Molecular evaluation of five different isolation methods for extracellular vesicles reveals different clinical applicability and subcellular origin

• 著者: Rosanne E. Veerman, Loes Teeuwen, Paulo Czarnewski, Gözde Güclüler Akpinar, AnnSofi Sandberg, Xiaofang Cao, Maria Pernemalm, Lukas M. Orre, Susanne Gabrielsson, Maria Eldh
• Corresponding author: Susanne Gabrielsson (Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden)
• 雑誌: Journal of Extracellular Vesicles
• 発行年: 2021
• Epub日: 2021-07-22
• Article種別: Original Article
• PMID: 34322205

背景

細胞外小胞 (EV: extracellular vesicles) は、アポトーシス小体 (直径50-1000 nm)、細胞膜から出芽するマイクロベシクル (MV: microvesicles、直径100-1000 nm)、多胞体 (MVB: multivesicular bodies) と細胞膜の融合により放出されるエンドソーム由来のエクソソーム (直径30-150 nm) など、細胞起源とサイズが異なる多様な膜結合小胞群である Colombo et al. AnnuRevCellDevBiol 2014。EVは全ての細胞から放出され、尿、母乳、血漿など全ての体液中に存在し、脂質、タンパク質、核酸から構成される。その組成は細胞の起源や状態によって異なり、受容細胞に伝達され、免疫活性化や寛容において重要な役割を果たすとともに、がんなどの多くの疾患に関与しているため、治療標的および治療担体として注目されている Valadi et al. NatCellBiol 2007。さらに、疾患時に放出されるEVは疾患特異的なマーカーを運ぶため、バイオマーカーとしての役割が期待されている Skog et al. NatCellBiol 2008。

EV研究の進展に伴い、超遠心法に加えて、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC)、沈降法、膜親和性法、密度勾配法、親和性捕捉法など、原理の異なる多様なEV単離手法が普及した。しかし、これらの多様な単離法は、EVの収量、純度、回収されるEVサブポピュレーションがそれぞれ異なるため、研究間の比較と再現性を妨げる大きな課題となっている。選択する手法によって実験結果が根本的に異なる可能性があるため、EV単離手順がEV組成および共単離される非EV成分にどのように影響するかをより深く理解する必要がある。また、血漿はEVのバイオマーカー研究において特に重要なサンプルであるが、HDL (high-density lipoprotein)、LDL (low-density lipoprotein)、IDL (intermediate-density lipoprotein)、VLDL (very low-density lipoprotein)、カイロミクロンなどのリポタンパク質がEVの推定10⁷〜10⁹倍過剰に存在する極めて複雑な生体液である。リポタンパク質はEVと密度、サイズ、脂質含有量など複数の特性が重複しており、EV単離時の共精製が避けられない。このため、EVとリポタンパク質を完全に分離することは困難である。

これまでの研究では、EV集団の純度を高めるためには、特に血漿からの単離において、複数の方法を組み合わせる必要があることが示されている。しかし、この方法は非常に時間がかかり、多くの場合、大量の出発サンプル量を必要とするため、組織培養上清やマウスまたは患者由来の少量の血漿を使用する臨床研究では適用できないことが多い。また、ほとんどの先行研究では、単一のサンプルタイプからのEV単離法を比較しており、ある方法が血漿に適していても、細胞培養上清には適さない、あるいはその逆である可能性については未解明であった。さらに、高粒子数/タンパク質比を「純粋なEVサンプル」の定義とする見解があるが、これはリポタンパク質が多数含まれるサンプルでも高比率を示すため、過度に単純化された指標である可能性があり、より包括的な評価が不足していた。本研究は、異なるサンプルタイプと容量で複数のEV単離法を並行して比較した初の研究であり、これらの知識ギャップを埋めることを目的とした。

