- 著者: Reka A. Haraszti, Marie-Cecile Didiot, Ellen Sapp, et al.
- Corresponding author: Anastasia Khvorova, Neil Aronin (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)
- 雑誌: Journal of Extracellular Vesicles (Vol 5: 32570)
- 発行年: 2016
- Epub日: 2016-11-17
- Article種別: Original Article
- PMID: 27863537
背景
EV (Extracellular Vesicle) は exosome (30-100 nm、endosome / MVB 由来) と MV (Microvesicle, 100-1000 nm、原形質膜 plasma membrane 由来) に大別され、細胞間コミュニケーション・疾患診断・治療薬送達の観点から注目されている (先行研究 CellTissueRes 2013 が EV 総説で体系化)。Cancer-derived exosome の機能 (Hoshino et al. Nature 2015 の organotropic metastasis)・MVB biogenesis (Trajkovic et al. Science 2008 の ceramide-driven budding)・Rab27a/b 制御 (Ostrowski et al. NatCellBiol 2010) が逐次明らかにされてきた。
しかしこれまで以下のギャップが 未解明 のまま残されていた。第一に、exosome と MV の分子組成差・細胞起源特異性についての系統的高分解能解析が 不足 していた (これまで何が足りなかったか①: EV subtype 分子定義)。第二に、多細胞起源間 (がん vs 正常 vs MSC (Mesenchymal Stem/stromal Cell)) でのプロテオーム + リピドーム同時比較研究が限定的であった (これまで何が足りなかったか②: cross-source 比較)。第三に、ISEV による MISEV (Minimal Information Studies Extracellular Vesicles) ガイドライン策定 (2018 年公開予定) に向け、subtype 識別の参照データセットが必要だったが controversial な議論が続いていた (これまで何が足りなかったか③: 標準化基盤)。EV のグローバルなプロテオーム・リピドーム profiling は治療・診断応用の基盤情報として重要であるが、本研究以前に網羅的データセットは存在しなかった。
目的
3 種類の異なる細胞 (U87 glioblastoma multiforme・Huh7 hepatocellular carcinoma・ヒト骨髄由来 MSC, mesenchymal stem/stromal cell) から exosome と microvesicle を単離し、高分解能 proteomics・lipidomics で網羅的解析を行い EV subtype と細胞起源による組成差異を定量化することを目的とした。具体的には (i) 蛋白同定数 3,000+ / 脂質 1,500+ の包括 dataset 構築、(ii) exosome vs MV の subtype-specific marker と機能 GO 解析、(iii) 細胞起源情報がどの subtype により多く保持されるかの解明、(iv) ISEV-compatible 参照データの提供、の 4 目的。
結果
所見1 — プロテオミクスで合計 3,532 unique proteins、リピドミクスで 1,961 lipid species (22 classes) を同定：Label-free LC-MS/MS proteomics で 3 細胞種 × 2 EV subtype の計 6 sample で 3,532 unique proteins を FDR < 1% で同定し (Fig 1A)、当時の EV 分野で最大規模の dataset を構築した。Shotgun lipidomics では 22 lipid classes に渡り 1,961 lipid species を絶対定量で同定 (Fig 1B)。これは Kowal et al. ProcNatlAcadSciUSA 2016 の comparable dataset と並び EV 標準化 (ISEV MISEV2018 議論) の基盤データとなった (約 2-fold 規模拡張)。
所見2 — Exosome と MV はプロテオームで明確に異なり ECM 蛋白 vs ER/ミトコンドリア蛋白の dichotomy を示す：Exosome enriched: ECM 蛋白 (collagen, fibronectin)・heparin-binding 蛋白・receptors・免疫応答関連蛋白 (MHC, complement, integrins) (Fig 2A、約 3-fold enrichment、p < 0.001)。MV enriched: endoplasmic reticulum (ER) 蛋白・proteasome subunits・ミトコンドリア蛋白 (特に OXPHOS complex I-V) (Fig 2B)。Classical EV markers (CD9, CD63, CD81, TSG101, Alix) は exosome に高濃縮 (約 5-fold up vs MV、Fig 2C、WB 検証)、tetraspanin が exosome subtype 判別 marker として機能することを再確認した。Venn diagram では exosome 特異 985 蛋白 / MV 特異 1,124 蛋白 / 共通 1,423 蛋白に分類された。
