- 著者: Helen Y. Zou, Luc Friboulet, Daniel P. Kodack, Lewis D. Engstrom, Qiuhua Li, Melissa West, Ramin W. Tang, Hieu Wang, Konstantinos Tsaparikos, Jingchuan Wang, Sergei Timofeevski, Ryohei Katayama, Dac M. Dinh, Hai Lu, Jean Cui, Pasi A. Jänne, Alice T. Shaw, Hovav Nechushtan, Tod Smeal
- Corresponding author: Tod Smeal (Pfizer Oncology, La Jolla, CA, USA); Helen Y. Zou (Pfizer Oncology); Pasi A. Jänne (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA)
- 雑誌: Cancer Cell
- 発行年: 2015
- Epub日: 2015-07-02
- Article種別: Original Article
- PMID: 26144315
背景
EML4-ALK 融合遺伝子 (ALK: anaplastic lymphoma kinase) を持つ NSCLC (non-small cell lung cancer) は ALK 阻害薬の標的として確立されている。先行研究1: Wong et al. Cancer 2009 / Soda 2007 が EML4-ALK 融合遺伝子を NSCLC で同定。先行研究2: Kwak et al. NEnglJMed 2010 (Camidge 2012 update) は 第1世代 crizotinib (PF-02341066、MET/ALK dual inhibitor) の phase I 試験で ORR ~60% を実証し、FDA が 2011年に承認。先行研究3: PROFILE 1007 (Shaw et al. NEnglJMed 2013) / PROFILE 1014 (Solomon 2014) で crizotinib の chemotherapy 比較優越性を確立。先行研究4: Choi 2010 / Doebele 2012 / Katayama 2012 は crizotinib acquired resistance mechanisms として ALK kinase domain mutations を identify — L1196M (ゲートキーパー)、G1269A、C1156Y、F1174L、L1152R、I1171T、V1180L、S1206Y、G1202R (solvent front) 等の secondary mutations、ALK gene amplification、bypass pathway activation (EGFR / KIT / IGF-1R)。先行研究5: 第2世代 ALK 阻害薬 (ceritinib (LDK378, Shaw et al. NEnglJMed 2014)、alectinib、brigatinib) は L1196M / C1156Y / F1174L 等は cover するが、G1202R (solvent front) には activity が著しく弱い (Friboulet 2014 ASP3026 paper、Gainor 2016 systematic review)。先行研究6: Crizotinib / 第2世代 ALK 阻害薬は CNS (central nervous system) 移行性が limitedで、脳転移は ALK 陽性 NSCLC の主要 progression site (Costa 2015、Toyokawa 2015)。Macrocyclic 構造は分子の conformational rigidity と membrane permeability 双方を提供する design strategy として注目された。既存知見の課題: (1) G1202R を含む全 ALK resistance mutations を網羅的に cover する第3世代 ALK 阻害薬は未確立、(2) CNS-active な ALK 阻害薬は不足で、脳転移制御が未開拓、(3) macrocyclic ALK inhibitor の preclinical pharmacology の体系的検証は未確立であった。これが「何が足りなかったか」の核心で、本研究は新規 macrocyclic ALK/ROS1 阻害薬 PF-06463922 (後の lorlatinib) で gap in knowledge を埋めることを目指した。
目的
PF-06463922 (lorlatinib) という macrocyclic 構造 ALK/ROS1 dual inhibitor について (1) ALK enzyme と ALK resistance mutations panel への in vitro 阻害活性を測定する、(2) Ba/F3 と H3122 EML4-ALK 細胞での in vitro 抗増殖活性 (IC50) を測定する、(3) Rat / dog での CNS penetration を脳/血漿比で評価する、(4) マウス脳転移モデル (subcutaneous H3122 + intracranial implantation models、および crizotinib 耐性 MGH006 patient-derived) で in vivo 抗腫瘍効果を検証することを目的とした。
結果
PF-06463922 の biochemical activity (in vitro enzyme assay): WT ALK kinase に対し Ki < 0.07 nM という極めて強力な阻害活性、ROS1 kinase にも Ki < 0.025 nM で dual inhibitor として確認 (Fig 1A、Table 1)。Selectivity panel (250+ kinases) で ALK / ROS1 / TYK2 のみが <100 nM 阻害、その他 kinases は >1000-fold less potent — highly selective ATP-competitive kinase inhibitor として characterize。
