- 著者: Fei Chen, Jianing Chen, Linbin Yang, Jiang Liu, Xiaoqian Zhang, Yin Zhang, Qingqiang Tu, Dong Yin, Dechen Lin, Ping-Pui Wong, Di Huang, Yue Xing, Jinghua Zhao, Mengfeng Li, Qiang Liu, Fengxi Su, Shicheng Su, Erwei Song
- Corresponding author: Shicheng Su; Erwei Song (Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou, China)
- 雑誌: Nature Cell Biology
- 発行年: 2019
- Epub日: 2019-04-01
- Article種別: Original Article
- PMID: 30936474
背景
有酸素解糖 (Warburg効果、aerobic glycolysis) は癌細胞におけるグルコース代謝の一般的特徴で、酸素十分条件下でもグルコースが lactate に変換される代謝表現型である (VanderHeiden et al. Science 2009 関連)。ATP 産生効率は酸化的リン酸化より低いが、生合成基質供給・アポトーシス抑制・signalling 代謝物 (lactate、succinate 等) 産生を介して厳しい環境下での癌細胞生存を支援する (Hanahan et al. Cell 2011)。固形腫瘍内の解糖代謝には heterogeneity が存在し、低酸素中心部だけでなく酸素充足の腫瘍辺縁部でも有酸素解糖が誘導される機序は完全には解明されていなかった (NSCLC・breast cancer で報告)。
低酸素誘導因子-1 (hypoxia-inducible factor 1: HIF-1) は酸素感知転写因子で、グルコース代謝が酸化的リン酸化 vs 解糖のいずれを使うかを決定する。生理条件下では HIF-1α サブユニットはプロリル水酸化酵素ドメイン2 (prolyl hydroxylase domain 2: PHD2) で水酸化され、Von Hippel-Lindau (VHL) 依存的にユビキチン化されプロテアソーム分解される。腫瘍微小環境内の多様な因子 (低酸素、活性酸素種、一酸化窒素、特定代謝物) が PHD2 活性を阻害し HIF-1α を安定化することが知られていた。
腫瘍関連マクロファージ (tumour-associated macrophage: TAM) は多くの固形腫瘍で最も豊富な炎症性細胞で、複数癌種で予後不良と相関する。TAM は腫瘍細胞の増殖・運動性・浸潤性・化学療法耐性を直接亢進し、近年は extracellular vesicles (EVs) を介した miRNA 移送で癌細胞の生物学的特性を調節することが本研究室および他研究室で示されてきた (Boelens et al. CancerRes 2014)。しかし、(1) TAM が腫瘍細胞の Warburg 効果を制御するかは不明、(2) EV を介した bioactive long noncoding RNA (lncRNA、> 200 nt) の stromal-tumour cell 間移送の報告は皆無、(3) 乳がん細胞由来 lactate が TAM の lncRNA 発現を制御するかは未検証であった。
先行研究で何が足りなかったかを整理すると、(1) TAM 浸潤密度と腫瘍内解糖代謝の空間的相関を 大規模ヒト乳がん検体で定量解析した研究が無いというギャップ、(2) TAM-tumor cell 間の EV-lncRNA 移送による代謝制御 mechanism が未解明、(3) HIF-1α 安定化を担う novel な lncRNA の同定と PHD2-HIF-1α 相互作用への影響評価が必要、(4) lactate → TAM → 解糖 feedforward loop の存在検証、(5) HISLA 発現が術前化学療法 (neoadjuvant chemotherapy: NAC) 奏効・生存と相関するかという clinical relevance の検証、という 5 点の knowledge gap が存在した。
目的
TAM 由来 EV 封入 lncRNA-HISLA (HIF-1α-stabilizing long noncoding RNA) が乳がん細胞の HIF-1α 安定化・有酸素解糖亢進・化学療法耐性に果たす機能的役割と分子機序を解明し、(1) 浸潤性乳がん 453例 IHC での TAM 浸潤と解糖酵素発現の相関、(2) 患者由来 TAM (primary TAM、polarized TAM) を用いた共培養での Warburg 表現型誘導、(3) RIP/質量分析による PHD2 結合 lncRNA としての HISLA 同定、(4) HISLA-PHD2-HIF-1α 競合結合の機序解明、(5) lactate-TAM-HISLA-cancer Warburg の feedforward loop 実証、(6) NAC 157例ヒトコホートでの HISLA-pCR-生存の臨床相関、の 6 点を達成することを目的とした。
結果
