- 著者: Tiffany M. Yu, Carl Morrison, Edward J. Gold, Alison Tradonsky, Andrew J. Layton
- Corresponding author: Tiffany M. Yu (Navigant Consulting Inc, San Francisco, CA, USA)
- 雑誌: Clinical Lung Cancer
- 発行年: 2019
- Epub日: 2018-08-23
- Article種別: Original Article (Retrospective real-world analysis)
- PMID: 30243889
背景
進行 NSCLC (advanced non-small cell lung cancer; aNSCLC) の first-line 治療決定には EGFR・ALK・ROS1・BRAF・KRAS・ERBB2・MET・RET・FGFR1 等の複数 driver gene の同時 biomarker testing が NCCN 臨床ガイドラインで推奨されている (Rosell et al. LancetOncol 2012 EURTAC; Solomon et al. NEnglJMed 2014 PROFILE 1014)。しかし NSCLC は診断時に >60% が regional/metastatic stage で、組織採取が CNB (core needle biopsy) や FNA (fine needle aspiration) 等の small sample に限られることが多く、University of Pittsburgh 報告 (n=2014) では CNB の 67% / FNA の 46% のみが EGFR・ALK・KRAS 3 種の sequential single-gene test を successfully completion できたという tissue stewardship 課題が報告されていた。一方で multi-gene NGS panel (Oncomine Dx Target Test、Ion Torrent platform、Thermo Fisher Scientific) は 1 検査で 23 遺伝子を同時 sequencing 可能で、FDA は 2017 年 6 月に NSCLC の companion diagnostic として承認 (BRAF・EGFR・ROS1 の clinical concordance 100%・99%・96.5%)。NCI-MATCH trial (NCT02465060) では NGS の completion rate 85-94% を interim 報告。しかし先行研究には (i) US commercial reference laboratory での real-world single-gene testing の tissue consumption + success rate の系統的定量、(ii) Oncomine Dx Target Test の investigational use (1 slide 限定) と single-gene testing の sample-level head-to-head 比較、(iii) Sample type (CNB/FNA/surgical resection) と tumor content stratification での success rate 評価、というギャップが残されていた。何が足りなかったかというと、米国の routine clinical practice における biomarker testing の組織枯渇 (tissue depletion) 問題を 1,000 例規模で定量化し NGS への移行根拠を示すデータが未解明で、CD274/PD-L1 testing が本格化する前の 2015-2016 年 baseline を捕捉する系統的な real-world evidence が不足していた。
目的
US-based commercial reference laboratory での 2015 年 9 月〜2016 年 10 月の clinical molecular testing データを用いて (1) physician-ordered single-gene test 3,659 件 / 1,402 sample の tissue consumption (number of slides cut per test) と success rate (reportable mutation status の割合) を test type 別 + sample type 別 + per-sample test count 別に定量、(2) Oncomine Dx Target Test の investigational use 169 件 (archival FFPE sample に対して 1 slide のみ使用) で sample type (CNB/FNA/surgical resection) 別 success rate を測定、(3) Single-gene testing と Oncomine Dx の sample-level success rate を比較して multi-gene NGS panel の tissue stewardship 上の advantage を定量する。
結果
1,402 sample 70.5% が CNB、Tumor content 中央値 ~47%、最頻 single-gene test order は EGFR therascreen (95.1%)・ALK Vysis (75.4%)・ROS1 LDT (47.3%)： 1,402 clinical sample (1,368 patients、3,659 single-gene tests) の breakdown (Table 1): CNB 988 (70.5%, うち <25% tumor content 14.9% / ≥25% 48.9% / unknown 6.7%)・FNA 140 (10.0%)・surgical resection 167 (11.9%)・cell block 107 (7.6%)。Tumor content 範囲 1-100%、CNB の 21.2% が <25% tumor content。最頻 single-gene test: EGFR therascreen 1,333 (95.1%)・ALK Vysis 1,057 (75.4%)・ROS1 LDT 663 (47.3%)・KRAS LDT 209 (14.9%)・MET LDT 129 (9.2%)・RET LDT 125 (8.9%)・BRAF cobas 79 (5.6%)・FGFR1 LDT 38 (2.7%)・BRAF LDT 21 (1.5%)・ERBB2 LDT 5 (0.4%)。Investigational Oncomine Dx 169 archival sample (CNB 40.8% / surgical resection 51.5% / FNA 7.7%、tumor content mean 35.9%, range 1-90%)。≥3 biomarker order された clinical sample の大部分が EGFR/ALK/ROS1 を含み、≥4 biomarker では MET/RET/KRAS/BRAF が頻出。
Tissue consumption は test type で 1.0-7.1 slides/test、≥8 single-gene test で 17.0 slides を要し sample 内で増加する： Tissue consumption 解析 (3,314 test on 1,258 sample、Fig 3A) で BRAF LDT が 7.1 slides/test と最大 (n=20)、KRAS LDT 6.8 slides/test (n=180)、EGFR therascreen 2.7 slides/test (n=1,107)、MET LDT 2.0 (n=117)・RET LDT 1.6 (n=112)・ROS1 LDT 1.3 (n=614)・FGFR1 LDT 1.3 (n=32)・ALK Vysis 1.1 (n=979)・BRAF cobas 1.0 (n=67)・ERBB2 LDT 1.0 (n=2)。Sample あたり test 数別の slide 消費は 1 test で 2.4 slides → 4 tests で 8.7 slides → 8 tests で 17.0 slides と線形増加 (Fig 3A、histotechnologist 標準操作手順の uniformity 由来)。BRAF LDT (7.1 slides) は study 期間中に FDA 承認の BRAF cobas (1.0 slide) に置換され consumption を 7 倍削減した実例も観察された。Sample type 別では CNB/FNA/surgical resection 間で同等の slide consumption pattern を示し、tissue thickness は protocol uniformity に従い tumor content とは独立。
