- 著者: Pengcheng Zhang, Yahui Gao, Yaxin Wang, Xin Li, Yi Jiang, et al.
- Corresponding author: Hui Zheng, Wen Li, Xu Jin (National Cancer Center/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College)
- 雑誌: Cell Reports Medicine
- 発行年: 2026
- Epub日: 2026-06-16
- Article種別: Original Article
- PMID: 42140195
背景
敗血症（sepsis）は入院患者における主要な死因の一つであり、感染に対する宿主免疫応答の深刻な調節不全を特徴とする。急性期における過剰な炎症反応（サイトカインストーム）と、それに続く、あるいは並存する後期免疫抑制という二相性の複雑な病態が、治療を極めて困難にしている本質である（Singer et al. 2016; van der Poll et al. 2017）。現行の臨床治療は、感染源の制御、早期の抗菌薬投与、および臓器不全に対する支持療法に限定されており（Dugar et al. 2020; Rhodes et al. 2017）、免疫調節異常そのものを有効に解消する根本的な治療介入は未だ確立されていない。この複雑な免疫微小環境を標的とする治療戦略は未確立であり、新たなアプローチが強く求められている。
好中球は、敗血症の炎症期および免疫抑制期の双方において中心的な役割を果たす自然免疫細胞である（Kolaczkowska and Kubes 2013; Nauseef and Borregaard 2014）。通常の組織修復過程では、好中球は病原体を貪食した後にアポトーシス（programmed cell death）を経ることで炎症の収束へと向かう（Kotzin et al. 2016）。しかし敗血症病態下では、炎症シグナルへの持続的な暴露により、好中球の機能不全とアポトーシス遅延が生じる（Soehnlein et al. 2017）。この長期生存する機能不全好中球（老化様好中球）は、過剰な炎症性サイトカインや好中球細胞外トラップ（NETs: neutrophil extracellular traps）を放出して組織障害を悪化させるだけでなく（Clark et al. 2007; Fuchs et al. 2010）、T細胞の共阻害分子であるPD-L1（CD274）を高発現する（Yu et al. 2022）。好中球上のPD-L1とT細胞上のPD-1の相互作用は、T細胞の活性化を減弱させ、T細胞疲弊（T cell exhaustion）と深刻な免疫抑制をもたらす（Yang et al. 2024）。この好中球のアポトーシス遅延とPD-L1を介したT細胞抑制は、敗血症における過剰炎症と免疫抑制の両方を駆動するコア因子である。
サイクリン依存性キナーゼ阻害薬（CDKI: cyclin-dependent kinase inhibitor）は、細胞周期進行を阻害することで好中球アポトーシスを促進する新たな戦略として注目されている（Wu et al. 2022; Kim et al. 2024）。AT7519は代表的なCDKIであり、好中球アポトーシス促進効果に加えて、TNF（tumor necrosis factor）転写抑制やヒストンH3シトルリン化調節といった多面的な抗炎症効果を持つことが報告されている（Dorward et al. 2017）。しかし、CDKIは標的特異性に欠け、正常な免疫細胞にも影響を及ぼすため、全身性の毒性や好中球減少症（neutropenia）による免疫抑制を引き起こす危険性があり、臨床応用が制限されていた（Goel et al. 2017; Jaeger et al. 2012）。このため、老化様好中球に選択的に薬物を送達し、同時にPD-1/PD-L1チェックポイントを遮断してT細胞疲弊を軽減する、精密な標的化治療戦略が不足しているという課題（knowledge gap）があった。本研究はこの不足している治療アプローチを開発し、敗血症の免疫恒常性を再構築することを目指した。
目的
本研究の目的は、敗血症における過剰炎症と免疫抑制という二相性の免疫調節不全を同時に治療するため、老化様好中球への選択的薬物送達とPD-1/PD-L1チェックポイント遮断を両立する多機能性人工エクソソームナノ複合体であるAT@NV-PD1（AT7519-loaded nanovesicle presenting PD-1）を設計・構築し、その治療効果と詳細な分子機序をマウス敗血症モデルを用いて検証することである。
