- 著者: Bojmar L, Kim HS, Sugiura K, Heissel S, Lucotti S, Cioffi M, Johnson KE, Cohen-Gould L, Zhang H, Molina H, Matei IR, Lyden D, Hoshino A (Bojmar・Kim・Sugiura・Heissel・Lucotti: 共同筆頭著者)
- Corresponding author: Irina R. Matei (irm2224@med.cornell.edu)、David Lyden (dcl2001@med.cornell.edu)、Ayuko Hoshino (aynhoshino@g.ecc.u-tokyo.ac.jp); Weill Cornell Medicine・東京大学 RCAST・東京工業大学
- 雑誌: STAR Protocols
- 発行年: 2024
- Epub日: 2023-12-13
- Article種別: Protocol article
- PMID: 38096060
背景
細胞外小胞・粒子 (extracellular vesicles and particles; EVP) は、がん転移、免疫調節、およびバイオマーカーとしての可能性から急速に注目を集めている。しかし、その機能とバイオマーカーとしてのポテンシャルを正確に評価するためには、サイズ、数、形態、タンパク質カーゴなど、複数の角度からの包括的な特性解析が不可欠である。Hoshino らは 2015 年に、腫瘍エクソソームのインテグリン発現パターンが臓器特異的転移先を決定することを初めて示した (Hoshino et al. Nature 2015)。続く 2020 年には、複数がん種の血漿・組織 EVP プロテオームが各がん種に特徴的なバイオマーカーパターンを持つことを実証した (Hoshino et al. Cell 2020)。これらの重要な成果の技術的基盤となった EVP 単離手順は、同グループが 2021 年に STAR Protocols として公開した差速超遠心分離プロトコルに詳述されている (Hoshino et al. STARProtoc 2021)。
既存の EV 研究における大きな問題は、単一の分析プラットフォーム (ナノ粒子トラッキング解析 (NTA) のみ、あるいはウエスタンブロットのみなど) に依存することが多く、異なる手法間でのクロス検証が欠如している点にあった。国際細胞外小胞学会 (ISEV) が 2018 年に発表した MISEV2018 (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018) ガイドラインは、複数のアッセイを用いた EVP 特性解析の重要性を明記しているが、実際にどのような手順・条件で複数のプラットフォームを統合的に運用するかという実践的な標準操作手順は手薄であった。プロテオミクス、NTA、電子顕微鏡、単一粒子解析といった異なるプラットフォームを同一 EVP 調製物に対してどう組み合わせ、どう品質を担保するかという知識のギャップ (gap in knowledge) が、施設間での結果再現性の低下および異なるグループ間でのデータ比較困難という問題を引き起こしていた。特に、EVP の不均一性や多様な生物学的機能の理解には、多角的な解析が不可欠であり、単一手法ではその全体像を捉えることができないという課題が残されていた。本プロトコルはその空白を埋めることを目的に、Hoshino グループが癌 EVP 研究で実際に使用してきた一連の特性解析手法を体系的に整理・公開したものである。これにより、EVP 研究の標準化と再現性向上に貢献することが期待される。
目的
本研究は、ヒトおよびマウス由来の細胞外小胞・粒子 (EVP) の複数分析プラットフォームによるクロスバリデーションを可能にする実践的プロトコルを提示することを目的とする。具体的には、以下の6手法を体系化し、MISEV2018 準拠の複数アッセイによる EVP 研究の再現性・施設間比較可能性を向上させることを目指した。(1) ナノ粒子トラッキング解析 (NTA) によるサイズ・粒子数定量、(2) 透過型電子顕微鏡 (TEM) による形態解析、(3) LC-MS/MS (液体クロマトグラフィー質量分析) による EVP プロテオーム解析と生物情報解析、(4) ExoView (SP-IRIS; single particle interferometric reflectance imaging sensor) による単一 EVP 多重免疫検出、(5) ExoELISA、(6) ウエスタンブロットによるタンパク質定量・検証である。これらの手法を統合することで、EVP の物理的特性から分子組成までを包括的に評価し、前臨床および臨床研究における EVP のバイオマーカーとしての利用可能性を最大限に引き出すことを意図している。
結果
NTA による EVP サイズ・濃度の定量的プロファイル: プロトコル記載の統一条件で3種のサンプルタイプを定量した結果、血漿由来 EVP (1:400 希釈、2〜5 μL input) の濃度は 1.58×10^11 ± 1.11×10^10 particles/mL、サイズは 89.5 ± 38.5 nm を示した (Table 4)。細胞株由来 EVP (B16-F10、1 μg/mL 投入) は 4.18×10^8 ± 3.48×10^6 particles/mL・116.3 ± 3 nm、肺組織エクスプラント由来 EVP (50 μL input) は 7.91×10^8 ± 3.85×10^7 particles/mL・108.2 ± 0.6 nm であり、サンプル種間で粒子濃度に 2〜3 桁の差が認められた。血漿は粒子数が著しく多く、高希釈 (1:500〜1:3,000) が必要な一方、組織条件培地は肝臓など高 EVP 産生臓器で 1:2,000 を超える希釈が必要となる場合があった。カメラレベルを一定 (≤12) に保ち、測定値が 2×10^8〜2×10^9 particles/mL の範囲に入るよう希釈系列から最適希釈を決定するアルゴリズムが示された。NanoSight NS300 および NS500 両機種の操作手順が並記され、NS300 ではシリンジを用いた代替ウォッシュプロトコルが詳述されている (Figure 23)。