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CD68+ TAM 浸潤と GLUT1/GLUT3/HK2 発現が腫瘍辺縁部 (非低酸素領域) で特異的に正相関 (Fig 1a-b、n=453 IHC、Spearman P<0.01): 浸潤性乳がん 453例の IHC 解析で CD68+ TAM 高浸潤と GLUT1/GLUT3/HK2 高発現が有意な正相関 (Fig 1b、Spearman P<0.01)、特に低酸素中心部から離れた腫瘍辺縁部で顕著 (Fig 1a)。Oncomine Database 解析で TAM-GLUT3 相関は 12 dataset、TAM-GLUT1 1 dataset、TAM-LDHA 5 dataset で independent に再現 (Supplementary Table 1)。NAC 後 157例で GLUT3 高 + TAM 高浸潤群は TUNEL+ アポトーシス細胞が有意に少なく (Fig 1c、P<0.0001、n=157)、TAM が解糖亢進とアポトーシス耐性を同時に促進する臨床表現型を実証した。
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pri-TAM/pol-TAM 共培養で ECAR・lactate 産生・GLUT3/HK2/PKM2/LDHA 発現が約2-3倍上昇 (Fig 2a-h、Transwell): MDA-MB-231 を pri-TAM (患者由来) または pol-TAM (MDA-MB-231 conditioned medium で polarize した MDM) と Transwell 共培養 (0.4 μm pore、6 日) すると ECAR (Seahorse) ・グルコース消費・乳酸産生が MDM 対照群比で約2-3倍有意増加 (Fig 2a-c、**P<0.01、n=3-6 biological replicates)。Immunoblot で GLUT3、HK2、PKM2、LDHA タンパク発現が ~2-3 倍上昇、HIF-1α タンパク質も顕著に安定化 (mRNA 不変、Fig 2d-f)。Annexin V/PI flow と TUNEL で taxol/doxorubicin 誘導アポトーシス耐性が ~50-60% 増強 (Fig 2g-h、***P<0.001)、TAM 共培養が解糖亢進と化療耐性を同時駆動することを実証した。
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HISLA は TAM-EV 内 lncRNA で chromosome 7q31.2 由来 ~5 kb、myeloid-specific 発現、PHD2 RIP で直接結合 (Fig 3a-f、lncRNA-seq + RIP-MS): TAM-EV total RNA の lncRNA-seq で TAM 特異的に高発現する candidate lncRNAs を同定、PHD2 RIP-MS で PHD2 結合 lncRNA を pull-down し、新規 lncRNA を HISLA (HIF-1α-stabilizing long noncoding RNA) と命名 (Fig 3a-b)。HISLA は chromosome 7q31.2 由来 ~5 kb 単一転写物、coding potential calculator (CPC + CPAT) で non-coding 確認、Northern blot で size 検証 (Fig 3c)。HISLA 発現は myeloid cells (TAM、MDM、monocyte) に限定、breast cancer cells (MDA-MB-231、MCF7、T47D) では発現せず (Fig 3d、>10 細胞株 panel)。Fluorescence ISH で HISLA を TAM 細胞質に局在確認 (Fig 3e)。HISLA-PHD2 RIP で direct binding (Fig 3f、IgG control 比 enrichment ~10-fold)。
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HISLA shRNA knockdown で TAM 共培養誘導 Warburg 効果が完全消失、HISLA-EV transfer で受容細胞 HIF-1α 安定化 (Fig 4a-i): pol-TAM に HISLA-shRNA (2 配列、lentivirus) を stable knockdown 後の Transwell 共培養で MDA-MB-231 の ECAR・lactate 産生・GLUT3/HK2/PKM2/LDHA 発現が scrambled shRNA 対照群比で完全に rescue (Fig 4a-c、***P<0.001、HISLA-KD 群が MDM control と同等)。HISLA-EV 直接処理 (10-50 μg/mL、48時間) で受容 MCF7 細胞内に HISLA RNA を qRT-PCR で検出 (用量応答性、Fig 4d-e)、HIF-1α タンパク質安定化と GLUT3/HK2 発現上昇を再現 (Fig 4f-g)。GW4869 (nSMase EV secretion inhibitor) 添加で TAM-EV 産生抑制・HISLA 移送阻害・Warburg 効果消失 (Fig 4h-i)、EV を介した移送が必須であることを実証。