具体的には、AT@NV-PD1が老化様好中球上のPD-L1に特異的に結合してホーミングし、細胞内の酸性環境に応答してCDK（cyclin-dependent kinase）阻害薬AT7519を放出することで好中球アポトーシスを誘導し、同時にPD-1/PD-L1シグナルを物理的に遮断することでT細胞疲弊を解除し、多臓器不全（MODS: multiple organ dysfunction syndrome）の抑制、早期死亡率の改善、さらには二次感染リスクの低下と後期生存率の向上を相乗的に達成できるかを実証することを目的とする。
結果
敗血症好中球の機能不全とアポトーシス遅延の同定: 敗血症患者から単離した末梢血好中球は、健常対照群と比較してin vitro培養21時間後のアポトーシス率が有意に低下していた（p<0.0001、Figure 1B, 1C）。RNA-seq解析の結果、敗血症好中球では1,607遺伝子が上方制御され、1,156遺伝子が下方制御されていた（Figure 1D）。KEGGパスウェイ解析では、これらのDEGsがPD-1/PD-L1シグナル伝達経路やT細胞受容体シグナル伝達経路に著しく濃縮されていることが判明した（Figure 1E）。特に、免疫抑制分子であるCD274（PD-L1）や、NETs形成に関与するPADI4、脱顆粒マーカーCEACAM8の上方制御が確認された一方、老化好中球のアポトーシスを促進するCXCR4は著しく下方制御されていた（Figure 1H）。
AT@NV-PD1の標的特異性とナノデコイ機能: In vitroにおいて、LPSおよびIFN-γで刺激した老化様好中球（n=5 replicates）に対するAT@NV-PD1の結合親和性を評価したところ、静止期好中球やPD-1を提示しないAT@NVと比較して約3.0-fold increase（3倍に増加）した高い蛍光強度が観察された（Figure 2G, Figure S8）。この結合は抗PD-L1抗体による前処理で著しく阻害され、PD-1/PD-L1相互作用に依存していることが証明された（Figure 2H）。In vivoのCLPマウスモデル（n=5 mice）において、静脈投与されたAT@NV-PD1は、血液中の全陽性細胞のうち好中球（Ly6G+, CD11b+）が43.43%を占め、単球の14.14%やT/B/NK細胞（いずれも10%未満）と比較して極めて高い選択性で好中球に集積した（Figure 2K, 2L）。さらに、AT@NV-PD1はマクロファージ膜由来の受容体を介して、TNF-α、IL-1β、IL-6、sPD-L1、およびLPSを効率的に吸着・中和する「ナノデコイ」機能を示した（Figure 2M-Q）。
早期臓器障害（MODS）の軽減と生存率の劇的改善: CLP誘発敗血症マウスにおいて、AT@NV-PD1の投与はPBS投与群と比較して敗血症スコア（MSS）および体重減少を有意に抑制し（p<0.001、Figure 4B, 4C）、早期死亡率を劇的に低下させた（n=10 mice、Figure 4D）。組織病理学的解析（H&E染色）では、肺における肺胞中隔の肥厚や炎症細胞浸潤、肝臓のうっ血、脾臓におけるTUNEL陽性アポトーシス細胞の増加がAT@NV-PD1治療によって顕著に改善された（Figure 4E, 4F、n=5 mice）。血清生化学検査において、肝障害マーカーであるALT（120 vs 450 U/L、p<0.001）やAST（180 vs 580 U/L、p<0.001）、腎障害マーカー（BUN、CRE）、および心筋障害マーカー（CK-MB）の異常値が、AT@NV-PD1群でほぼ正常値付近まで回復した（Figure 4H-L、n=5 mice）。
サイトカインストームと免疫血栓（Immunothrombosis）の制御: AT@NV-PD1治療は、血液およびBALF（bronchoalveolar lavage fluid）中の好中球浸潤数と、TNF-α、IL-1β、IL-6などの主要な炎症性サイトカイン濃度を、PBS群およびAT NP単独群と比較して有意に減少させた（p<0.001、Figure 5A-H、n=5 mice）。in vitroの好中球（n=5 replicates）において、AT@NV-PD1は炎症性サイトカインIL-6の放出を低下させた（log2FC -2.5、p<0.0001）。肺組織におけるMPOおよびCitH3の共局在（NETsの指標）は、AT@NV-PD1群でほぼ完全に消失した（Figure 5I）。さらに、凝固系マーカーであるTAT（thrombin-antithrombin）複合体、PAI-1（plasminogen activator inhibitor-1）、D-dimer、およびフィブリノゲンの上昇が有意に抑制され、減少していた血小板数が回復した（Figure 5M-Q、n=5 mice）。肺および肝組織のフィブリン免疫染色では、微小血栓の形成が劇的に減少していることが確認された（Figure 5J-L）。
