- 著者: Andrew R. Nager, Jaclyn S. Goldstein, Vicente Herranz-Perez, Didier Portran, Fan Ye, Jose Manuel Garcia-Verdugo, Maxence V. Nachury
- Corresponding author: Maxence V. Nachury (Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA)
- 雑誌: Cell
- 発行年: 2017
- Epub日: 2016-12-22
- Article種別: Original Article
- PMID: 28017328
背景
一次線毛 (primary cilium) は細胞容積の約1/5,000の容積に Hedgehog (Hh) シグナル・視覚・嗅覚・体重制御等の受容体を集積させる細胞オルガネラで、サイクリックAMP (cAMP) およびCa²⁺の独自濃度を維持しシグナル分子のenter/exitダイナミクスにより制御される (Wang et al. CACMNeurobiol 2016 関連)。活性化Gタンパク質共役受容体 (G protein-coupled receptor: GPCR) の ciliary exit (例: ソマトスタチン受容体3 [somatostatin receptor 3: SSTR3]、GPR161、神経ペプチドY受容体2 [neuropeptide Y receptor 2: NPY2R]、Smoothened) はHh等の シグナル伝達に重要で、conventional pathwayでは β-arrestin 2 と BBSome (Bardet-Biedl syndrome タンパク質複合体、Arf-like GTPase Arl6/Bbs3を伴う) による retrievalで細胞体に戻される (Jin et al. 2010、Lechtreck et al. 2013、McIntyre et al. 2016、Pal et al. 2016)。
最近、単細胞緑藻Chlamydomonasにおいて ectocytosis (ectosome放出) という代替的なciliary exit経路が報告された (Cao et al. 2015、Wood et al. 2013)。ectocytosisでは ciliary または plasma 膜が局所的に外向きに湾曲しextracellular vesicle (EV、ectosomeまたはmicrovesicle) を芽生し、scissionで放出される (Colombo et al. AnnuRevCellDevBiol 2014、Kowal et al. ProcNatlAcadSciUSA 2016)。哺乳類および線虫の cilia関連EVには polycystic kidney disease (PKD) タンパク質 fibrocystin/PKHD1、polycystin-2/PKD2、protrusion-specific protein prominin が検出されているが、これらが ectosome (cilia由来) か exosome (多胞体由来) かは不明で起源は議論の的であった。
先行研究で何が足りなかったかを整理すると、(1) 哺乳類における ciliary ectocytosis の存在自体が未確定で、Chlamydomonasでの所見が進化的に保存されるか不明というギャップ、(2) ectocytosis の trigger分子・budding/scission の機械的機序・retrieval経路との interplay が未解明、(3) ectocytosis が selective process なのか bulk flow disposal なのかという packaging specificity の論争、(4) Bbs (Bardet-Biedl syndrome) 等の retrieval欠損疾患下で ectocytosis が compensatoryに機能するかという臨床関連性の問い、(5) ectocytosisがHedgehog 等の生理的シグナル制御に果たす機能的役割が未検証、という5点のknowledge gapが存在した。これらを哺乳類細胞系で系統的に検証することが急務であった。
目的
活性化ciliary GPCRの ciliary exit における ectocytosis 経路の存在を哺乳類細胞 (IMCD3、MEF) で確立し、(1) ectocytosisの signal-dependence と retrieval failure との関係、(2) 関与する分子機構 (actin、myosin 6、drebrin、Arp2/3、α-actinin 4)、(3) packaging selectivity の定量、(4) BBSome retrieval failure 時の compensatory mechanism としての ectocytosis の機能、(5) Hedgehog Gli3 processing への ectocytosis の必要性、(6) 物理的にretrievalできないNPY2R等のGPCRが ectocytosis に依存することの実証、の6点を達成することを目的とした。
結果
