- 著者: Nicole R. Infarinato, Jin H. Park, Kateryna Krytska, Colleen H. Ryles, Jamie L. Robles, Carolyn S. Buongervino, Shashi Bala Singh, Yun L. Liu, Yael P. Mossé
- Corresponding author: Yael P. Mossé (Children’s Hospital of Philadelphia, Department of Pediatrics, Division of Oncology, Philadelphia, PA, USA)
- 雑誌: Cancer Discovery
- 発行年: 2016
- Epub日: 2015-11-10
- Article種別: Original Article
- PMID: 26554404
背景
神経芽腫 (neuroblastoma) は小児固形腫瘍の中で最も致死的なものの1つであり、高リスク患者の長期生存率は約50%にとどまる。
先行研究1: Mossé 2008 (Nature) は ALK が familial neuroblastoma の major predisposition gene であることを発見した。先行研究2: Janoueix-Lerosey 2008 / Chen 2008 / George 2008 (3 Nature papers concurrent publication) は somatic activating ALK kinase mutations (R1275Q、F1174L、F1245C 等) が散発性 neuroblastoma の7-14%に存在することを independent に同定した。先行研究3: Bresler 2014 (Cancer Cell) と Mossé 2013 (Lancet Oncol) は、crizotinib (1st gen ALK inhibitor) が小児 ALK-driven cancers (neuroblastoma + ALCL) で活性を持つことを phase I 試験で示し、Children’s Oncology Group ADVL0912 試験 (NCT00939770) で safety / efficacy を establish した。
ただし、crizotinib 反応性は ALK 変異部位で著しく異なる。R1275Q (αC helix 変異) は比較的 crizotinib-sensitive (cell line IC50 ~10-50 nM) であるが、F1174L (kinase domain hinge 変異) と F1245C (DFG motif 変異) は crizotinib-resistant (primary resistance、IC50 >300 nM) である。先行研究4: Bresler 2014 は F1174L 変異が ATP affinity を高め、crizotinib との competitive binding を不利にする mechanism を実証した。先行研究5: Zou et al. CancerCell 2015 は第3世代 macrocyclic ALK / ROS1 阻害薬 PF-06463922 (後の lorlatinib) が、NSCLC ALK-fusion cell lines + resistance mutations panel に対して優れた activity と CNS penetration を持つことを実証した (NSCLC context)。
既存知見の課題：①小児 neuroblastoma の primary crizotinib-resistant ALK mutations (F1174L、F1245C) を克服する次世代 ALK 阻害薬は未確立、②NSCLC context での PF-06463922 効果が pediatric ALK-driven neuroblastoma にも extend するかは未開拓、③Single-agent で primary resistance を完全に overcome する preclinical evidence は不足、④ALK F1174L / F1245C / R1275Q の独立 isolate での head-to-head crizotinib vs. PF-06463922 comparison が systematic に未確立、であった。これが「何が足りなかったか」の核心であり、本研究は3つの主要 neuroblastoma ALK mutation (F1174L、F1245C、R1275Q) での comprehensive preclinical evaluation を通じて gap in knowledge を埋めることを目指した。
目的
ALK 活性化点変異 (F1174L、F1245C、R1275Q) を持つ神経芽腫モデルにおいて、(1) PF-06463922 (lorlatinib) の enzyme kinase inhibition (Ki) を crizotinib との直接比較で評価する、(2) Ba/F3 cell IC50 を 3 種 ALK mutation で測定する、(3) Cell line + patient-derived xenograft (PDX) models で in vitro / in vivo の抗腫瘍活性を測定する、(4) crizotinib-primary-resistant F1174L / F1245C を含む全 3 variant model で single-agent complete tumor regression が達成可能か を検証することを目的とした。
結果
Biochemical kinase Ki - crizotinib との比較 (recombinant kinase assays、n=3 samples per kinase variant): PF-06463922 は F1174L / F1245C / R1275Q いずれの ALK 変異に対しても Ki <0.2 nM という極めて強力な阻害活性を示した (Fig 1、Table 1)。Crizotinib との比較は次の通りである。WT ALK では PF-06463922 0.07 nM vs. crizotinib 0.7 nM (10倍 superior)、F1174L では <0.2 nM vs. 6 nM (30倍)、F1245C では <0.2 nM vs. 10 nM (50倍)、R1275Q では <0.2 nM vs. 2 nM (10倍) であった。これは PF-06463922 が F1174L / F1245C という primary crizotinib-resistant mutations を biochemically overcome する直接的証拠である。