目的

本研究の目的は、原理の異なる5種類の代表的なEV単離法 — ExoQuick ULTRA (沈降法)、exoEasy (膜親和性)、qEVoriginal 35 nm/70 nm (Izon 35/70、サイズ排除クロマトグラフィー)、OptiPrep (イオジキサノール密度勾配)、MagCapture (ホスファチジルセリン親和性) — を、ヒトMM6細胞培養上清と健常者血漿 (250 µlおよび3 ml) という異なる2種のサンプルタイプおよび2種の容量で同時比較することである。具体的には、EVの形態、サイズ、収量、RNA含有量、テトラスパニン発現、およびプロテオームプロファイルの観点から、各手法の特性、臨床適用性、および回収されるEVサブポピュレーションへの偏向を総合的に評価することを目的とした。これにより、EV研究におけるサンプルタイプ、容量、および研究目的に応じた最適な単離法選択のための指針を提供し、異なる研究間で結果を比較する際の解釈を支援することを目指した。

結果

TEM形態解析：5手法が異なるEV集団を回収: 培養上清および血漿サンプルともに、EV単離法間でEVの形態、サイズ、および粒子組成に顕著な不均一性が確認された (Fig 3a, b)。Izon 35とIzon 70は最も不均一な粒子集団を回収し、30 nm未満の粒子、30-150 nmの小EVまたはリポタンパク質、150 nm超の大型EVまたはリポタンパク質が混在していた。exoEasyは他の手法と比較して、表現型的に大型のカップ型EVを優先的に回収する傾向を示した。ExoQuickは30 nm未満の小粒子（推定リポタンパク質）を多く濃縮した。OptiPrepは血漿サンプルで粒子同定数が少なく、リポタンパク質高密度域に位置する多くの非EV成分を血漿タンパク質複合体として回収した。MagCaptureはPS陽性EVを選択的に回収する原理上、PS陰性EVは回収されない。Izon 35/70の非EV画分 (F10-12) でCD63/CD81陽性粒子が多く確認され、製造者プロトコルのF7-9よりもF10-12にEVがより多く分布する可能性が示唆された (Fig S3A, B)。

NTA粒子数・サイズ分布：ExoQuickが最高粒子数だが非EV混入: NTA解析により、ExoQuickは培養上清 (Fig 4b) および血漿 (Fig 5b) の両方で最高粒子数 (約2×10⁸ particles/ml) を示したが、EM観察で30 nm未満の粒子が多数確認されたことから、非EV成分（リポタンパク質）の混入が多いことが示唆された (p<0.001)。ExoQuickのモード径は140 nm、平均径は170 nmであった。exoEasyは100 nm超の大型EV優位の分布を示した (Fig 4a, 5a)。Izon 35/70は50〜300 nmの広い分布を示し、Izon 70はIzon 35よりも大型EVをより多く回収した。OptiPrepとMagCaptureは粒子数が非常に少なく、適切なモードサイズの推定が困難であった。粒子/タンパク質比はExoQuickで他手法より有意に高く (p<0.001)、これは粒子数は多いがタンパク質量が相対的に少ないためであった (Fig 4e, 5e)。

プロテオミクス：培養上清ではIzon 35が最多EV種を同定: 培養上清では、Izon 35が最多タンパク質数 (1,014種、ユニーク96種) を同定し、Vesiclepedia Top 100リストの78種を含んでいた (Table 3)。以下、Izon 70 (806種)、MagCapture (714種)、exoEasy (590種)、OptiPrep (387種)、ExoQuick (248種) の順であった。血漿250 µlではexoEasy (273種) が最多のEVタンパク質を同定し、Izon 35は109種にとどまった (Table 4)。血漿3 mlではIzon 70 (335種) が最多のタンパク質を同定し、Vesiclepedia GOリストで最多のEVタンパク質 (85種) を含んでいた。exoEasy 3 mlは311種を同定し、血漿タンパク質混入が最少の傾向 (44種) を示し、EV/非EVタンパク質比のバランスが良好であった。一方、Izon 70 3 mlは血漿タンパク質が57種と他手法より多かった。ExoQuickは培養上清で最少EV種を同定したが、血漿250 µlでは相対的に多くのEV種を同定し、サンプルタイプによるEV組成とリポタンパク質比率の違いを示した (Fig 7b)。