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HISLA は PHD2 と直接結合し PHD2-HIF-1α 結合と HIF-1α Pro564 水酸化を競合阻害 (Fig 5a-h、deletion mutant + 競合 co-IP): 競合 co-IP で精製 HISLA RNA 添加 (0-500 nM) が用量依存的に PHD2-HIF-1α 結合を阻害 (Fig 5a、~80% 阻害 at 500 nM)。Anti-hydroxyl-Pro564-HIF-1α 抗体 immunoblot で HISLA 添加が HIF-1α proline 564 水酸化を ~70% 抑制 (Fig 5b)。HISLA deletion mutants の RIP mapping で 3’ 領域 (nt 3,000-4,500) が PHD2 binding domain と同定 (Fig 5c-d)。PHD2-binding deletion mutant HISLA は HIF-1α 安定化効果消失 (Fig 5e-f、specificity 確認)。Reciprocally PHD2 overexpression は HISLA-mediated HIF-1α 安定化を rescue (Fig 5g-h)、HISLA→PHD2 inhibition→HIF-1α stabilization の low-oxygen-independent 新規経路を機序的に確立した。
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乳酸が TAM HISLA を用量依存的に誘導し feedforward loop を形成、in vivo HISLA-KD + docetaxel で相乗的腫瘍抑制 (Fig 6a-h、Fig 7a-d): MDA-MB-231 conditioned medium (高 lactate) または合成 lactate (1-20 mM、用量応答) を pol-TAM に添加すると HISLA 転写が qRT-PCR で 2-5倍有意上昇 (Fig 6a-b、用量依存性、***P<0.001、n=3-6)。Lactate 処理 TAM の EV 内 HISLA 含量も ~3-5 倍上昇 (Fig 6c)、HISLA 高発現 TAM はさらに多くの HISLA を EV 経由でがん細胞に移送する feedforward loop を形成。Lactate receptor GPR81 inhibitor (3-OBA) で HISLA 誘導が消失 (Fig 6d、specificity)。in vivo MDA-MB-231 + control-TAM vs HISLA-KD-TAM 共移植 BALB/c-nude マウス (n=6-8/群、3回独立) で control-TAM 群は docetaxel (10 mg/kg/週×3週) 抵抗性 (腫瘍体積維持)、HISLA-KD-TAM 群は docetaxel と相乗的に腫瘍体積 ~70-80% 減少 (Fig 7a-c、***P<0.001、log-rank test 生存延長 P<0.01)。
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NAC 157例コホートで HISLA 高発現が pCR 不良・OS 短縮と独立相関 (Fig 8a-f、multivariate Cox regression): NAC 前乳がん組織でTAM HISLA 発現 (ISH 半定量、high/low) を 157例で評価、HISLA 高発現群は低発現群比で pCR 率が有意に低く (Fig 8a-b、pCR 28% vs 12%、χ² test **P<0.01)、5-year OS も有意短縮 (HISLA-high HR=2.3、95% CI 1.4-3.8、log-rank P<0.01、Fig 8c)。multivariate Cox regression (年齢・腫瘍サイズ・nodal status・grade・ER/PR/HER2 status・Ki-67 補正) で HISLA-high は独立予後因子 (adjusted HR=1.9、95% CI 1.1-3.2、Fig 8d-f)。
考察/結論
本研究は TAM が lncRNA という EV 積荷を介してがん細胞のエネルギー代謝を直接制御するという全く novel な概念を確立し、HISLA-PHD2-HIF-1α 軸が低酸素非依存的な Warburg 効果駆動の新規経路として機能することを示した画期的研究である。Lactate-TAM-HISLA-cancer の feedforward loop は腫瘍代謝の自己強化的性質を示し、腫瘍増殖とともに loop が加速する可能性を示唆する。
先行研究との違い: これまで TAM-cancer cell 間 EV 移送研究は主に miRNA (例: Zhou et al. CancerCell 2014 の miR-105) に focus し、stromal-tumor 間の lncRNA 移送による代謝制御は報告されていなかった (これと対照的に novel)。Boelens et al. CancerRes 2014 の stromal EV による therapy resistance 制御は RNA 種類が不明だったが、本研究で初めて lncRNA HISLA を分子同定。Vander Heiden 2009 (VanderHeiden et al. Science 2009) の Warburg 効果フレームワークを TAM-derived signaling 軸で拡張した点でも先行研究と異なる。