二次感染の予防と後期生存率の向上: CLP術後7日目にP. aeruginosaを気管内接種した二次感染モデルにおいて、PBS治療群のマウスは14日以内に57.1%の累積死亡率に達したのに対し、AT@NV-PD1治療群の死亡率は16.6%に抑えられ、生存率が極めて有意に向上した（p<0.001、Figure 6B、n=15 mice）。また、BALF、脾臓、腎臓、肝臓、および血液における細菌コロニー形成単位（CFU）を測定したところ、AT@NV-PD1群は他のすべての治療群と比較して、各臓器の細菌負荷（CFU/g）を100分の1から1000分の1のレベル（p<0.0001、Figure 6F-K、n=5 mice）にまで減少させ、優れた細菌クリアランス能を示した。
T細胞疲弊の解除と免疫恒常性の回復: CLP術後5日目の末梢血解析（n=5 mice）において、PBS群ではCD4/CD8 T細胞比が著しく低下していたが、AT@NV-PD1治療群では正常に近い比率に維持されていた（Figure 7A-C）。また、敗血症後期に免疫抑制を誘導する調節性T細胞（Treg: CD4+, CD25+, Foxp3+）および単球性骨髄由来抑制細胞（M-MDSC: CD11b+, Ly6C_high, Ly6G-）の割合が、AT@NV-PD1治療によって sham群と同等のレベルにまで減少した（Figure 7F-J、n=5 mice）。さらに、脾臓および末梢血におけるT細胞のアポトーシスが有意に抑制され（Figure 7D, 7E）、sPD-L1のトラップを介してPD-1/PD-L1シグナル軸が効果的に遮断されていることが確認された（Figure S21）。
生体内安全性と骨髄造血への影響: 健常マウス（n=5 mice）にAT@NV-PD1を7日間連続投与しても、体重、血液学的パラメータ、肝腎機能、および主要臓器の組織像に異常は認められず、高い生体適合性が示された（Figure S24）。また、二重LPSチャレンジモデルにおいて、AT@NV-PD1治療を受けた敗血症回復期マウスは、二次的な気管内LPS刺激に対して健常対照群と同等の好中球動員能およびサイトカイン産生能を維持しており（Figure 7K-O、n=5 mice）、骨髄における新生好中球の産生能（造血機能）を損なうことなく、老化様好中球のみを選択的に排除できていることが実証された。
考察/結論
本研究は、敗血症における「過剰炎症」と「免疫抑制」という相反する二相性の免疫調節不全を、単一のナノプラットフォームで同時に制御する革新的な人工エクソソーム治療薬AT@NV-PD1を開発し、その有効性を実証した。
先行研究との違い: 従来の好中球標的戦略（抗炎症薬や抗体による全身抑制）は、健常な好中球と病的な好中球を区別できず、重篤な好中球減少症や宿主の抗菌免疫防御能の破綻を招くリスクが高かった（Jaeger et al. 2012）。本研究のアプローチは、老化様好中球に特異的に過剰発現しているPD-L1を標的分子として利用する点で、これまでの非選択的治療法と大きく異なる。また、従来の血液浄化療法（非特異的な炎症メディエーター除去）は有益な免疫分子まで除去してしまう欠点があったが、AT@NV-PD1のナノデコイ機能はマクロファージ膜上の特異的受容体を介して有害なサイトカインや毒素のみを選択的に吸着・中和するため、極めて高い選択性と安全性を両立している。
新規性: 本研究は、PD-1を表面に高発現させた人工マクロファージ膜小胞（PD-1 NV）と、pH応答性アルブミンナノコア（AT NP）を融合させたコアシェル型ナノ複合体が、敗血症における老化様好中球に選択的にホーミングし、細胞内酸性環境応答性のAT7519放出を介してタイムリーな好中球アポトーシスを誘導することを本研究で初めて示した。さらに、この結合自体がPD-1/PD-L1免疫チェックポイントを物理的に遮断し、好中球によるT細胞抑制を解除してT細胞疲弊を逆転させるという、多面的な相乗効果を同一粒子で達成した点はこれまで報告されていない極めて新規性の高い知見である。
臨床応用: 敗血症治療における最大のボトルネックは、早期の急性臓器不全（早期死亡）と、後期の免疫抑制に伴う二次感染（後期死亡）の双方に対処できる薬剤が存在しない点であった。AT@NV-PD1は、早期のMODSおよび免疫血栓症を抑制すると同時に、後期のT細胞機能を回復させて二次感染（P. aeruginosa肺炎）による死亡率を劇的に低下させた。この「早期・後期双方の死因を同時に標的化する」治療コンセプトは、敗血症生存者の約3分の1が退院後1年以内に二次感染等の合併症で死亡するという現代医療の深刻な課題に対する画期的な解決策（bench-to-bedside）となり得る。