LC-MS/MS プロテオミクスによる広範なタンパク質同定と生物情報解析: ヒト細胞株 (n=3)、血漿 (n=3)、組織エクスプラント (n=3) に対して本プロトコルを適用した結果、いずれのサンプルタイプでも数百種のタンパク質が同定された (Figure 25)。細胞株由来 EVP では複数株間で同定タンパク数に有意差が認められた (p<0.01) が、血漿サンプル間 (p=0.29) および組織エクスプラントサンプル間 (p=0.45) の内部ばらつきは小さかった。n=3 独立実験の再現性が確認され、膵臓がん組織 EVP では正常隣接組織と比較して ≥10-fold の高発現を示すタンパク質群が検出された (Figure 11A、FDR <0.05・陽性率 >50%)。BCA 定量では血漿分画② 1,800〜2,150 μg/mL、細胞培養上清分画② 約2,140 μg/mL の回収量が得られた (Table 2)。Lys-C/トリプシン二段階消化のミスクリベージペプチド割合を管理指標として用い、同定ペプチドのうち missed cleavage なしが ≥60% であることを品質管理基準とした。FDR 1%/file (Percolator) が適用され、正規化は Log2 変換後に quantile normalization を実施した。バイオマーカー選定には fold change ≥10・FDR <0.05・陽性率 ≥80% の基準を用い、GSEA (コルモゴロフ・スミルノフ統計、FDR 25% 適用) で機能パスウェイを解析した。ヒートマップ (Figure 11A)、PCA (Figure 11B)、t-SNE (Figure 11C) により、黒色腫、膵臓がん、大腸がん、肺がんの EVP が固有のクラスタを形成することが示された。
ExoView による単一 EVP レベルの表現型多重定量: MDA-MB-231 乳がん細胞株由来 EVP を CD9 抗体チップで捕捉した場合、CD63 の蛍光検出粒子数 (正規化後) は ChA (green) 47.8、ChB (blue) 161.0、ChC (red) 602.6 であった。CD9 では ChA 1,006.7・ChB 2,407.6・ChC 942.0 と検出された (Table 5)。MIgG バックグラウンド (ChA 2.7・ChB 4.4・ChC 5.5) に対するシグナル・ノイズ比は高く、単一 EVP レベルでの表面タンパク質多重定量が可能であることが示された (Figure 26)。CD9 捕捉チップで CD63 検出数が相対的に高くなる現象は、チップ溝に EVP がはまり込み CD9 エピトープがマスクされるためと説明された。CETP、S100A9、B2-microglobulin、RhoV などのカスタム抗体 (開始濃度 0.2 μg/mL) を添加することで対象タンパク質を拡張でき、パーミアビリゼーションの有無でタンパク質の膜表面/内腔局在を判別できることが示された。
TEM による形態バリデーションと ExoELISA・WB による検証: TEM で PANC-1、血漿 (大腸がん)、黒色腫エクスプラント由来 EVP を解析した結果、いずれにおいても 100〜200 nm の二重膜構造を持つ典型的エクソソーム/微小小胞形態が確認された (Figure 24)。50,000 倍・100,000 倍での撮像により粒子の形態的純度 (デブリ・タンパク質凝集体混入の有無) を直接評価でき、NTA 粒子数データのモーフォロジカルバリデーションとして機能した。ウエスタンブロットでは、細胞株、組織、血漿から単離した EVP に対し CD9、Syntenin-1、Stomatin、B2-microglobulin、Galectin-3 binding protein (Galectin-3 BP)、Moesin が検出され (Figure 27)、LC-MS/MS で同定されたタンパク質の独立した確認が可能であった。ExoELISA では AsPC-1、MDA-MB-231、HCT-116 由来 EVP および膵臓がん患者血漿・組織エクスプラントで RhoV などの目的タンパク質が蛍光強度として定量され (Figure 28)、健常者血漿との比較が可能であった。ExoELISA の定量下限は質量スペクトル面積値 ≥2×10^7 のタンパク質とされ、これより低存在量のタンパク質は TSA (tyramide signal amplification) 法等の感度増強を要することが示された。
6 手法統合クロスプラットフォームバリデーションの実施可能性: 同一 EVP 調製物に対し NTA、TEM、LC-MS/MS、ExoView、ExoELISA、ウエスタンブロットを並行実施することで、数 (NTA)、形態 (TEM)、分子組成 (LC-MS/MS)、表面表現型 (ExoView)、特定タンパク量 (ExoELISA/WB) を相互補完的に確認する体系が実現された (Figure 1、Table 1〜3)。ExoView は 50-200 nm の単一小胞分解能でサブポピュレーションの表現型多様性を定量できる点で NTA や bulk 解析に対して優位性を持つ。WB での 5 μg (細胞/組織) vs. 20 μg (血漿) という推奨ローディング量の違いは血漿 EVP のタンパク単位量の低さを反映しており、NTA 粒子数と WB タンパク量の両指標を組み合わせることで試料間の比較精度が向上する。プロテオミクスデータは PRIDE PXD018301 で公開されており、外部施設が解析結果を直接比較できる参照基準として機能する。