所見3 — Exosome は glycolipid に MV は ceramide に富み EV 生成機構の差異と整合する：Exosome enriched lipids: glycolipids (cerebrosides, sulfatides 約 2.5-fold up)・free fatty acids (FFAs) (Fig 3A)。MV enriched lipids: ceramides・sphingomyelins (約 2-fold up vs exosome、Fig 3B)。これは MV が ceramide-driven outward budding (Trajkovic et al. Science 2008) で生成するという既知機構と整合的である。Phospholipid species (PC, PE, PS, PI, PA) でも明確な subtype 差異が観察された (Fig 3C)。
所見4 — Exosome は MV より細胞起源情報をより強く保持する (subtype は PC1、起源は PC2)：PCA 解析で第1主成分 (PC1, 約 45% variance) が EV subtype (exosome vs MV) を分離、第2主成分 (PC2, 約 25% variance) が細胞起源 (U87 vs Huh7 vs MSC) を分離した (Fig 4A、明瞭な 2 軸 separation)。Exosome 比較では Huh7 と U87 が比較的似た組成 (Pearson correlation r = 0.72) を示す一方、MSC exosome は両者と明確に異なる (r = 0.45-0.55、Fig 4B、組織特性反映)。MV では細胞起源による組成差が exosome より小さく (Δcorrelation ~0.15、Fig 4C)、MV が原形質膜由来のため細胞総体組成を反映するという仮説を支持した。
所見5 — 細胞起源特異的マーカー: Huh7 → ApoE, U87 → CD44, MSC → collagen を同定：Huh7 exosome → apolipoprotein E (ApoE)・albumin (肝特異)、U87 exosome → CD44・neural markers (NCAM, Glast)、MSC exosome → collagens (COL1A1, COL3A1)・MSC-related surface markers (CD73, CD90, CD105) を起源特異的に同定 (Fig 5、3 細胞種別 unique marker map)。これらは plasma exosome から由来組織を tracing する 臨床応用 liquid biopsy 用 candidate marker となる。Cancer-derived exosome integrin profile による organotropic metastasis (Hoshino et al. Nature 2015) と整合する細胞起源 marker 同定機構として機能する。
所見6 — GO 解析で exosome は細胞外シグナル伝達、MV は細胞内代謝・ストレス応答に富む：DAVID GO enrichment で exosome は extracellular signaling・immune modulation・wound healing・cell adhesion 経路に有意富む (p < 10⁻¹⁰)、MV は intracellular metabolism (TCA cycle, OXPHOS, glycolysis)・stress response・unfolded protein response (UPR)・proteasome 経路に富む (p < 10⁻⁸、Fig 6)。この機能分化は EV subtype の生物学的役割が分子組成に反映されていることを示し、subtype-targeted therapy 設計の基盤を与える。
考察/結論
本研究は、EV 亜型 (exosome / MV) と細胞起源 (神経膠芽腫・肝癌・MSC) の両軸で網羅的な分子プロファイルを提供した 新規な landmark 研究である。3,532 蛋白・1,961 脂質の同定は当時の EV 分野で最大規模であり、現在でも参照データセットとして広く引用されている。
これまでの先行研究 (CellTissueRes 2013 の subtype 概念総説・Trajkovic et al. Science 2008 の ceramide budding・Kowal et al. ProcNatlAcadSciUSA 2016 の小規模 proteomics・Hoshino et al. Nature 2015 の integrin organotropic) と異なり、本研究は (i) 3 細胞種同時比較、(ii) proteomics + lipidomics 統合、(iii) 22 lipid class 全網羅、(iv) PCA で subtype と起源の双軸 separation を量化した点で方法論的に新しい。新規な 主要 insight として、(a) exosome と MV は単純な「大きさ違い」ではなく endosome vs plasma membrane 起源に由来する組成・機能の分化を持つ実体、(b) exosome の方が MV より細胞起源情報を保持し biomarker 応用価値が高い、(c) 脂質組成差異が EV 生成機構 (ESCRT-dependent vs ceramide-driven budding) と整合、が挙げられる。これまで報告されていない包括的 cross-source 比較データセットが完成した。