テトラスパニン発現 (フローサイトメトリー): 培養上清では、ExoQuickとIzon 35がCD63およびCD81シグナルで有意に高値を示した (p<0.001)。血漿では、exoEasyとIzon 70がCD9で有意に高値を示した (p<0.05)。MagCaptureはPS陰性EVを回収しないため、血漿でテトラスパニン陰性であった。Izon 70はIzon 35と比較して、血漿でより多くのCD9陽性EVを回収した (Fig 4f, 5f)。Izon 70のフロー・スルー画分 (F10-12) では、CD63およびCD81陽性EVが豊富に検出され、製造者推奨のEV画分 (F7-9) よりも多くのEVが含まれている可能性が示唆された (Fig S3A, B)。

RNA収量とパターン：exoEasyが培養上清で最高収量: BioanalyzerによるRNA解析では、すべての単離法で古典的なEV様RNAパターンが示され、低分子RNAの濃縮が認められた (Fig 4c, 5c)。培養上清からのEVでは、exoEasyが最も高い総RNA量 (628 ng) を示し、他の方法と比較して有意に多くのRNAを単離した (p<0.001)。MagCaptureは32 ngと最も低いRNA量であった。血漿由来EVでは、ExoQuickが20.8 ng/ml plasmaと最も高いRNA量を示し、他の方法と比較して有意に高かった (p<0.001)。Izon 35は0.8 ng/ml plasmaと最も低いRNA量であった。miR-122-5pの解析では、どの単離法もウシ由来miR-122-5pを濃縮しないことが示唆された (Fig S2B)。培養上清ではExoQuickが最高の粒子数を示したが、RNA収量は最高ではなく、粒子/RNA比が他の方法より有意に高かった (p<0.001)。これは、ExoQuickが多くの非EV粒子を回収していることを示唆する。

GO解析・HCA：全手法がEV・原形質膜由来小胞を濃縮しつつ独自サブポピュレーションを回収: 階層的クラスター分析 (HCA) とGO enrichment解析により、全手法が「分泌顆粒、細胞質小胞、tertiary granule」などのEV関連GO termに富化した小胞を回収することが確認された (Fig 8a, b)。細胞内区画分類では、すべての培養上清サンプルで原形質膜由来小胞 (microvesicle) に関連するGO termへの富化が認められた (Fig 9a)。ESCRT (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport)/MVB関連タンパク質 (エクソソーム関連) はIzon 35、Izon 70、MagCaptureで豊富に検出された (CD63、CD9、TSG101、RAB、CHMPなど) が、ExoQuickとOptiPrepでは乏しかった。exoEasyはゴルジ装置・小胞体関連タンパク質 (RPL19、G3BP1など) を特異的に濃縮しており、他手法とは異なる大型EV亜集団 (ゴルジ由来の可能性) を選択的に回収していることが示唆された (Fig 9a)。血漿サンプルでは血漿タンパク質の高い存在量のため、ほとんどの手法がEV画分と類似したプロテオームを示し、ESCRT/MVB関連タンパク質はほとんど検出されなかった (Fig 9b)。

考察/結論

本研究は、原理の異なる5種類のEV単離法がすべて異なるEVサブポピュレーションを回収しており、「研究目的、サンプルタイプ、サンプル量を問わず最適な単一の方法」は存在しないことを多角的な解析により明確に示した。この結果は、EV研究において、サンプルタイプ、容量、および研究目的に応じた適切な単離法選択の重要性を強調するものである。