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Arl6⁻/⁻ / β-arrestin2⁻/⁻ / siBBS2 細胞で sst活性化 SSTR3 が ciliary tipに集積し ectosomeとして放出される (Fig 1A-J、Movies S1-S4): 野生型 (WT) IMCD3では sst投与で SSTR3 が β-arrestin2 + BBSome (Arl6) 経由でcilia から retrieval されるが (Fig 1A、n=14-35 cilia)、Arl6⁻/⁻ 細胞では retrieval が失敗し SSTR3 が ciliary tipに顕著集積 (Fig 1B、6時間後、ninein染色で base確認)。Live imaging で tip foci が 21-26秒の急速な scission を経て SSTR3-rich ectosomeとして放出される様子を捕捉 (Fig 1C、1.21 Hz、Movie S2)。同様の所見は siBBS2/siBBS4・β-arrestin2⁻/⁻ (Fig 1D-E)・Ift27⁻/⁻ で確認 (Fig 1F、n=50-87 cilia、cumulated foci frequency over 2 hr)。Tip foci 形成は agonist 活性化を要し、vehicle処理 β-arrestin2⁻/⁻ では < 5%、sst処理では > 66% に形成された (Fig 1G、n=50-76 cilia、simple exponential fit)。SAG処理 (Hedgehog activation) で β-arrestin2⁻/⁻ 細胞の > 85% cilia で GPR161 tip foci 形成 (Fig 1H、2時間後、n=71-73 cilia)。SEMで WTには bud が無いが retrieval mutant では scission間の constriction を持つ ciliary tip buds を可視化 (Fig 1J)。
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Ciliary EVは径 ~100 nm、Arl13B/CD81陽性・CD63/Tsg101陰性で典型 ectosome マーカープロファイル (Fig 2A-B、S2A-D): serum-starved IMCD3培養上清から differential centrifugationで分画した EVは Arl13B + CD81 陽性 (cilia-localized) ・CD63 + Tsg101 陰性 (exosome/MVB由来でない) を示し、ectosome として明確に同定された (Fig 2A、lysate=1 cell equivalent vs EV=100 cell equivalent SDS-PAGE)。Streptavidin-gold で標識した negative stain TEM でも AP-SSTR3 または AP-GPR161 を内包する径 ~100 nm の EV (small EV typical size) を可視化 (Fig 2B、S2B-C、AP-tag 非発現コントロールでは染色なし)。1回のectocytosis event で ciliary SSTR3 の > 30% が単一 tip focus 放出で失われ (Fig 2C-D、Movie S3)、BBSome と β-arrestin 2 も co-ectocytosed (Fig 2E-F)。
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Ectocytosis 効率は WT retrieval と同等 (Arl6⁻/⁻ で SSTR3除去率 1.9‰/min) で頻度低・効率高の bursty kinetics (Fig 2G-I): SSTR3 fluorescence pulse-chase で WT (β-arrestin/BBSome retrieval) と Arl6⁻/⁻ (ectocytosis) を比較すると、両者の cilium全体からのSSTR3除去率は同等 (Fig 2G、n=27-33 cilia、linear fit)。kinetic解析では retrieval は ~2‰/min の steady process、一方 ectocytosis は 0.6% event/min と稀だが各eventで 31% の SSTR3を除去するbursty modeで、aggregate removal rate 1.9‰/min を達成 (Fig 2H、n=167-369 transitions、Student’s t-test p < 2×10⁻⁴/2×10⁻⁸)。Pervasive ectocytosis により Arl6⁻/⁻ cilia は12時間で progressively shortenし length variability も増加 (Fig 2I-S3A-B、n=45-62 cilia)。