臨床応用 の観点では、(1) Exosome-特異的 marker を用いた cancer liquid biopsy の感度向上 (CD63 / CD81 + ApoE / CD44 / 起源特異 marker の multi-plex) が 臨床応用 に直結する。(2) Drug delivery system としての EV 設計で subtype 選択・細胞起源選択が 臨床的意義 を持つ (例: MSC-exosome 治療の neurological disease 応用)。(3) MSC-exosome 治療 (心筋梗塞・脳卒中・骨関節炎等) の細胞起源特異組成が治療効果に寄与する可能性は bench-to-bedside translational 重要 hypothesis である。(4) Cancer-derived exosome の organotropic metastasis (Hoshino et al. Nature 2015) を本データセットの起源 marker と紐付けることで早期診断 臨床応用 が広がる。
残された課題 として、(i) 培養細胞由来 EV のみで in vivo 血漿 EV との直接比較が 今後の検討 必要、(ii) 解析範囲が 3 細胞種に限定され primary cell (健常組織由来) や iPSC-EV との比較が 今後の課題、(iii) 機能アッセイ (recipient cell uptake・mRNA / miRNA cargo・downstream signaling) が含まれず分子組成と機能の因果実証が 今後の研究 課題、(iv) PTM (post-translational modification: phosphorylation, glycosylation) や cargo nucleic acid (miRNA, lncRNA) の網羅解析、が残る。Limitation として、(a) Differential UC のみで size-exclusion chromatography (SEC) や immunoaffinity capture との比較なし、(b) 個別細胞ロット間の組成 variation 未評価、(c) lipidomics で oxidized lipid 不検出、(d) ISEV MISEV2018 公開前の研究で post-MISEV 標準との直接互換性は事後検証要、が挙げられる。本論文は MISEV ガイドライン策定の基盤データとなり ISEV (International Society for Extracellular Vesicles) の標準化推進に寄与した。
方法
細胞培養: U87 (human glioblastoma, ATCC HTB-14)・Huh7 (human hepatocellular carcinoma)・ヒト骨髄由来 MSC (mesenchymal stem/stromal cell, RoosterBio Inc. RoosterNourish 培地) を専用培地で培養。EV 採取前 48時間は exosome-depleted FBS (超遠心 18時間処理済) で培養 (contamination 防止)。
EV isolation method (differential ultracentrifugation, dUC、MISEV 互換): 培養上清を 300 ×g 10 min → 2,000 ×g 10 min → 10,000 ×g 30 min で逐次清浄化 → 20,000 ×g 60 min で MV pellet を回収 (microvesicle 分画) → 100,000 ×g 90 min (Beckman SW32 Ti rotor) で exosome pellet を回収。
EV characterization (NTA + EM + WB markers): NTA (Nanoparticle Tracking Analysis, NanoSight NS300) で size distribution を測定 (exosome モード 80-100 nm、MV モード 200-300 nm)。Transmission electron microscopy (TEM, JEOL JEM-1200 EX) で cup-shape 形態確認。Western blot で classical exosome markers (CD9, CD63, CD81, TSG101, Alix) を検出。
Proteomics 解析: Label-free quantitative LC-MS/MS (nano-LC + Orbitrap Velos, Thermo Scientific) で peptide identification。MaxQuant + UniProt human database (n=20,242 entries) で蛋白同定、FDR < 1%、minimum 2 unique peptides per protein。Gene Ontology (GO) enrichment は DAVID v6.8 で実行 (Huang et al. NatProtoc 2009 DAVID method)。
Lipidomics 解析: Shotgun lipidomics (MS/MS-ALL) を triple quadrupole-linear ion trap (AB Sciex QTRAP 5500) で実行、22 lipid classes を対象 (Berg lipidomics platform)。各 lipid species は内部標準による絶対定量。
統計手法: Hierarchical clustering・principal component analysis (PCA, R package prcomp)・Volcano plot・Venn diagram (R package VennDiagram) で差異解析。EV subtype 間比較は Student t-test、複数 group は one-way ANOVA + Tukey post-hoc、有意水準 p < 0.05 (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001)。