先行研究との違い: これまでの研究では、EV単離法の比較は単一のサンプルタイプに限定されることが多かった。本研究は、培養上清と血漿という根本的に異なる2つのサンプルタイプ、および異なる容量 (250 µlと3 ml) を並行して比較した点で新規性がある。特に、ExoQuickが培養上清では最も少ないEVタンパク質を単離したのに対し、少量血漿 (250 µl) では最も多くのEVタンパク質を単離したことは、サンプルタイプがEV単離法の選択に決定的な影響を与えることを示しており、これまでの報告とは異なる重要な知見である。また、高粒子数/タンパク質比が必ずしも高純度EVを示すわけではないことを、ExoQuickのEM観察結果とプロテオミクスデータを用いて明確に示した点も、先行研究の単純な純度評価基準に対照的な見解を提示している。

新規性: 本研究で初めて、Izon 35/70のフロー・スルー画分 (F10-12) にCD63/CD81陽性EVが豊富に含まれていることを発見した。これは、製造者推奨のEV濃縮画分 (F7-9) のみではEVの相当部分が失われている可能性を示唆する新規な知見であり、今後のSECプロトコル最適化に向けた全画分評価の必要性を強調する。また、exoEasyがゴルジ装置や小胞体関連タンパク質を特異的に濃縮し、他手法とは異なる大型EV亜集団を選択的に回収している可能性を示唆したことも、EVサブポピュレーションの多様性と単離法による偏向に関するこれまで報告されていない詳細な洞察を提供する。

臨床応用: 本知見は、EVをバイオマーカーや治療担体として臨床応用する上で極めて重要な臨床的意義を持つ。例えば、培養上清からの包括的EV解析にはIzon 35/70が優れる一方で、少量血漿からの臨床バイオマーカー探索ではexoEasyが高EVタンパク質数と低非EV混入のバランスで優れていることが示された。これは、限られた臨床サンプル量で特定のEVサブタイプをターゲットとする場合に、どの手法を選択すべきか具体的な指針を与える。また、MagCaptureがPS陽性EVを選択的に回収する特性は、アポトーシス関連EVやがん由来EVなど、特定のバイオマーカーに焦点を当てる臨床現場での利用に有用である。

残された課題: 今後の検討課題として、本研究で示された各単離法が回収するEVサブポピュレーションの生物学的機能や疾患特異的な役割を詳細に解析する必要がある。特に、exoEasyが濃縮するゴルジ由来の大型EVの機能的意義は残された課題である。また、TEMにおけるEVとリポタンパク質の形態学的区別が困難であったlimitationを克服するため、クライオTEMや免疫金標識TEMなどのより高解像度なイメージング技術を用いた検証が今後の研究で必要とされる。さらに、本研究は健常者血漿を用いたが、疾患患者の血漿における各単離法の性能評価も今後の方向性として重要である。EV研究の標準化に向け、使用した単離法、サンプル量、EVサブポピュレーションの特性解析情報を詳細に報告することの必須性を改めて強調する。

方法

細胞培養および血漿採取: ヒト単球系細胞株Mono-Mac-6 (MM6) をEV除去FBS添加RPMI-1640培地で72時間培養後、条件培地を回収した。MM6細胞はマイコプラズマ陰性であることが確認されている。細胞およびデブリは差速遠心法 (300 g、10分；3,000 g、30分) で除去し、Amicon Ultra 30K遠心フィルターで約1 mlに濃縮した (元の60 ml上清から)。血漿は健常ボランティア3名 (女性2名、男性1名、25-50歳) からEDTA採血し、2,500 gで2回遠心して無血小板血漿 (PFP: platelet-free plasma) を調製し、-80°Cで保存した。すべての実験プロトコルはストックホルム地域倫理審査委員会 (2010/624-31/4) の承認を得ており、すべての被験者は書面によるインフォームドコンセントに同意した。