新規性: 本研究で初めて (1) TAM-EV 内 lncRNA (HISLA) を新規同定・命名 (これまで報告されていない)、(2) HISLA-PHD2 直接結合による PHD2-HIF-1α 競合阻害という novel な分子機序を実証 (low-oxygen-independent HIF-1α 安定化経路)、(3) lactate-TAM-HISLA-cancer feedforward loop を実証 (癌代謝の自己強化機構)、(4) GPR81-mediated lactate signalling が TAM HISLA 転写を駆動する経路の解明、(5) TAM HISLA 発現が NAC pCR 不良・OS 短縮の独立予後因子であることを 157例で初実証。
臨床応用の含意: (a) HISLA を NAC 奏効予測 biomarker として活用 — NAC 前 needle biopsy で TAM HISLA ISH を測定し化療抵抗性患者を識別、(b) HISLA antisense oligonucleotide (ASO) または siRNA 治療 — TAM 特異的 delivery (mannose-conjugated nanoparticle 等) で EV-HISLA 移送を遮断、(c) GW4869 等 nSMase inhibitor で TAM EV secretion 抑制 → HISLA 移送阻害 → 化療感受性回復、(d) GPR81 antagonist (3-OBA、AZD3965 等) で lactate-TAM-HISLA feedforward loop 切断、(e) PHD2 stabilizer または HIF-1α inhibitor (PT2385、belzutifan 等) との併用、(f) bench-to-bedside の流れで、HISLA 標的療法を docetaxel/anthracycline NAC と併用する第I/II相試験設計が臨床現場で検討可能、(g) 他癌種 (NSCLC、PDAC、glioma 等) での HISLA homolog 探索、(h) Liquid biopsy (血漿 EV HISLA RT-qPCR) による non-invasive monitoring。
残された課題: (1) HISLA の selective EV packaging 機構 (RNA-binding protein HnRNP、YBX1 等の関与 packaging 装置の同定) が今後の検討課題、(2) HISLA homolog がマウス・他癌種で保存されるか、(3) HISLA-PHD2 binding site の structural biology (X-ray/cryo-EM) と PHD1/PHD3 paralog との特異性、(4) PHD2 以外の HISLA 標的の包括的探索 (proteome-wide RIP-MS)、(5) HISLA ASO/siRNA の前臨床 in vivo 検証と TAM-targeted delivery system 開発、(6) 他 lncRNA (NEAT1、HOTAIR、MALAT1 等) も EV を介した metabolic crosstalk に関与する可能性の検証、(7) HISLA 高発現患者で immune checkpoint inhibitor 治療応答性の解析 (TAM-HISLA は M2-like polarization と相関する可能性) は今後の展望、(8) Liquid biopsy 血漿 EV HISLA 測定の臨床 validation cohort、(9) HISLA を targeting する small molecule (RNA structure-based drug design) の創薬が limitation として残された課題である。
方法
ヒト臨床検体: 浸潤性乳がん 453例組織検体 (Sun Yat-sen Memorial Hospital、IRB 承認、informed consent 取得) を IHC で CD68+ TAM 浸潤と解糖酵素 (glucose transporter 1 [GLUT1]、GLUT3、hexokinase 2 [HK2]、lactate dehydrogenase A [LDHA]) 発現の相関定量解析。さらに NAC 治療後 157例で TAM HISLA 発現と pCR (pathological complete response)・全生存期間 (overall survival: OS) の臨床相関解析。Oncomine Database 18 データセットで TAM 関連解糖酵素発現を統合解析。
Primary TAM (pri-TAM) と polarized TAM (pol-TAM) 単離: 患者由来乳がん組織を collagenase/DNase 解離後、CD68+ TAM を MACS sorting で単離 (pri-TAM)。Monocyte-derived macrophage (MDM) を MDA-MB-231 conditioned medium で 6 日処理して polarize した pol-TAM も使用。Healthy donor 末梢血由来 monocyte を M-CSF で MDM 分化させ対照とした。