Ba/F3 cell line IC50 比較: Ba/F3 IL-3-independent transformation を ALK mutations が drive する system で、PF-06463922 vs. crizotinib の IC50 を head-to-head 比較した (Fig 2、Table 2)。結果は以下の通りであった。WT ALK では PF-06463922 IC50 = 6 nM vs. crizotinib 80 nM (13倍 superior)、F1174L では 10 nM vs. >300 nM (30倍以上)、F1245C では 30 nM vs. >300 nM (10倍以上)、R1275Q では 30 nM vs. 50 nM (両者とも比較的感受性)。これは F1174L / F1245C primary resistance を PF-06463922 が overcome することの cell-based confirmation である。
Neuroblastoma cell line growth inhibition (SH-SY5Y、NB-1643、NLF、LAN-5): 4種の神経芽腫細胞株での IC50 は次の通りであった。SH-SY5Y (F1174L、MYCN-amp) で PF-06463922 IC50 = 50 nM vs. crizotinib IC50 = 800 nM (16倍 superior、AUC 比0.06)、NLF (F1174L homozygous) で80 nM vs. >1,000 nM、LAN-5 (F1174L) で70 nM vs. >1,000 nM、NB-1643 (R1275Q) で40 nM vs. 100 nM であった (Fig 3)。Trypan blue exclusion で apoptosis induction も確認された (>50% cell death at 100 nM PF-06463922)。
SH-SY5Y (F1174L) xenograft で PF-06463922 完全退縮: SH-SY5Y subcutaneous xenograft mice (n=10 mice per arm、計30 mice) に crizotinib 50 mg/kg BID vs. PF-06463922 5 mg/kg BID vs. vehicle を投与した (Fig 4)。Crizotinib 50 mg/kg BID は腫瘍増殖を抑制できず progressive disease (PD) に至り、F1174L が真の primary resistance であることが in vivo で確認された (tumor growth HR 1.8 vs. vehicle)。一方、PF-06463922 5 mg/kg BID は投与7日以内に tumor volume を200 mm³ から ≤20 mm³ まで急速に減少させ、投与14日で全10 mice (100%) で complete regression (CR) を達成した。30日 follow-up 中も tumor 再発は認めなかった (regression vs. vehicle HR 0.05、p<0.001)。これは crizotinib の1/10の用量で100% CR を達成する dramatic な activity 差である。Body weight stability から tolerability も確認された。
Felix-PDX (F1245C) で完全退縮: Felix-PDX は patient-derived F1245C variant neuroblastoma xenograft である。Crizotinib 50 mg/kg BID は実質的に無効 (PD) であったが、PF-06463922 5 mg/kg BID は単剤で全例 (n=8) complete tumor regression を達成した (Fig 5)。これは患者由来 F1245C model における single-agent PF-06463922 efficacy の first preclinical evidence である。F1245C は DFG motif (kinase の activation loop 起点の3残基モチーフ) の structural rigidity を変化させて crizotinib との competitive binding を不可能にするが、PF-06463922 の macrocyclic scaffold が kinase pocket への conformational accommodation により inhibition を維持する、と考察される。
NB-1643 (R1275Q) で完全退縮: R1275Q は比較的 crizotinib-sensitive とされる variant である。Crizotinib 50 mg/kg BID は一定の tumor growth inhibition を示したが、CR には到達せず progressive growth した (Fig 6、n=8 mice per arm)。一方、PF-06463922 5 mg/kg BID は単剤で全例 complete regression を達成し、30日 follow-up 中も recurrence は認められなかった (survival HR 0.10、p<0.001 log-rank)。これは、3種すべての ALK variant model (crizotinib-sensitive な R1275Q と crizotinib-resistant な F1174L / F1245C) で PF-06463922 が complete regression を達成する historically important な finding である。
下流シグナル阻害 (mechanistic confirmation): Western blotting (Fig 7) で、PF-06463922 30 nM 投与により SH-SY5Y / NLF / Felix-PDX 細胞の ALK phosphorylation (Y1604) が完全に阻害された。これと並行して、STAT3 (Y705)、AKT (S473)、ERK1/2 (T202/Y204) の phosphorylation も dose-dependent に減少した。これは PF-06463922 が ALK kinase signaling axis を robust に block することを mechanistically 実証する。Crizotinib 同量 (30 nM) では F1174L / F1245C cells で signaling block が incomplete であり、これは on-target activity 差を反映する。
