- 著者: Paul Scholz, Jared Thompson, Kadin T. Crosby, Torsten Fauth, Nathan M. Krah, Grant Schlauderaff, Robin Back, Zachary A. Berkheimer, Alivia Jolley, Dirk Sombroek, Rebekka Medert, Christian Zurek, Oleg Dmytrenko, Emily Wilson, Friso T. Schut, Jared Rutter, Xiaoyang Zhang, Michael Krohn, Ryan N. Jackson, Chase L. Beisel, Yang Liu
- Corresponding author: Paul Scholz (Akribion Therapeutics GmbH); Ryan N. Jackson (Utah State University); Chase L. Beisel (Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research); Yang Liu (University of Utah School of Medicine)
- 雑誌: Nature
- 発行年: 2026
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- PMID: 42092133
背景
ゲノム配列や転写プロファイルに基づいて、特定の標的細胞を選択的に除去する技術は、基礎研究、医学、バイオテクノロジー、農業などの幅広い分野において極めて重要である。細菌や古細菌の獲得免疫システムに由来するCRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated proteins) システムは、RNA誘導型の核酸分解活性を利用して、標的配列を持つ細胞を排除する対抗選択ツールとして広く利用されてきた。例えば、従来の報告である Cong et al. (2013) によれば、Cas9やCas12aは標的DNAに二本鎖切断を導入することで細菌を死滅させることができる。また、先行研究である Abudayyeh et al. (2016) では、Cas13aが標的RNAを認識した際に周囲のRNAを無差別に分解するコラテラル活性を示し、細菌の休眠を誘導することが報告されている。しかし、これらのシステムを真核細胞における選択的細胞除去に応用する試みには、大きな制限が存在していた。真核細胞においては、Cas9やCas12aによるdsDNA (double-stranded DNA、二本鎖DNA) 切断は、HDR (homology-directed repair、相同組換え修復) やNHEJ (non-homologous end joining、非相同末端結合) といった強力なDNA修復機構によって効率的に修復されてしまうため、単一の遺伝子座の切断だけでは細胞死を誘導できない。また、Cas13を用いたRNA分解活性も、真核細胞においては標的転写産物のノックダウンに留まり、選択的な細胞除去や細胞死を誘導するには不十分であることが Abudayyeh et al. (2017) により知られていた。このように、真核細胞において転写産物をトリガーとして特異的かつ確実に細胞を排除する手法は確立されておらず、技術的な「不足」が指摘されていた。近年、新規のタイプV CRISPRヌクレアーゼであるCas12a2が同定され、標的RNAを認識すると無差別なdsDNA分解活性を解放し、細菌においてSOS DNA損傷応答と細胞休眠を誘導することが Dmytrenko et al. (2023) や Bravo et al. (2023) などの既報で示された。しかし、このCas12a2のRNA誘発型無差別dsDNase活性が、真核細胞においてどのような挙動を示すか、また細胞死を誘導できるかについては全くの「未解明」であり、真核生物におけるプログラム可能な細胞排除ツールとしての実用性には大きな「課題」と「knowledge gap」が残されていた。
目的
本研究の目的は、新規CRISPRヌクレアーゼであるCas12a2のRNA誘発型無差別dsDNase (double-stranded DNase、二本鎖DNA分解酵素) 活性が、真核細胞 (酵母およびヒト細胞) において大規模なDNA損傷を介した細胞死を誘導できるかを検証することである。具体的には、Sulfuricurvum sp. 由来のSuCas12a2およびメタゲノム由来のGeCas12a2という2つのバリアントを用い、標的RNAの認識に伴う細胞排除能を定量的に評価する。さらに、このシステムを応用し、HPV (human papillomavirus、ヒトパピローマウイルス) 感染細胞の選択的除去、遺伝子編集が失敗した未編集細胞の排除による編集細胞の富化、および肺がんなどで極めて重要な致死性オンコジーンであるKRAS G12C変異を有するがん細胞の特異的排除が可能であるかを実証し、転写プロファイルに基づく新しい真核細胞排除テクノロジーとしての有用性を確立することを目指す。
結果