残された課題: 本研究における主なlimitationとして、治療効果の検証がマウスCLPモデルおよびLPSモデルに限定されており、ヒト敗血症の高度な異質性（原因菌の違い、基礎疾患、年齢、性差など）を完全には模倣できていない点が挙げられる。特に、本研究では雌性マウスのみを実験対象としており、性ホルモンが免疫応答に与える影響を考慮した雄性モデルでの検証が今後の検討課題である。また、PD-L1は老化様好中球以外の細胞（腫瘍細胞や一部の抗原提示細胞）にも発現しているため、他臓器におけるoff-target効果の有無について、大動物モデルを用いた長期的な安全性・毒性評価および薬物動態（PK/PD）解析を進める必要がある。
方法
AT@NV-PD1の設計および製造: PD-1を安定過剰発現するように遺伝子操作したRAW 264.7マクロファージ株（RAW264.7-PD-1）を樹立した。遺伝子導入にはEGFP-PD-1-PLVX-puroプラスミド（EGFP: enhanced green fluorescent protein）を用い、ピューロマイシン選択を行った。フローサイトメトリー解析により、細胞膜上に99.4%の発現率でPD-1が提示されていることを確認した。この細胞から窒素液凍結融解および物理的押し出し法を用いて膜小胞（PD-1 NV）を調製した。一方、薬物担体として、疎水性ポケットを持つウシ血清アルブミン（BSA: bovine serum albumin）にCDKIであるAT7519を搭載し、pH応答性のSchiff塩基結合を形成する架橋剤（CHO-PEG-CHO）を用いてナノコアであるアルブミンナノコア（AT NP）を合成した。AT7519の封入効率は定量質量分析（QMS: quantitative mass spectrometry）により78.5-85.1%の範囲内であることを確認した。最終的に、PD-1 NVとAT NPを質量比1:1で混合し、ポリカーボネート膜（ポアサイズ400 nmおよび1 μm）を用いて繰り返し共押し出しすることで、コアシェル構造を持つ人工エクソソームナノ複合体（AT@NV-PD1、流体力学径約130 nm）を製造した。
臨床検体解析: 敗血症患者（Sepsis-3基準に合致する入院患者）および健常ボランティアから末梢血を採取し（各n=3 donors）、好中球を分離精製した。in vitroで21時間培養した後のアポトーシス率をAnnexin V/PI（propidium iodide）染色およびフローサイトメトリーで評価した。また、好中球から全RNAを抽出し、DNBSEQプラットフォームを用いたRNA-seq（RNA sequencing）解析を実施した。差次発現遺伝子（DEGs: differentially expressed genes）の同定、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）パスウェイ解析、GO（Gene Ontology）解析、およびGSEA（Gene Set Enrichment Analysis）を実施した。RNA-seqデータはSequence Read Archive（SRA）にPRJNA1445962として登録した。
In vitro評価: マウス骨髄から分離した好中球（n=5 replicates）をIFN-γ（100 U/mL）およびLPS（100 ng/mL）で刺激し、PD-L1を高発現する老化様好中球モデルを誘導した。蛍光（Cy5）標識したナノ粒子を用いて、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM: confocal laser scanning microscopy）およびフローサイトメトリーにより、AT@NV-PD1の結合特異性を評価した。また、アポトーシス誘導能、ミトコンドリア膜電位（MitoTracker Red）、Caspase-3活性、およびNETs形成（MPO/CitH3免疫染色、SYTOX Green染色）への影響を評価した。
In vivo評価: C57BL/6雌性マウス（10週齢、n=10 mice per group）を用い、盲腸結紮穿刺（CLP: cecal ligation and puncture）手術により多菌性敗血症モデルを誘導した。術後6時間および12時間に、PBS、AT NP、またはAT@NV-PD1（AT7519相当量5 mg/kg）を尾静脈投与した。術後5日目に末梢血を採取し、T細胞サブセット（CD4+、CD8+、Treg、M-MDSC）をフローサイトメトリーで定量した。二次感染モデルとして、CLP術後7日目に気管内（IT）にPseudomonas aeruginosa（PAO1株、1×10^8 CFU/50 μL）を接種し、14日間の生存率および各臓器（肺、肝、脾、腎、血液）の細菌負荷（CFU/gまたはCFU/mL）を測定した。統計解析にはGraphPad Prism 9.0を使用し、2群間比較にはunpaired Student’s t-test、多群間比較には一元配置分散分析（one-way ANOVA）後にTukeyの多重比較検定を行った。生存曲線はlog-rank検定で解析した。