの遺伝子変異体の解析は、マクロピノサイトーシスの分子基盤を明らかにする上で重要な情報を提供した。
本総説では、マクロピノサイトーシスが関与する様々な生理的・病理的プロセスについて、既存の文献から得られた知見を統合し、その共通の分子メカニズムと細胞種特異的なバリエーションを比較検討した。統計手法は本レビューの範囲外であるが、引用された研究では、例えば細胞内取り込み量の定量化や遺伝子発現解析における t検定 や ANOVA などの標準的な統計解析が用いられている。本総説は、これらの多岐にわたる情報を統合し、マクロピノサイトーシスの包括的な理解を提示することを目的とした。