EV単離: 各手法は製造者プロトコルに従い実施し、最終容量はすべて500 µlとした。

• ExoQuick ULTRA (System Biosciences): 血漿 (最大250 µl) または培養液 (最大5 ml) にExoQuick試薬を添加し、インキュベート後、3,000 gで遠心、精製カラムを通過させ、500 µlで溶出した。
• exoEasy Maxi Kit (QIAGEN): 3 ml血漿または約1 ml濃縮培養上清を等量のバッファーXBPと混合し、500 gで遠心。フィルターをバッファーXWPで洗浄後、500 µlのバッファーXEでEVを溶出した。
• qEVoriginal 35 nm/70 nm (Izon 35/70): PBSで平衡化したカラムに500 µlサンプルをロードし、0.5 ml画分を回収した。製造者プロトコルに従いEV濃縮画分 (F7-9) をプールし、Amicon Ultra 30K遠心フィルターで濃縮した。3 ml血漿サンプルでは、サンプルがなくなるまでロードと画分回収を繰り返した。
• OptiPrep (STEMCELL Technologies): 50/30/10%のイオジキサノール不連続勾配 (各3.5 ml) を作成し、サンプルをロード後、130,000 gで16時間 (4°C) 遠心した。0.5 ml画分を回収し、密度1.12-1.19 g/mLのEV含有画分をプールし、PBSで希釈後、100,000 gで2時間遠心してペレットを回収した。
• MagCapture Exosome Isolation Kit PS (FUJIFILM): 培養上清サンプルのみに適用した。1 mlサンプルを磁気ビーズに添加し、回転撹拌器で3時間インキュベートした。ビーズを3回洗浄後、30 µl溶出バッファーで2回EVを溶出した。

EV特性解析:

• 透過型電子顕微鏡 (TEM: transmission electron microscopy): 負染色法により、Hitachi HT 7700電子顕微鏡 (80 kV) を用いてEVの形態とサイズ分布を評価した。ImageJ 1.51wソフトウェアで粒子を計測した。
• ナノ粒子トラッキング解析 (NTA: Nanoparticle Tracking Analysis): NanoSight LM10プラットフォーム (405 nmレーザー、NTA 2.3ソフトウェア) を用いて、粒子のサイズ分布と濃度を測定した。
• バイオアナライザー: miRNeasy Mini Kit (Qiagen) で総RNAを抽出し、Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) とTotal RNA 6000 Pico Kitを用いてRNAの収量とサイズ分布を解析した。
• フローサイトメトリー: 抗CD9または抗CD63抗体でコーティングしたラテックスビーズにEVを結合させ、PE標識抗CD9、CD63、CD81抗体を用いてFACSCanto IIでテトラスパニン発現を評価した。
• LC-MS/MS (liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry): 45のEVサンプルについて、ラベルフリー質量分析ベースのプロテオミクス定量を実施した。SDS溶解バッファーでタンパク質を抽出し、トリプシン消化後、Dionex nanoLCとThermo Scientific High Field QExactive-HFを用いて分離・分析した。Ensembl 99データベースに対してMSGF+/Percolatorで検索し、1%の偽陽性率 (FDR: false discovery rate) でフィルタリングした。
• プロテオミクス解析: R (Rstudio, version 1.1.383) を用いて、Vesiclepedia Top 100リスト、小胞関連GOリスト、および血漿タンパク質リストとの照合により、EVタンパク質および血漿タンパク質を分類した。主成分分析 (PCA: Principal Component Analysis) および階層的クラスター分析 (HCA: Hierarchical Agglomerative Clustering) を実施し、GO enrichment解析 (enrichRパッケージ、GO_Cellular_Component_2018遺伝子セット) を用いて細胞内起源を評価した。
• 統計解析: 多群比較には一元配置ANOVA (analysis of variance) とTukey HSD (Honestly Significant Difference) 検定を用いた。複数の群のグループ化された値は二元配置ANOVAとTukey HSD検定で解析した。p値が0.05未満を有意とした。PCAのクラスター割り当てはK-meansクラスタリング (4クラスター) で行った。