Proteomics-mass-spec

Proteomics / Mass spectrometry

一行要約

Proteomics (LC-MS/MS) はタンパク質の網羅的発現定量・翻訳後修飾 (PTM)・対話型相互作用を捉える手法で、肺癌領域では CPTAC LUAD (Gillette et al. Cell 2020、Xu et al. Cell 2020) と CPTAC SCLC (Liu et al. Cell 2024) が genomic-proteomic 統合の paradigm を確立し、phospho-proteomics による kinase signaling の薬剤標的同定 (Rikova et al. Cell 2007) と immunopeptidomics による HLA リガンド網羅 (Abelin et al. Immunity 2019、Chong et al. NatBiotechnol 2022) が IO 時代の neoantigen 同定を支える。

一行要約 (補足)

Lehtio et al. NatCancer 2021 が NSCLC の proteogenomic subtype (IL-6 driven inflammatory / AKT 活性化型ほか) と immune evasion を proteomics 主軸で同定。Soltis et al. CellRepMed 2022 が CPTAC の独立検証 cohort で proteogenomic biomarker を validate、Petralia et al. Cell 2024 が pan-cancer proteogenomic immune signature を確立した。

メカニズムとプラットフォーム

標準ワークフロー (bottom-up shotgun proteomics)

(1) 抽出: 凍結組織 / FFPE / cell pellet → SDS / urea buffer で溶解、超音波 → 還元 / アルキル化 → 酵素消化 (trypsin が標準、Lys-C / chymotrypsin / Glu-C 補助)。(2) 分画: high-pH RP-HPLC / SCX で 12–24 fraction に分け depth を確保。(3) 濃縮 (必要時) : phospho (IMAC / TiO2 / Fe-NTA)、glyco (lectin / hydrazide)、acetyl (acetyl-Lys IP)、ubiquitin (K-ε-GG)、HLA peptide (W6/32 IP)。(4) LC-MS/MS: nano-LC (PepMap C18, 75 μm × 50 cm) + Orbitrap (Eclipse / Astral) / timsTOF。(5) 取得 mode: DDA / DIA / SRM-PRM。(6) 同定 / 定量: MaxQuant、Spectronaut、DIA-NN、Skyline、Proteome Discoverer。(7) 下流解析: limma / DEqMS (Zhu et al. NatProtoc 2026)、batch correction (Cuklina et al. MolSystBiol 2021)。

主要 quantitation 戦略

戦略	原理	強み	弱み
Label-free (LFQ)	MS1 intensity / spectral count	サンプル無制限、低コスト	再現性中
TMT (10–18plex)	同質量タグで MS3 で定量	High multiplexing、batch 内精度	Ratio compression、TMT plex 間 batch effect
SILAC	培養細胞に 13C/15N アミノ酸	細胞 / mouse model で精度高	組織で適用困難
DIA (SWATH / staggered window)	全 m/z 範囲を window-based で fragmentation	再現性最高、欠損値少	大規模 spectral library 必要
Targeted (SRM/MRM/PRM)	特定 peptide を高感度・絶対定量	臨床 biomarker validation	多重度低

派生 / 関連手法

• Phospho-proteomics: kinase signaling の活性プロファイリング、肺癌 driver kinase (ALK / ROS1 / EGFR / MET) の発見と drug target 同定 (Rikova et al. Cell 2007)
• Immunopeptidomics / HLA-MS: HLA 分子に提示される peptide を直接同定 → tumor neoantigen 候補 (Abelin et al. Immunity 2019、Chong et al. NatBiotechnol 2022)
• Surfaceome / cell-surface proteomics: 細胞表面タンパクの biotinylation 濃縮 → CAR-T / ADC target discovery (Mandal et al. NatCancer 2023、Ferguson et al. NatCommun 2022)
• Single-cell proteomics: SCoPE-MS / nanoPOTS / Astral プラットフォームで数百〜数千タンパクを single cell から定量、scRNA-seq とのクロス検証
• Spatial proteomics: MIBI-TOF / IMC / DSP (GeoMx) / CODEX で細胞位置情報付き taq / antibody-based 定量
• EV proteomics: 血漿 / 体液 EV のタンパク profiling、肺癌 biomarker 探索 (Hoshino et al. Cell 2020、Kugeratski et al. NatCellBiol 2021)

主要エビデンス (肺癌領域での貢献)

CPTAC NSCLC proteogenomics

Gillette et al. Cell 2020 が CPTAC LUAD 110 例で TMT-labeled global / phospho / acetyl proteomics + WES + RNA を統合、driver mutation 別の signaling rewiring (EGFR-mutant の MAPK 残存活性、KRAS-mutant の Rho/Rac 強化) と免疫 cold/hot subtype を proteogenomically 定義した landmark。同年 Xu et al. Cell 2020 が中国 CAPRI cohort で LUAD proteome 3 subtype (S-I / S-II / S-III) と HSP90AB1-driven aggressive subtype を同定し、地理 / 遺伝的 ancestry 横断の robustness を示した。Soltis et al. CellRepMed 2022 は独立 cohort で CPTAC subtype を再現、survival determinant としての proteomic feature を validate。Lehtio et al. NatCancer 2021 は欧州 NSCLC で proteomics 主軸の 6 subtype を同定、IL-6 driven inflammatory subtype と AKT 活性化型を識別。Park et al. CancerRes 2024 は never-smoker LUAD without EGFR/ALK で estrogen signaling を治療標的候補として同定。