Therapeutic Index (in vivo tolerability): PF-06463922 5 mg/kg BID 30日 treatment 中、body weight stability は維持され (≥95% baseline)、overt toxicity (motor / behavioral abnormalities) は認めなかった。Histopathology でも off-target organ toxicity はなく、pediatric dose-intensified protocol への extrapolation feasibility を支持する。
考察/結論
本研究は、PF-06463922 (lorlatinib) が小児神経芽腫の primary crizotinib-resistant ALK 変異 (F1174L、F1245C) を含む全主要 ALK activation mutations に対して、preclinical models で single-agent complete tumor regression を達成することを世界で初めて系統的に実証した historically important paper である。
先行研究との違い：Bresler 2014 (Cancer Cell、F1174L crizotinib resistance mechanism) は耐性 mechanism を解明したものの、これを overcome する agent は示さなかった。本研究は F1174L / F1245C を overcome する具体的 therapeutic agent を初めて示した点で異なる。Mossé 2013 (Lancet Oncol、crizotinib pediatric phase I) と比較すると、本研究は次世代 ALK 阻害薬 lorlatinib による primary resistance overcoming という新たな pharmacological paradigm を提示した。Zou et al. CancerCell 2015 が NSCLC context で lorlatinib を評価したのに対し、本研究は pediatric neuroblastoma という独立した tumor type で同 compound の効果を direct に拡張し、ALK pathway-driven cancers across tumor types での lorlatinib applicability を新規に示した。
新規性：本研究の novel な貢献は次の6点である。①F1174L / F1245C neuroblastoma primary crizotinib-resistant ALK mutations に対する Ki <0.2 nM (crizotinib の30-50倍 superior) を初めて実証した。②SH-SY5Y / NB-1643 / Felix-PDX の3 種異種移植モデル全てで、5 mg/kg BID 投与による complete tumor regression という前例のない therapeutic differentiation を新規に示した。③Felix-PDX という patient-derived F1245C neuroblastoma model での single-agent PF-06463922 efficacy をこれまでにない evidence として確立した。④Crizotinib-sensitive R1275Q variant でも CR を達成し、3種変異全てで均一に優れた activity を示す variant-agnostic ALK inhibitor として characterize された。⑤STAT3 / AKT / ERK downstream signaling の完全阻害を mechanistically 実証し、on-target activity を verify した。⑥Crizotinib 50 mg/kg BID と比較して1/10の用量で100% CR を達成する unprecedented dose efficiency を示した。
臨床応用：①小児神経芽腫への lorlatinib 臨床試験 (NCT03107988 NANT 2017-01、Children’s Oncology Group ANBL1531 等) の科学的基盤を直接提供し、pediatric phase I/II protocol の rationale を構成した。②ALK 変異依存性 neuroblastoma の precision medicine として、variant-agnostic single-agent therapy 戦略を確立した。③Anti-GD2 antibody + isotretinoin + IL-2 という standard high-risk neuroblastoma 治療への lorlatinib 統合の rationale を提供した。④CNS penetration (Zou 2015 で Kp,uu 21-31%) は neuroblastoma 脳・髄液転移にも extend する可能性があり、後続の COG ANBL1531 試験で confirm された。⑤F1174L は高リスク non-MYCN-amplified neuroblastoma の subset で見られ、これらの patient subgroup での precision targeting に直接 application 可能である。⑥Adult ALK-driven cancers (NSCLC、ALCL、IMT (inflammatory myofibroblastic tumor)) での lorlatinib applicability を tumor-agnostic に extend する rationale を提供した。
残された課題と今後の方向性：以下7点が limitation として残る。①Pediatric pharmacokinetic profile は adult と異なる可能性があり、optimal dose determination が phase I trials の core である。②F1174L homozygous (NLF) や MYCN co-amplification が high-risk subgroup で response durability に影響するか、長期 follow-up が必要。③Neuroblastoma における lorlatinib acquired resistance mechanisms (NSCLC で報告された compound mutations が neuroblastoma でも emerge するか) は未開拓 (Yoda et al. CancerDiscov 2018)。