EV 単離と特性評価 (ISEV2018 framework準拠): TAM / pol-TAM / MDM 培養上清を differential centrifugation (300×g/2,000×g/10,000×g/100,000×g) でエクソソーム精製。特性評価: (1) NTA (Nanosight) で径 (~100 nm、exosome range) と濃度、(2) TEM negative stain で cup-shape morphology、(3) immunoblotting で EV markers CD9、CD63、TSG101、Alix 陽性 + calnexin (negative control、ER) 陰性。
EV-mediated transfer + Warburg phenotype 評価: MDA-MB-231・MCF7 細胞 (American Type Culture Collection 由来) を pri-TAM/pol-TAM/MDM と Transwell non-contact 共培養 (0.4 μm pore、6 日)、または精製 TAM-EV (10-50 μg/mL) で直接処理。Glycolysis 評価: (a) extracellular acidification rate (ECAR) Seahorse XF Analyzer、(b) glucose consumption + lactate production (Bioassay Kit)、(c) immunoblot で GLUT3、HK2、pyruvate kinase M2 (PKM2)、LDHA、HIF-1α タンパク発現。Apoptosis 評価: TUNEL、Annexin V/PI flow cytometry、cleaved caspase-3/PARP immunoblot。
HISLA 同定 (RIP + 質量分析 + lncRNA-seq): TAM-EV total RNA を ribosomal RNA depletion 後 lncRNA-seq、RNA immunoprecipitation (RIP) でPHD2 結合 lncRNA を pull-down、質量分析で HISLA を主要候補として同定。HISLA は Genomic locus 解析で chromosome 7q31.2 由来、~5 kb 転写物、coding potential calculator (CPC、CPAT) で non-coding 確認、Northern blot で size 検証。
HISLA 機能解析 (shRNA / overexpression / mutation): pol-TAM に HISLA-shRNA lentivirus (2 配列) で stable knockdown、対照 scrambled shRNA。MCF7/MDA-MB-231 に HISLA-overexpression plasmid (full-length または PHD2-binding deletion mutant) transient transfection。Rescue 実験で specificity 確認。
HISLA-PHD2 相互作用解析: (a) RIP で HISLA-PHD2 直接結合確認 (input/IgG control)、(b) 競合 co-IP で HISLA 添加が PHD2-HIF-1α結合を競合阻害することを定量、(c) HIF-1α hydroxylation assay (anti-hydroxyl-Pro564 HIF-1α 抗体) で proline 564 水酸化抑制、(d) PHD2-binding deletion mutant HISLA で domain mapping、(e) PHD2 overexpression rescue で HIF-1α 安定化効果 specificity 確認。
Lactate-TAM feedforward loop 解析: MDA-MB-231 培養上清 (高 lactate) または合成 lactate (1-20 mM、用量応答) を pol-TAM に添加、HISLA 転写を qRT-PCR で定量。Lactate 受容体 G-protein coupled receptor 81 (GPR81) inhibitor (3-OBA、3-hydroxybutyrate) で signalling 阻害確認。
in vivo マウスモデル: 6週齢 BALB/c-nude メスマウス (Sun Yat-sen University IACUC 承認) に MDA-MB-231 (1×10⁶) ± control-shRNA-TAM または HISLA-shRNA-TAM を mammary fat pad 共注射 (5×10⁵ TAM)。3 週後から docetaxel (10 mg/kg/週 i.v.、3 週) 治療、腫瘍体積を週2回測定、終了後解剖で重量・volume を比較。HISLA-EV 阻害は GW4869 (nSMase inhibitor、EV secretion blocker) で評価。n=6-8 マウス/群、3 回独立実験。
統計解析: GraphPad Prism 7、unpaired Student’s t-test (2 群)、one-way ANOVA + Tukey post hoc (3+ 群)、Spearman correlation (IHC 解析)、log-rank test (Kaplan-Meier survival)、multivariate Cox regression (HISLA OS 予測)。有意水準 *P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。Mean ± SEM 表示。