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Ectocytosis は activated cargo に選択的で receptor 濃度がectosome内で cilia 比 5倍以上 (Fig 3A-G): β-arrestin2⁻/⁻ + Hedgehog 活性化で ectosome の > 51% が GPR161 を内包 (Fig 3A-B、n=24 ectosomes、Movie S4)、sst刺激で SSTR3 が ectosome内 49% (Fig 1E、3B、S3D)、対して on-pathway外 SSTR3 (SAG刺激の bystander) は ectosome内 16% に留まる (Fig 3A-B)。STAR Methods 計算で SSTR3 の膜密度は cilia 比 ectosome内で >5-fold 高い (active concentration mechanism の存在を示唆)。constitutive vs signal-dependent ectocytosis 比較で、sst 添加 Arl6⁻/⁻ cilia は ACQ090 antagonist 添加に比べ ectosome 産生倍増・SSTR3含量 2倍 (Fig 3D-E、n=38-89 cilia)。
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F-actin / myosin 6 / drebrin / α-actinin 4 / Arp2/3 が ectocytosis に必須・retrieval には不要 (Fig 5-6、Fig 6A-D): NPY2R (BBSome-binding motif欠損、retrieval不可能) を model にして、cytochalasin D (0.5 μM)・blebbistatin・BTP2・TIP・CK-636 (Arp2/3阻害) 全てが NPY2R ectocytic exit を阻害し、SSTR3 retrieval には無影響 (Fig 5A、5I、6C-D、n=11-298 cilia per condition、Mann-Whitney U test p<0.01)。Tip foci lifetime は CytoD 添加で 10-30分 → > 100分に延長 (Fig 5C-D、Movie S6)、SEMで pinch開始済の bud が tipに hyperaccumulate (Fig 5G)。siRNA screen (12分子) で drebrin・Myo6・Actn4 のみが有意に NPY2R exit を抑制 (Fig 6A、multiple regression p<0.02/<0.002、n=72-255 cilia)、tip foci lifetime も drebrin/Myo6 depleted 細胞でのみ延長 (Fig 6B)。Endogenous myosin 6 は Ift27⁻/⁻ + SAG cilia で tip 局在を示し、WT cilia では局在せず (Fig 6E-F、x-z projection、n=78-322 cilia)、drebrin も同様に tip-biased distribution (Fig 6H)。
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Bbs変異細胞で ectocytosis が compensatory に GPR161 を除去し Hh-dependent Gli3R processing を維持 (Fig 7A-H、IMCD3 + MEF): WT cilia では Hh pathway 活性化で GPR161 が80% 減少 (2時間SAG、Fig 7A、n=61-163 cilia)、β-arrestin1/2⁻/⁻ + β-arrestin2⁻/⁻ 細胞でも reduced efficiency で減少。β-arrestin2⁻/⁻ + cytochalasin D (ectocytosis 阻害) で GPR161 除去が完全消失 (Fig 7A)。Gli3 processing 解析 (Fig 7C-H) で、WT IMCD3 では SAG-induced Gli3R/Gli3FL ratio が 5-fold減少、Ift27⁻/⁻ では 2-fold 減少 (Fig 7C-E、n=3 biological replicates)。BTP2 (drebrin阻害、ectocytosis blocker) を Ift27⁻/⁻ に追加すると Hh-dependent Gli3R 減少が完全消失。MEFでも同パターン (Fig 7F-H) を再現し、ectocytosis が retrieval mutant で Hh signaling を支える safety valve として機能することを実証した。
考察/結論
本研究は哺乳類 cilium で活性化 GPCR が BBSome retrieval と ectocytosis という competing な 2 経路で除去されること、ectocytosis が actin/myosin 6/drebrin/Arp2/3/α-actinin 4 依存的に ciliary tip から ectosome として放出されること、Bardet-Biedl syndrome 等 retrieval 欠損疾患下で ectocytosis が compensatory 機構として機能しHedgehog Gli3R processing を維持することを初めて実証した画期的研究である。Signal-dependent ectocytosis は (1) selective (cargo 5-fold以上濃縮)、(2) signal-dependent (受容体活性化が trigger)、(3) actin-driven (微小管モーター不要の独自機構)、(4) physiologically functional (Hh signaling を retrieval 欠損下で維持)、という4特徴を持つ新しい paradigm を提示した。