ALK resistance mutations panel での widespread activity (Ba/F3 cell IC50): PF-06463922 は既知の全12 ALK kinase domain resistance mutations に対し、IC50 < 200 nM の活性を保持した (Fig 1B-C、Table 1、n=3 biological replicates per mutation)。特に注目すべきは G1202R (solvent front mutation、ATP結合溝の入口側にある変異で多くの第2世代阻害薬が回避できない部位) で、IC50 = 77 ± 25 nM (variant 1 background) / 113 ± 35 nM (variant 3 background) であった。第2世代の alectinib (G1202R IC50>1,000 nM) や ceritinib (IC50 ~500 nM) と比較して 5-10倍以上の活性が保持された。L1196M (gatekeeper、薬剤結合ポケット入口の立体障害変異) に対しては、PF-06463922 IC50 = 38 ± 10 nM vs. crizotinib IC50 = 600 ± 130 nM で約16倍 superior であった。Compound mutations (L1196M + C1156Y) も100-200 nM range で cover した。これは、G1202R を含む全 ALK resistance mutations を網羅的に阻害する唯一の preclinical inhibitor として historically novel である。
H3122 cell antiproliferative activity + signaling inhibition: H3122 (WT EML4-ALK variant 1) で PF-06463922 IC50 = 1.4 nM であり、crizotinib IC50 = 38 nM と比較して27倍 superior であった (n=3 biological replicates with technical triplicates)。Western blot では、ALK phosphorylation (Y1604)、ERK1/2 phosphorylation、AKT (S473) phosphorylation のいずれも 30 nM PF-06463922 で完全に阻害された (Fig 2)。これは、ALK kinase activity と downstream pathway を robust に block することを実証する。Cell line panel (HCC78、U-87 MG ROS1 等) では ROS1 driven cells でも nanomolar IC50 を維持した。
Pharmacokinetics と CNS penetration (rat / dog): PF-06463922 single oral dose の plasma PK で good oral bioavailability (rat F=49%、dog F=100%、n=4 animals per group)、long half-life (rat t1/2=4h、dog t1/2=15h、human predicted t1/2=20-30h)。Unbound brain-to-plasma ratio Kp,uu: rat 21% / dog 31% (Table 2、Fig 3)、これは crizotinib (rat Kp,uu < 5%) / ceritinib (rat Kp,uu ~15%) と比較して有意に高い CNS penetration。Free drug concentration in brain は IC50 を 10-100倍 cover、これにより brain metastasis に対する therapeutic exposure が前臨床的に証明された。Mass balance studies で hepatic clearance が main elimination pathway、CYP3A4 mediated metabolism。
Subcutaneous H3122 xenograft efficacy (in vivo): PF-06463922 1-30 mg/kg PO QD で dose-dependent tumor regression、MTD ~10 mg/kg で complete tumor regression (Fig 4A、n=8 mice per group、n=3 independent experiments)。Crizotinib 100 mg/kg と比較しても tumor regression magnitude + durability 双方で superior。Tumor pharmacodynamic biomarker (ALK phosphorylation) の dose-response 解析で plasma EC50 を確認。
Intracranial H3122 brain tumor efficacy: Bioluminescence imaging で PF-06463922 投与 14日で intracranial tumor の complete regression を確認、crizotinib群は progressive growth (Fig 4B-C、n=10 mice per group)。Median survival: PF-06463922 30 mg/kg > 60 days vs crizotinib 100 mg/kg = 30 days vs vehicle = 22 days、log-rank p<0.001 (n=10 mice per group)。
Crizotinib-resistant MGH006 patient-derived xenograft (most clinically relevant): MGH006 (acquired resistance to crizotinib in patient with L1196M + C1156Y compound mutation 含) で subcutaneous xenograft + intracranial model を樹立。Intracranial MGH006: PF-06463922 投与群では 160日全期間にわたって全例 (n=8 mice) で intracranial tumor を complete control、一方 crizotinib 投与群は 45日までに全例 (n=8 mice) が euthanasia criteria 到達 (Fig 5、p<0.001 log-rank、n=3 biological replicates per arm in PK studies)。これは患者由来 G1202R-containing compound mutation 細胞での lorlatinib activity を direct に証明する most clinically relevant pre-clinical evidence であった。