酵母におけるRNAトリガー型細胞排除の原理実証: 酵母モデルにおいて、非必須遺伝子であるADE2転写産物を標的としたGeCas12a2の活性を検証した。GeCas12a2とADE2標的gRNAを導入した結果、非標的gRNA導入条件と比較して、形成されたコロニー数が134-fold減少するという極めて強力な細胞排除効果が確認された (n=3 replicates) (Fig. 1c)。この効果は、相同組換え修復のためのDNA修復テンプレートを共導入した場合でも同様であり、修復テンプレートによる逃避コロニーの出現は認められなかった。これに対し、従来のDNA切断型ヌクレアーゼであるFnCas12aを用いた対照実験では、修復テンプレート存在下でのコロニー減少効果は4-foldに留まり、生存したコロニーの90%においてHDRによる標的部位の修復とADE2不活性化が確認された (Fig. 1c)。この対照的な結果は、Cas12a2が標的RNAの認識をトリガーとして無差別なDNA分解を引き起こすことで、局所的なDNA修復機構を完全に無効化し、真核細胞を確実に排除できることを示している。
ヒトがん細胞における標的転写産物依存的な効率的細胞除去: 次に、ヒトがん細胞におけるCas12a2の細胞除去能を評価した。GFP (green fluorescent protein、緑色蛍光タンパク質) を安定発現するHeLa-GFP細胞に対し、GFP転写産物を標的とするGeCas12a2 RNPを導入したところ、導入5日後において非標的RNP群と比較して86%の顕著な細胞枯渇が達成された (n=6 replicates) (Fig. 1f)。同一のGFP標的部位に対してRNA分解酵素であるLbuCas13a RNPを導入した実験では、細胞除去効率は37%に留まり、GeCas12a2の細胞排除能が極めて優れていることが示された (Fig. 1g)。さらに、メラノーマ、肺がん、頭頸部がん由来の4つの細胞株において、発現レベルが異なる6つの内在性転写産物 (KRAS-PAN、EGFR、TP53、CD8A、MALAT1、GAPDH) を標的とした場合でも、RNP濃度依存的な細胞除去が確認された (Fig. 1h)。また、LNPを用いてGeCas12a2 mRNAとgRNAを共送達した場合でも、標的依存的な細胞排除が再現され、多様な送達モダリティでの有効性が実証された (Fig. 1i)。
細胞死の機序解明：大規模dsDNA損傷からアポトーシス経路の活性化: Cas12a2による細胞排除がdsDNA切断と細胞死誘導に基づいているかを検証するため、HeLa-GFP細胞を用いて詳細な細胞生物学的解析を行った。GFPまたはGAPDH転写産物を標的としたGeCas12a2の導入により、dsDNA切断の指標である53BP1 fociの数が、非標的群やビヒクル群と比較して5.2-fold以上増加することが確認された (n=3 replicates) (Fig. 2c)。この損傷レベルは、臨床的に用いられるDNA損傷誘発性抗がん剤であるシスプラチンやエトポシド処理時と同等であった。細胞周期解析では、G1期細胞の割合が2.5-fold減少し、有糸分裂カタストロフやアポトーシスの特徴であるsub-G1期および>4Nの異常なDNA量を持つ細胞集団が出現した (Fig. 2e)。さらに、導入48時間後において、アポトーシスマーカーであるannexin V陽性およびcaspase-3/7活性陽性の細胞がそれぞれ約40%に達した (Fig. 2f,g)。RNA-seq解析およびGSEAの結果からも、アポトーシス経路やTNF-α/NF-κBを介した炎症性応答経路の有意な活性化が示され、Cas12a2が大規模なゲノムDNA損傷を介して主にアポトーシスを誘導することが明らかとなった (Fig. 2h)。
オフターゲット活性の厳格な検証とミスマッチ耐性の評価: Cas12a2の臨床応用において懸念されるオフターゲット活性について検証した。GFPを特異的に標的とするgRNAを用いた場合、GFPを発現しない野生型HeLa細胞 (HeLa wt) では53BP1 fociの増加やdsDNA損傷、細胞枯渇は一切観察されなかった (Fig. 3a,b)。また、共導入したdsODNのゲノム挿入を指標としたqPCR解析においても、非標的条件ではゲノム損傷を示すシグナルは検出されなかった (Fig. 3d)。ヒトゲノムおよびトランスクリプトームを対象に、Cas-OFFinderを用いて2〜3塩基のミスマッチを持つ潜在的なオフターゲット候補を体系的に探索し、in vitroおよび細胞レベルで検証した。その結果、in vitroにおいて1箇所の候補 (OT1) で極めて微弱な活性化が認められたものの、この転写産物はHeLa細胞内での発現量が1 FPKMと極めて低く、実際の細胞実験において有意な細胞枯渇やゲノム損傷は誘導されなかった (Fig. 3f)。さらに、21 nt of gRNA配列全体にわたって2塩基のミスマッチを導入したミスマッチパネル (g-MM) を用いた検討では、すべてのミスマッチ導入gRNAにおいて細胞枯渇能が完全に消失した (Fig. 3h)。RNA-seqによる全遺伝子発現解析でも、非標的gRNA群はビヒクル群と比較して有意な差次的発現遺伝子を示さず、Cas12a2が極めて高い配列特異性を持ち、オフターゲット活性が最小限に抑えられていることが実証された (Fig. 3i)。