先行研究との違い: これまで ciliary ectocytosis は Chlamydomonas (Cao 2015、Wood 2013) や 線虫の PKD-EV (Wang 2014) で報告されていたが、哺乳類での conservation と機能的意義は controversial であった。本研究はこれら先行研究と異なり、retrieval (BBSome経路) と ectocytosis を 1 細胞系 (IMCD3) で同時に定量比較し、両者が competing parallel pathwaysであることを示した。Mukhopadhyay 2013 (Mukhopadhyay et al. Cell 2013) は GPR161 が Hh negative regulator として機能することを示したが、retrieval欠損下での Gli3 processing が ectocytosis に救済される機序は本研究で初めて解明された。Pan 1985 (Pan et al. JCellBiol 1985) の reticulocyte transferrin receptor 放出と対照的に、本研究は EV が単なる disposal でなく selective sorting + functional regulation の役割を持つことを示した。
新規性: 本研究で初めて (1) 哺乳類 ciliary ectocytosis の存在を直接実証 (live imaging + SEM + EV proteomics)、(2) actin/myosin 6/drebrin/Arp2/3/α-actinin 4 という novel な分子機構を ectocytosis scission 装置として同定 (これまで報告されていない)、(3) 物理的に retrieval 不可能な NPY2R (BBSome-binding motif 欠損) が WT cilia でも ectocytosis に sole 依存することを示し、receptor の構造的特性が exit pathway を決定する新規 paradigm を提示、(4) BBSome retrieval ↔ ectocytosis の cooperative + compensatory 関係を Bbs cilopathy の文脈で機能的に解明した。
臨床応用の含意: (a) Bardet-Biedl syndrome (肥満・retinitis pigmentosa・多指症・腎異常・知的障害) や polycystic kidney disease (ADPKD/ARPKD) 等の ciliopathy における ectocytosis 補償機構の解明は、これらの疾患の mild phenotype (cilia完全欠損より軽症である理由) を説明し、新たな bench-to-bedside 治療標的を提示する。(b) Ectocytosis 阻害剤 (BTP2、TIP、CK-636) は Bbs 患者で表現型を悪化させる薬剤として注意が必要、逆に ectocytosis 促進剤は cilopathy 治療として臨床応用可能性がある。(c) NPY2R を介した食欲制御 (anorexigenic GPCR、視床下部) の ectocytosis 依存性は、肥満治療として ectocytosis 修飾薬の開発の臨床的意義を示唆。(d) Sonic Hedgehog signaling 異常を持つ髄芽腫・基底細胞癌での ectocytosis の関与解明と治療標的化も臨床現場で検討課題。
残された課題: (1) Actin polymerization の trigger 分子の同定 (受容体活性化からどの signal cascade が ectocytosis machinery を recruit するか) が今後の検討課題、(2) ectosome cargo の selective sorting 機構 (tetraspanin・prominin・lipid microdomain の役割) の解明、(3) ectocytosis 特異的阻害剤・促進剤の創薬 (現在の阻害剤は actin系全般に作用)、(4) 放出された ciliary ectosome が受容体細胞に bioactive signal を伝達するか (cell-autonomous regulation のみか cell-cell communication 介在か) の検証は今後の展望、(5) PKD-EV、SAG1-EV、GPCR-EV が共通の ectocytosis 機械から生成されるかという進化的保存性の証明、(6) 視覚 (photoreceptor disc formation) や精子 flagellar exit における同様 ectocytosis 機構の存在検証が limitation として残された課題である。
方法