CPTAC SCLC

Liu et al. Cell 2024 が CPTAC SCLC で proteomics + phospho + acetyl + WGS + RNA を統合、ASCL1 / NEUROD1 / POU2F3 / inflamed の 4 subtype (SCLC-molecular-subtypes) に対し subtype 特異的 therapeutic vulnerability (SCLC-A の BCL2、SCLC-N の Aurora、SCLC-P の PARP1、SCLC-I の IO 感受性) を proteomic レベルで裏付けた。Quintanal-Villalonga et al. CancerDiscov 2021 は LUAD → SCLC transformation の proteomic / transcriptomic シグネチャを同定。

Phospho-proteomics と driver kinase

Rikova et al. Cell 2007 は pan-pTyr IP + LC-MS/MS で NSCLC 細胞・組織から ALK / ROS1 を含む oncogenic kinase をスクリーニングした paradigm-shifting study、現在の fusion driver 治療の foundation。EGFR 耐性研究では Jacobsen et al. NatCommun 2017 が phospho-proteomics で AKT axis convergence を示し、Solanki et al. ClinCancerRes 2021 は KRAS G12C 阻害下の細胞種別 signaling rewiring を解明。

Immunopeptidomics と neoantigen

Abelin et al. Immunity 2019 が HLA class II ligand を MS で網羅、binding rule を改良し epitope 予測精度を向上。Chong et al. NatBiotechnol 2022 は immunopeptidomics による tumor-specific antigen の direct identification の現状と pitfall (contamination、low abundance) を整理。

Pan-cancer / TME proteomics

Petralia et al. Cell 2024 は pan-cancer proteogenomic immune profiling で IO 応答関連 protein signature を確立。Zhang et al. CancerCell 2017 が PI3K/AKT/mTOR pathway の proteogenomic atlas を作成。

EV / liquid biopsy proteomics

Hoshino et al. Cell 2020 が血漿 EV 由来 protein で multiple cancer の組織起源を識別、Kugeratski et al. NatCellBiol 2021 が EV core proteome を体系化。NSCLC 領域では Bao et al. TranslLungCancerRes 2022 が血漿 EV proteomics で NSCLC biomarker を探索。

限界と pitfall

解析的限界

• Dynamic range: 血漿で 10^10、組織で 10^7 以上のダイナミックレンジ → albumin / IgG depletion や top-down fractionation が必要、low-abundance protein (cytokine、TF) は missed
• Identification ambiguity: shared peptide 問題 (paralog / isoform)、protein inference は parsimonious model に依存
• PTM stoichiometry: phospho-site の生体内 stoichiometry は通常未決定、kinetic 解析には SILAC pulse-chase が必要
• FFPE compatibility: 架橋による recovery 低下、PTM 保存も限定的 (acetyl / methyl の loss)
• Batch effect: TMT plex 間・LC-MS run 間の batch effect、bridge channel + ratio normalization で軽減
• Missing values: 特に DDA で MS1 検出されても MS2 が欠落、imputation 戦略が重要
• Single-cell proteomics の感度: 数百〜数千タンパク (scRNA-seq の数千 gene と互角だが、PTM や low-abundance signaling は未到達)

Best practice

• MaxQuant / Spectronaut の standard pipeline 使用
• Bridge channel の TMT 配置で plex 間正規化
• Spectral library の事前構築 (DIA) または DIA-NN library-free
• DEqMS による分散モデル化 (Zhu et al. NatProtoc 2026)
• Multi-omics integration で proteomics 単独の noise を補正

Open Questions

• Single-cell proteomics の routine 化 — sensitivity / throughput / cost のいずれが律速か
• Phospho-stoichiometry の絶対定量 — 機能的 phospho-event の臨床 actionability
• Immunopeptidomics の clinical translation — neoantigen-targeted vaccine / TCR-T の screening platform 化 (Rojas et al. Nature 2023)
• Spatial proteomics の cell-type resolution — IMC / MIBI / CODEX vs MS-based approach
• Cross-platform standardization — TMT vs DIA vs LFQ で proteome quantification の互換性
• AI / ML による spectral interpretation — DIA-NN / Casanovo 等の deep learning 同定

重要論文 Top 10

1. ★★★★★ Gillette et al. Cell 2020 — CPTAC LUAD proteogenomics、driver 別 signaling rewiring と therapeutic vulnerability の foundation
2. ★★★★★ Liu et al. Cell 2024 — CPTAC SCLC、4 subtype の therapeutic vulnerability を proteomic に裏付け
3. ★★★★★ Rikova et al. Cell 2007 — pan-pTyr proteomics で ALK / ROS1 等 NSCLC oncogenic kinase をスクリーニング、precision oncology の起点
4. ★★★★ Lehtio et al. NatCancer 2021 — NSCLC proteogenomic 6 subtype、IL-6 inflammatory / AKT 活性化型を proteomics 主軸で識別
5. ★★★★ Abelin et al. Immunity 2019 — HLA-II immunopeptidomics、IO neoantigen 予測の MS-based foundation

関連エンティティ

• Bulk-RNA-seq / scRNA-seq / Flow-cytometry-CyTOF
• EGFR / EGFR-TKI
• Machine-learning-AI

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