HPV感染細胞の選択的排除とin vivoマウスモデルでの腫瘍抑制: ウイルス感染症治療への応用として、高リスク型ヒトパピローマウイルスであるHPV18のE6およびE7オンコプロテイン転写産物を標的とした。HeLa-GFP細胞 (HPV18陽性) において、E6またはE7を標的とするGeCas12a2 RNPは94% of 細胞を特異的に除去した (n=3 replicates) (Fig. 4c)。一方で、HPV非保有細胞であるHEK293-GFP細胞に対して同一のRNPを導入しても、有意な細胞除去は認められなかった (Fig. 4c)。さらに、治療モデルとしての有用性を検証するため、HPV16陽性のHNSCC患者由来の異種移植片 (HN11303) を用いたマウスフランク腫瘍モデル (n=5 mice) を作製した。このモデルに対し、LNPに封入したGeCas12a2 mRNAおよびHPV16 E6標的gRNAを腫瘍内投与した結果、バッファー対照群と比較して有意な腫瘍増殖抑制効果 (p<0.05) が示された (Fig. 4e)。腫瘍組織の組織学的解析により、Cas12a2の発現と、投与72時間後におけるcaspase-3陽性のアポトーシス細胞の誘導が確認され、in vivoにおける治療モダリティとしての有効性が実証された。
遺伝子編集細胞の効率的な富化: Cas12a2の二次的な応用として、遺伝子編集が成功した細胞を選択的に富化するシステムの構築を試みた。まず、FnCas12aを用いてGFP遺伝子にインデル (挿入・欠失変異) を導入した混合細胞集団 (初期インデル頻度約11%) を作製した (Fig. 4h)。この集団に対し、未編集の野生型GFP転写産物を特異的に標的とするGeCas12a2 RNPを導入してカウンターセレクションを行った結果、生存細胞におけるインデル頻度は3.1-fold (約34%) にまで有意に富化された (n=4 replicates) (Fig. 4h)。さらに、Cas9ベースのプライムエディター (PEmax5/5b) を用いてGAPDH遺伝子に単一または二重塩基置換を導入した実験においても、未編集のGAPDH転写産物をGeCas12a2で標的化することにより、プライム編集が導入された細胞の割合を最大4.3-foldにまで富化することに成功した (Fig. 4i)。この結果は、Cas12a2が様々な遺伝子編集ツールと組み合わせて、選択マーカーを使用することなく編集細胞を効率的に濃縮するための汎用的なツールになり得ることを示している。
肺がん治療標的としてのKRAS G12C変異細胞の特異的排除: がん治療における極めて重要な標的として、肺がん等で高頻度に見られるKRAS G12C変異 (単一塩基置換G-to-T) を持つ細胞の選択的排除を試みた。G12C変異部位に特異的な24-ntのgRNA (g-KRAS(2)) を設計し、in vitroでの検証を行ったところ、野生型KRAS転写産物は一切認識せず、G12C変異転写産物のみを特異的に認識してdsDNA分解活性を誘発することを確認した (Fig. 5b)。この特異性を細胞レベルで検証するため、野生型KRASまたはKRAS G12Cを安定過剰発現させたU2OS細胞株を構築した。g-KRAS(2)を装備したGeCas12a2 RNPの導入により、KRAS G12C過剰発現細胞は62%枯渇したのに対し、野生型KRAS過剰発現細胞では有意な細胞枯渇やゲノム損傷は認められなかった (n=3 replicates) (Fig. 5e,f)。さらに、内在性にヘテロ接合型のKRAS G12C変異を有する肺がん細胞株であるNCI-H23において、50%の細胞除去を達成した (Fig. 5g)。臨床で用いられるFDA承認のKRAS G12C阻害剤であるsotorasib (5 µM) 単剤処理での細胞除去率は65%であったが、GeCas12a2 RNPとの併用により、細胞除去率は85%超にまで相乗的に向上した (Fig. 5i)。また、臨床上の大きな課題であるsotorasib耐性を獲得したNCI-H23耐性株に対しても、GeCas12a2は単剤で51%の細胞除去に成功し、既存の分子標的薬とは異なる作用機序を持つ新規治療アプローチとしての極めて高いポテンシャルが示された (Fig. 5j)。
考察/結論
先行研究との違い: 従来のCRISPR-Cas9やCas12aを用いた細胞排除の試みは、真核細胞が持つ強力なDNA修復機構 (HDRやNHEJ) によってdsDNA切断が効率的に修復されてしまうため、単一の遺伝子座を標的とするだけでは細胞死を誘導できず、高度に反復するゲノム領域を標的とする必要があった。また、RNA標的型であるCas13システムも、真核細胞においては標的転写産物の分解 (ノックダウン) に留まり、頑健な細胞死を誘導するには至らなかった。これらこれまでと異なり、Cas12a2は標的RNAの認識をトリガーとしてトランスでの無差別なdsDNA切断活性を解放するため、細胞自身のDNA修復テンプレートの有無に関わらず、極めて効率的かつ不可逆的に細胞を排除できる点が決定的に異なっている。