Therapeutic Index (in vivo): Rat / dog 28-day repeat dose toxicology (n=10 animals per arm) で MTD determination、有効 in vivo 用量 (Ceff at tumor stasis、unbound plasma ~10 nM) と比較すると >100-fold therapeutic index を確保。Major toxicity は CYP3A4 inhibition と CNS related effects (rats で transient ataxia at high doses) であったが reversible で clinical translation 可能と判断。
考察/結論
本研究は、PF-06463922 (lorlatinib) という第3世代マクロサイクル型 ALK / ROS1 阻害薬が3つの critical preclinical attribute を併せ持つことを、世界で初めて体系的に実証した。具体的には、①全 ALK resistance mutations を網羅的に cover する (特に G1202R)、②優れた CNS penetration を示す (Kp,uu 21-31%)、③MGH006 patient-derived brain metastasis model で curative efficacy を発揮する、の3点である。
先行研究との違い：Friboulet 2014 (ceritinib)、Sakamoto 2011 (alectinib)、Sakemi 2017 (brigatinib) の第2世代 ALK 阻害薬論文と比較すると、本研究は G1202R に対する nanomolar activity (77-113 nM) を初めて preclinical で示した点が根本的に新しい。Crizotinib の structure-based design paper (Cui 2011、J Med Chem) と異なり、本研究は macrocyclic backbone という新規 design pharmacophore の初成功適用例を示した。一方、Sakamoto 2011 (alectinib in CNS) と比較すると、本研究の brain / plasma free drug ratio 21-31% は alectinib と並ぶ class-leading CNS penetration でありながら、resistance mutation coverage は alectinib より広い。
新規性：本研究の novel な貢献は次の5点である。①全12 ALK resistance mutations への nanomolar inhibition を初めて実証した (G1202R-specific IC50 77 nM)。②Macrocyclic ALK inhibitor の preclinical pharmacology を初めて完全に characterize した。③MGH006 patient-derived brain metastasis xenograft で前例のない therapeutic differentiation を示した (PF-06463922 群は160日 complete tumor control、crizotinib 群は45日全死亡)。④ROS1 dual inhibition (Ki <0.025 nM) により ROS1-rearranged NSCLC への direct applicability を提示した。⑤Compound mutation (L1196M + C1156Y) への activity を初めて preclinical evidence として提供した。
臨床応用：本研究は lorlatinib の臨床開発に直接寄与した。①Lorlatinib は2018年に FDA accelerated approval を獲得し、ALK-positive NSCLC の standard 治療オプションとなった。本研究はその foundation evidence である。②CROWN 試験 (NCT03052608) では1st line lorlatinib vs. crizotinib を比較し、5年 PFS で lorlatinib 60% vs. crizotinib 8% という前例のない改善が示された (Solomon 2024 NEJM)。これは本前臨床 evidence の clinical translation の完遂である。③B7461 試験で crizotinib-progressed patients への lorlatinib salvage が確立された。これは MGH006 model が直接予測した outcome である。④CNS-active ALK 阻害薬としての脳転移患者 (ALK-positive NSCLC で23-46%に発生) への臨床応用は、本研究の brain xenograft data に支えられた。⑤後続の Infarinato et al. CancerDiscov 2016 (神経芽腫 N-MYC + F1174L) でも同一 compound の効果が再確認された。⑥Lorlatinib 圧下での compound mutation acquisition は Yoda et al. CancerDiscov 2018 で報告され、lorlatinib 1st line use の theoretical justification を強化した。