細胞株と遺伝子発現: マウス腎集合管 (inner medullary collecting duct: IMCD3) 細胞を使用 (10% FBS入りDMEM、37°C、5% CO₂)。内在性プロモーター駆動の AP-SSTR3-NeonGreen (NG、biotin acceptor peptide融合)、AP-GPR161-NG3、NPY2R-NG、β-arrestin2-GFP、NG3-BBS5 等を IMCD3に安定発現させた。Knockout細胞: Arl6⁻/⁻、β-arrestin2⁻/⁻、β-arrestin1/2⁻/⁻、Ift27⁻/⁻ (CRISPR/Cas9で生成)。RNAi: BBS2、BBS5、drebrin (Dbn1)、myosin 6 (Myo6)、α-actinin 4 (Actn4)、utrophin (Utrn)、Kif13b、cordon-bleu (Cobl)、Cobll1、Mypt1、Capzb、Actn1、Myo7a、Epb41l4a の siRNA depletion (Lipofectamine RNAiMAX)。マウス胎仔線維芽細胞 (MEF) も Hh signaling検証に使用。
配体・受容体活性化・阻害剤: SSTR3を somatostatin (sst、1 μM) で活性化、GPR161を Smoothened agonist (SAG、200 nM) で間接活性化 (Hh pathway activation経由)、NPY2Rを neuropeptide Y 3-36 (NPY3-36、1 μM) で活性化、SSTR3 antagonist ACQ090 (Novartis提供)。Actin/myosin阻害剤: cytochalasin D (CytoD、0.5 μM、actin polymerization阻害)、blebbistatin (bleb、myosin II阻害)、jasplakinolide (Jas、15 μM、actin stabilizer)、latrunculin A (LatA、1 μM、actin monomer-sequestering)、BTP2 (1 μM、drebrin阻害)、2,4,6-triiodophenol (TIP、25 μM、myosin 6阻害)、CK-636 (50 μM、Arp2/3阻害)、SMIFH2 (25 μM、Formin 2阻害)、emetine (translation阻害)。
EV単離と特性評価 (ISEV2014-2018 framework準拠): serum-starved IMCD3培養上清 (sst または SAG処理16時間後) を differential centrifugationで分画。Lysate (1 cell equivalent) と EV分画 (100 cell equivalent) を SDS-PAGE/immunoblotで比較解析: cilia-localized markers Arl13B + CD81 陽性、exosome marker CD63 (Kowal et al. ProcNatlAcadSciUSA 2016) + ESCRT-1 protein Tsg101 (Nabhan et al. ProcNatlAcadSciUSA 2012) 陰性で ectosome 同定。EV imaging: 抗AP-tag streptavidin-conjugated gold particles (5 nm) で標識し negative stain透過電子顕微鏡 (negative stain TEM、uranyl acetate) で EV径 (100 nm前後) と GPCR積荷を可視化。
Live cell imaging: AP-SSTR3-NG を streptavidin-Alexa647 (SA647) で pulse label、SSTR3-NeonGreen channel 10分間隔で2-12時間 timelapse撮影 (1.21 Hz、Movies S1-S6)、ciliary base/tip での蛍光強度を ImageJで定量、ectosome scission events 個別追跡。Cilia数 n=14-298 per condition (実験ごとに記載)。
走査型電子顕微鏡 (scanning electron microscopy: SEM): WT / Arl6⁻/⁻ / β-arrestin2⁻/⁻ IMCD3 を sst (1時間)、SAG、cytochalasin D + NPY3-36 等で処理後固定し、ciliary tip構造を観察。Tip bud形成 (scission前の構造) を定量。
Hedgehog reporter assay: IMCD3 または MEF を血清飢餓24時間後、vehicle / SAG / BTP2 / TIP / cytochalasin Dで8時間処理し全タンパク質をRIPA抽出、抗GLI3抗体 (6F5、Suzie Scales提供) で ウエスタンブロット解析。Gli3R/Gli3FL比 (Gli3 processing index = SAG-induced ratio / vehicle ratio) を 3 biological replicatesで定量。
統計解析: Student’s t-test (両側、p<0.01/0.0001)、Mann-Whitney U test (non-parametric)、multiple regression analysis (RNAi screening比較)。Data fit: linear/exponential decay/Hill equation。誤差バーは SD または SEM (図ごとに表記)、n値は cilia 14-327 per condition、ectosome 11-43 per analysis。