Sample 内 ≥1 test success rate 88.4% → ≥7 test で 14.8% に著しく低下し sequential complete failure を示す： ≥1 single-gene test successful completion rate は 88.4%、≥4 test では 76.6% (Fig 3B)。≥2 test 完了率は ≥1 より有意に低く (p<0.05)、≥3 vs ≥2 比較で p<0.0001、≥4 vs ≥3 は trend、≥5 vs ≥4 で marginal significance (p=0.052)、≥7 test で 14.8%・≥8 test で 5.4% に低下した。Test 完了率は test type 別では RET LDT 62.4% (最低)・ALK Vysis 89.1% (最高、Fig 2A)、sample type 別では surgical resection > CNB > FNA で一貫した hierarchy (Fig 2B、RET LDT は surgical < CNB の exception)。これらは sample tissue depletion による「すべての推奨 biomarker を検査できない」という実臨床の構造的制約を 1,000 例超で初めて定量化した。
Oncomine Dx Target Test は 1 slide で surgical resection 98.9%・CNB 75.4%・FNA 69.2% の completion rate を達成し ≥4-5 single-gene test 相当を 1 slide で実現する： Investigational Oncomine Dx Target Test (23-gene NGS panel、1 slide のみ使用、Fig 4B) の success rate は surgical resection 98.9% (n=87)・CNB 75.4% (n=69)・FNA 69.2% (n=13)。これら success rate は clinical single-gene testing で sample type matched に評価された：FNA で 3 vs 4 biomarker success rate (75.0% vs 40.0%)、CNB で 4 vs 5 biomarker (77.9% vs 70.8%)、surgical resection で 1 vs 2 biomarker (100.0% vs 98.5%) の “between” zone に位置し、Oncomine Dx 1 slide が ≥4-5 single-gene tests に相当する information を提供できることを示した。CNB tumor content subgroup 解析 (Fig 5) では Oncomine Dx success rate が <25% tumor で 70.7%・≥25% で 82.1% で、tumor content stratification でも consistent な advantage を示した。これらは bench-to-bedside で multi-gene panel への移行が tissue stewardship 観点で合理的であることを直接的に裏付ける quantitative evidence である。
Tumor content と sample type が completion rate の主要 driver で、unknown tumor content sample で success rate が非常に低い： CNB sample (Fig 5B) で tumor content ≥25% (n=685) の success rate が <25% (n=209) より一貫して高く、≥4 single-gene test 達成率で 81.5% vs 65.5% 等の差を観察。Tumor content data が unreported な CNB 94 sample (9.5%) では success rate が非常に低く、tumor content evaluation の standardized reporting が tissue stewardship optimization に重要であることを示した。Sample type 別 hierarchy (surgical resection > CNB > FNA) は cellularity と nucleic acid yield の差を反映、FNA 検体は cytology 標本由来の低 cell count + RNA quality 問題で multi-gene NGS でも限界があるが、cell block cytology 処理や RNA extraction 条件の最適化で改善余地が残されている。
考察/結論
本研究は US commercial reference laboratory での 1,402 clinical sample / 3,659 single-gene test の retrospective real-world data から、進行 NSCLC の biomarker testing で「single-gene sequential testing aproach が tissue depletion により全 biomarker completion を阻害する」という実臨床課題を定量化し、Oncomine Dx Target Test (23-gene NGS panel、1 slide 限定) が同等以上の information を small tissue から提供できることを示した。(1) 既存研究との違い：先行研究の University of Pittsburgh 報告 (n=2014、CT-guided CNB 67% / FNA 46% completion rate for EGFR+ALK+KRAS 3-gene panel) や NCI-MATCH (interim NGS completion rate 85-94%) はそれぞれ単一 academic center または research trial protocol 下での data であった。これに対して本研究は対照的に US national reference laboratory で routine clinical practice の data を活用し、≥7 single-gene test での completion rate 14.8% という「実臨床における comprehensive testing の絶望的状況」を初めて 1,000 例規模で定量化した。さらに先行研究は single-gene vs NGS の sample-matched head-to-head 比較を欠いていたが、本研究は sample type stratification で 1-to-1 efficiency を測定した点でこれまでとは異なる。(2) 新規性：本研究で初めて、(a) NCCN guideline 推奨 ≥7 biomarker testing が clinical reality で 14.8% にしか達成されない gap を定量、(b) Oncomine Dx (1 slide のみ) の sample-type-matched completion rate を surgical resection 98.9% / CNB 75.4% / FNA 69.2% で確立、(c) BRAF LDT (7.1 slides) → BRAF cobas (1.0 slide) の study 期間中 transition を tissue consumption 削減の concrete example として記録、(d) Tumor content unknown CNB sample が success rate を著しく低下させる ancillary finding を提示。