④Single-agent vs. combination strategy (lorlatinib + chemotherapy / anti-GD2 / MYCN inhibitor / aurora kinase A inhibitor alisertib) の比較が今後の方向性。⑤Pediatric brain tumors (ALK alterations を持つ DIPG、CNS lymphoma) への extension が次の検討事項。⑥Pediatric population における long-term neurodevelopmental safety の monitoring が必須。⑦ROS1-altered pediatric cancers (rare IMT、glioma) での同 compound の効果が今後の研究として有望である。本研究は後続の pediatric ALK-driven cancer field の foundational reference として100+の citation を獲得し、tumor-agnostic precision oncology における macrocyclic lorlatinib の broad applicability を確立した。
方法
本研究は ALK-driven pediatric neuroblastoma に対する PF-06463922 (lorlatinib) preclinical pharmacology study である (Cell lines basic ID: SH-SY5Y (neuroblastoma cell line with F1174L ALK mutation, MYCN amplification)、NB-1643 (R1275Q ALK mutation, MYCN amplification)、NLF (F1174L homozygous, MYCN amplification)、LAN-5 (F1174L)、Felix-PDX (patient-derived xenograft with F1245C ALK mutation, MYCN amplification, established by Children’s Hospital of Philadelphia, established from a high-risk neuroblastoma patient)、Ba/F3 cells with various ALK mutation knock-in for orthogonal validation、Mouse strain ID: athymic Nu/J nude mice or Crl:CD1-Foxn1nu nude mice for xenograft establishment、Children’s Hospital of Philadelphia Institutional Animal Care and Use Committee 承認下)。Compounds: PF-06463922 (lorlatinib、Pfizer Oncology provided)、crizotinib (Pfizer / Selleck Chemicals)。Biochemical kinase Ki determination: Recombinant ALK kinase domain with each mutation (WT, F1174L, F1245C, R1275Q) を P81 paper filter binding assay または LANCE Ultra TR-FRET assay で γ-³²P-ATP-based phosphorylation を測定、4-parameter logistic regression で Ki 算出。Ba/F3 cell viability assays: ALK mutation expressing Ba/F3 cells (parental + IL-3 independent variants) で 72h compound exposure 後 ATP-based viability (CellTiter-Glo)、IC50 計算。Neuroblastoma cell line viability: SH-SY5Y、NB-1643、NLF、LAN-5 を 72h treatment、CellTiter-Glo + Trypan blue exclusion で % growth inhibition。Western blotting: ALK Y1604 phosphorylation、STAT3 Y705 phosphorylation、AKT S473 phosphorylation、ERK1/2 T202/Y204 phosphorylation を各 cell line で dose-response 解析 (PF-06463922 0.01-1000 nM)。In vivo xenograft efficacy studies: subcutaneous implantation of cell lines (SH-SY5Y、NB-1643) or PDX fragment (Felix-PDX) into flank of immunodeficient nude mice、tumor volume monitoring twice weekly、treatment initiation at tumor volume ~200-400 mm³、PF-06463922 5 mg/kg PO BID (mg/kg twice daily) vs crizotinib 50 mg/kg PO BID (10倍 higher dose) vs vehicle control、treatment duration up to 30 days、tumor regression scoring (CR: complete regression、PR: partial regression、SD: stable disease、PD: progressive disease)。Survival analysis: Kaplan-Meier with log-rank test、euthanasia criteria に到達した時点を death event とした。Body weight monitoring: tolerability assessment、>15% body weight loss は euthanasia trigger。Statistics: 4-parameter logistic regression for IC50/Ki、ANOVA + Tukey post-hoc test for tumor volume comparison、log-rank for survival、Mann-Whitney U for non-parametric。Replicates: each in vitro assay biological n ≥ 3、in vivo n=8-12 mice per arm。