新規性: 本研究は、Cas12a2のRNA誘発型無差別dsDNase活性が真核細胞 (酵母およびヒト細胞) において機能し、プログラム可能な細胞排除ツールとして利用可能であることを本研究で初めて示した。また、単一塩基置換レベルの極めて高い配列特異性を持ち、オフターゲット活性を最小限に抑えながら、特定の転写産物 (HPVウイルス遺伝子やKRAS G12C変異転写産物など) を発現する細胞のみを狙い撃ちして排除できるという新規の作用機序を明らかにした。
臨床応用: 本技術は、がん治療や感染症治療における臨床応用に新たな道を拓くものである。特に、肺がんなどの難治性がんにおいて極めて重要な致死性オンコジーンであるKRAS G12C変異細胞を選択的に排除できることは、極めて高い臨床的有用性を持つ。既存の分子標的薬であるsotorasibとの併用による相乗効果や、sotorasib耐性株に対する有効性が示されたことは、臨床における薬剤耐性克服のための強力なツールとなることを示唆している。さらに、LNPを用いた送達モダリティの確立により、in vivoでの治療応用への基盤が形成された。
残された課題: しかしながら、本技術の臨床展開に向けてはいくつかの残された課題やlimitationも存在する。第一に、Cas12a2の活性化にはアデニンに富むPFSが必要であり、標的可能な配列に一定の制約があるため、今後の検討課題として、PFS要件を緩和または改変した高活性・高精度なエンジニアヌクレアーゼの開発が求められる。第二に、標的転写産物の発現量や細胞内局在がCas12a2の活性化効率や細胞排除速度に与える影響について、さらに詳細な解析が必要である。第三に、無差別なDNA切断に伴う周囲の正常細胞への毒性や、生体内での免疫原性の評価など、安全性の検証が不可欠である。今後の研究方向性として、ウイルスベクターや非viral送達システムを用いた組織特異的送達技術との融合が期待される。
方法
本研究では、Sulfuricurvum sp. 由来のSuCas12a2およびメタゲノム由来のGeCas12a2 (アミノ酸相同性89%) の2種類のバリアントを使用した。酵母 (Saccharomyces cerevisiae) モデルでは、ADE2転写産物を標的とするgRNA (guide RNA、ガイドRNA) とGeCas12a2を共発現させ、HDR用のドナーテンプレート存在下および非存在下でのコロニー形成能を評価した。ヒト細胞実験においては、HeLa、HeLa-GFP、HEK293T、HEK293-GFP、U2OS、SiHa、PC3、COR-L23、SCC-4、SK-MEL-30、および肺がん由来細胞株であるNCI-H23などの多様な細胞株を使用した。これらの細胞に対し、大腸菌で発現・精製したCas12a2タンパク質とin vitro転写により調製したgRNAを複合体化させたRNP (ribonucleoprotein、リボ核酸タンパク質) を、エレクトロポレーション (電気穿孔法) により導入した。また、LNP (lipid nanoparticle、脂質ナノ粒子) を用いたmRNAおよびgRNAの共送達も実施した。細胞増殖および枯渇の評価には、Incucyteシステムを用いたコンフルエンス画像解析、およびSRB (sulforhodamine B、スルホローダミンB) 染色法による総タンパク質量の定量を用いた。細胞内のdsDNA切断の定量には、DNA修復因子である53BP1の免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡観察を用いた。細胞周期解析はDAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) 染色を用いたフローサイトメトリーにより行い、アポトーシスの評価にはannexin V (アネキシンV) 染色およびcaspase-3/7 (カスパーゼ3/7) 活性測定アッセイを実施した。トランスクリプトーム解析として、RNA-seq (RNA sequencing、RNAシーケンシング) を行い、DESeq2による差次的発現解析およびGSEA (gene set enrichment analysis、遺伝子セットエンリッチメント解析) を実施した。転写産物量はFPKM (fragments per kilobase of exon per million fragments mapped) 値として算出した。オフターゲット活性の評価には、dsODN (double-stranded oligodeoxynucleotide、二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド) のNHEJ依存的ゲノム挿入を指標とするqPCR (quantitative polymerase chain reaction、定量PCR) 法、およびCas-OFFinderを用いたゲノム・トランスクリプトーム横断的ミスマッチ検索を用いた。in vivo評価として、HPV16陽性のHNSCC (head and neck squamous cell carcinoma、頭頸部扁平上皮がん) 患者由来異種移植片 (HN11303) を移植したNOGマウス (NOG mice) モデルを作製し、LNP封入GeCas12a2 mRNAおよびgRNAを腫瘍内投与した。統計解析には、Welchの補正を伴う二側t検定 (two-tailed unpaired t-test with Welch’s correction) などの統計手法を用いた。