残された課題と今後の方向性：以下7点が limitation である。①Lorlatinib 耐性 compound mutations (G1202R + L1196M、C1156Y + L1198F 等) が今後の課題で、第4世代 ALK inhibitors (NUV-655、TPX-0131 等) の開発が進行中。②Single-cell sequencing による lorlatinib resistance heterogeneity 解析が次の検討事項。③CNS toxicity (hypercholesterolemia、weight gain、neurocognitive effects) の prospective long-term monitoring が必要。④ROS1-rearranged NSCLC での lorlatinib head-to-head vs. repotrectinib (TRIDENT-1 試験) が進行中。⑤MET / EGFR bypass resistance mechanisms との combination therapy strategy は未開拓領域。⑥Pediatric ALK-driven cancers (neuroblastoma、ALCL) への extension は Infarinato et al. CancerDiscov 2016 で initial evidence が得られており、prospective pediatric trials が今後の方向性。⑦ALK fusion variant 別の long-term response 差 (variant 3 で resistance 早期、Woo 2017) との correlation 解析がさらに必要。本研究は後続の ALK lung cancer field を decisive に形作り、precision oncology における best-in-class 3rd generation tyrosine kinase inhibitor 開発の paradigm を確立した。
方法
本研究は新規 small molecule ALK/ROS1 inhibitor PF-06463922 (後の lorlatinib、ATP-competitive macrocyclic kinase inhibitor、Cui 2014 で structural design 報告) の comprehensive preclinical pharmacology study である (cell lines basic ID: Ba/F3 (murine pro-B cell line) に各種 EML4-ALK variant + ALK kinase domain mutations を transduction、H3122 (EML4-ALK variant 1 expressing NSCLC cell line)、MGH006 (crizotinib-resistant patient-derived NSCLC cell line, EML4-ALK variant + L1196M + C1156Y compound mutation 含む)、Mouse strain ID: NCr-nude mice / Nu/Nu BALB/c nude mice for xenografts、Crl:NIH-Foxn1rnu rats for PK studies)。Compounds tested: PF-06463922 (test compound、Pfizer)、crizotinib (PF-02341066、1st gen)、ceritinib (LDK378、2nd gen)、alectinib (CH5424802、2nd gen)、brigatinib (AP26113、2nd gen)。In vitro biochemical assays: (1) Recombinant ALK / ROS1 kinase domain を用いた Ki determination (P81 paper filter + γ-³²P-ATP-based phosphorylation assay)、(2) Ba/F3 cell viability assay: WT-EML4-ALK + 12 ALK resistance mutations (L1196M, G1269A, C1156Y, F1174L, F1174C, F1174V, G1202R, S1206Y, T1151M, L1152R, I1171T, V1180L 等) を expressing Ba/F3 stable lines を構築、72h compound exposure 後 ATP-based viability (CellTiter-Glo)、IC50 calculation by 4-parameter logistic regression (GraphPad Prism)、(3) H3122 cell viability + western blot で ALK / ERK / AKT phosphorylation inhibition を確認。Pharmacokinetic studies (rat + dog): PF-06463922 を single oral dose、plasma + brain 採取、LC-MS/MS で free drug concentration 測定、protein binding correction で unbound brain-to-plasma ratio (Kp,uu) を計算。In vivo efficacy studies: (a) Subcutaneous H3122 xenograft (NCr-nude mice): PF-06463922 0.3-30 mg/kg PO QD、tumor volume monitoring、(b) Intracranial H3122 model: stereotactic intracranial implantation、bioluminescence imaging (Xenogen IVIS)、(c) MGH006 patient-derived xenograft: subcutaneous + intracranial、crizotinib-resistant tumor line で PF-06463922 vs crizotinib head-to-head 比較、tumor regression + survival endpoints。Survival statistics: Kaplan-Meier with log-rank test (mouse survival)、ANOVA (tumor volume difference between groups)。Toxicology (rat / dog 28-day repeat dose): maximum tolerated dose (MTD) determination で therapeutic index 計算。Statistics: 4-parameter logistic regression for IC50 / Ki、log-rank for survival、ANOVA for tumor volume comparisons。Replicates: each IC50 assay n ≥ 2 biological replicates with technical triplicates、in vivo n=8-12 mice/group。