(3) 臨床応用：本研究は bench-to-bedside で comprehensive genomic profiling (CGP) への移行を支持する key evidence となり、NCCN NSCLC Guidelines (2018 年以降版) で「multi-gene NGS panel を upfront comprehensive testing として推奨」する根拠の一つに引用された。臨床現場では FoundationOne CDx (FDA 承認 324-gene panel)・Oncomine Dx Target Test・Guardant360 (cfDNA NGS) など comprehensive NGS panel が routine first-line testing として広く採用され、本研究の knowledge は biopsy adequacy planning + cytology cell block standardization + reflex testing protocol 構築の institutional policy として運用されている。(4) 残された課題：(a) Single center (1 US commercial laboratory) data に limitation があり multi-center prospective validation が必要、その後 College of American Pathologists (CAP) survey や CGP global adoption study で部分的に裏付けられた、(b) PD-L1 IHC testing は本研究 cohort から除外されており PD-L1 + multi-gene NGS の整合的 testing strategy は別途検討が必要、(c) cfDNA (liquid biopsy)-based NGS は本研究では evaluation せず、tissue insufficient case の rescue strategy としての位置づけは今後の研究の方向性 (Blakely 2017 NatGenet 等で別途展開)、(d) Cost-effectiveness analysis は本研究で実施せず、reimbursement + insurance coverage の institutional implementation barrier の解析が今後の検討事項、(e) RNA-based NGS による fusion gene detection (NTRK・RET・ROS1) は DNA-based NGS で missing fusion を補完するという重要性が後続研究で示されており、本研究時点ではこの distinction が不十分、(f) Limitation として retrospective design による confounding (sample 採取 + 保管条件 + ordering pattern の bias)、また 2015-2016 年 baseline は 2017 年以降の osimertinib first-line / ALK 第二世代 alectinib / ROS1 entrectinib 等の standard 変化を反映せず longitudinal update が必要。
方法
Study design: US-based CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) certified commercial reference laboratory での retrospective analysis。Physician-submitted FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded) lung tissue sample に対する 2015 年 9 月〜2016 年 10 月の clinical single-gene test orders + 2016 年 4-7 月の investigational Oncomine Dx Target Test data を抽出。Laboratory data は test status (successful completion or reason for failure) + tissue slide count を含むが patient mutation status は anonymous (de-identified)。IRB 承認・consent form は不要 (retrospective anonymized data)。Single-gene tests (9 種): therascreen EGFR RGQ PCR Kit (QIAGEN Manchester)・Vysis IntelliFISH for ALK (Abbott)・cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test (Roche)・BRAF/KRAS/MET amplification/RET/ERBB2/FGFR1/ROS1 laboratory-developed test (LDT)。BRAF + KRAS LDT は real-time PCR、他 LDT は fluorescence in situ hybridization。CD274 / PD-L1 testing は 2016 年 3 月以降のみ実施で本研究 cohort から除外。Oncomine Dx Target Test (23 genes): AKT1, ALK, BRAF, CDK4, DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB3, FGFR2, FGFR3, HRAS, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MTOR, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, RAF1, RET, ROS1 を Ion Torrent PGM Dx Sequencer で sequencing。Pre-established investigational protocol で 1 slide / test に制限 (FDA-approved protocol は CNB で ≥9 slides 5 μm sections 推奨)。Sample types: CNB / FNA / surgical resection / cell block。Test success: PCR amplification 成功 + insufficient DNA quantity でない + 良好 DNA quality + tumor sufficient + reportable result。Test cancellation (client cancel / duplicate / NGS conversion) は除外。Tissue consumption: number of slides cut per test を data field から抽出 (blank は分析除外)。Subanalyses: Sample type (CNB/FNA/surgical resection) + CNB tumor content stratification (<25% vs ≥25%)、Oncomine Dx と clinical single-gene testing の success rate を sample type matched で比較。Statistics: Success rate 差は χ² test (sample n>5) または Fisher exact test (n≤5)、p<0.05 を有意とした。Sequential success rate 差 (≥2 vs ≥3 tests 等) も評価。Analyses は SAS version 9.4 (SAS Institute, Cary NC)。Success rate は ≥10 applicable test または sample available 時のみ算出。