考察/結論
先行研究との違い: 本プロトコルの最も重要な貢献は、MISEV2018 ガイドラインが推奨する複数アッセイによる EVP 特性解析を、具体的かつ再現可能な標準操作手順として公開した点に新規性がある。これまでの研究では NTA、TEM、ウエスタンブロットのいずれか一つまたは二つの組み合わせのみで EVP を特性解析することが多く、クロスバリデーションの欠如が研究間の結果解釈のばらつきを生んでいた。従来の単一プラットフォーム EVP 解析と異なり、本プロトコルは6種の手法を同一 EVP 調製物に対して系統的に適用する新規な一貫した解析枠組みを提供している点で、既報の個別手法プロトコルとは根本的に異なる。
新規性: 本研究で初めて、ヒトおよびマウス由来の EVP を多角的に解析するための包括的なクロスプラットフォームプロトコルを確立し、その実践的な手順と検証結果を詳細に示した。これにより、EVP 研究の標準化と施設間再現性の向上に大きく貢献することが期待される。特に、LC-MS/MSによるプロテオーム解析と、ExoViewによる単一EVPレベルでの多重免疫検出を統合したアプローチは、EVPの分子組成と表面表現型の両面から詳細な情報を提供する点で新規である。
臨床応用: 本プロトコルがヒトがん患者組織・血漿とマウス (BALB/c・C57BL/6) の両試料に対応している点は前臨床-臨床橋渡し研究に特に有用である。Hoshino et al. Nature 2015 が示した EVP インテグリン発現と臓器特異的転移の関係や、Hoshino et al. Cell 2020 によるがん種特異的 EVP バイオマーカーパネルは、いずれもここで標準化された解析手法に基づいており、本プロトコルはそれらバイオマーカー戦略の他施設展開を直接可能にする。血漿 EVP を用いた液体生検や腫瘍微小環境評価への臨床応用においては、特に NTA、ExoView、ExoELISA の組み合わせが低侵襲で再現性の高い評価軸を提供する。
残された課題: 各プラットフォームには実用上の限界があり、現実的な運用において留意すべき制約が残された課題として存在する。ExoView は試薬コストが高く、利用可能な標準抗体の種類が限られており、カスタム抗体使用には事前タイトレーション・特異性検証が必須である。LC-MS/MS は装置コスト、専門知識、解析パイプラインの要求水準が高く、全施設での実施は現実的でない。ExoELISA はタンパク質の存在量が質量スペクトル面積値 2×10^7 未満の場合には検出感度の限界に達し、膜タンパク質に乏しい非膜粒子の定量は passive adsorption 効率の問題から過少評価となる可能性がある。WB による患者血漿 EVP の正規化戦略については比較研究が乏しく、最適な内部対照タンパク質の確立が今後の検討課題として残る。今後の展望として、シングルパーティクル解析の次世代技術である dSTORM 超解像顕微鏡 (100 nm 以下分解能) やナノ粒子フローサイトメトリー (Apogee A60 Micro) との統合が挙げられており、EVP サブポピュレーション解析のさらなる高度化が期待される。PRIDE での生データ公開、C18 StageTip の詳細作製手順 (Figure 2) は Open Science の観点から外部施設での完全な手順再現を可能にし、将来の EVP 標準化指針策定の参照プロトコルとしての役割が期待される。
方法
サンプル・倫理: ヒトがん組織および隣接正常組織は Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) および Weill Cornell Medicine (WCM) の IRB 承認 (IRB 15-015 および WCM IRB 0604008488) を得て、患者から外科的に採取された。ヒト血漿も使用された。マウスは BALB/c および C57BL/6 野生型雌 6〜8 週齢が使用され、IACUC 承認 (Weill Cornell Medicine protocol 0709-666A) の下で実験が実施された。細胞株としては、MDA-MB-231 (乳がん)、PANC-1 (膵臓がん)、AsPC-1 (膵臓がん)、A549 (肺がん)、HCT116 (大腸がん)、B16-F10 (マウス黒色腫) が用いられた。
EVP 単離方法: 差速超遠心分離法により EVP を段階的に分画した。具体的には、500g (10 分) → 12,000g (20 分、12,000g ペレット上清 = 分画①) → 100,000g (70 分、100,000g ペレット = 分画②) の順に実施した。分画①は NTA、ExoView、ExoELISA に使用され、分画②は TEM、ウエスタンブロット、LC-MS/MS、NTA、ExoView、ExoELISA に使用された。
EVP 特性解析マーカー: CD9、CD63、CD81 (テトラスパニン) が表面マーカーとして使用された。Syntenin-1 (エクソソーム特異的マーカー) および Actin (負荷対照) はウエスタンブロットの内部対照として用いられた。
NTA (NanoSight NS300/NS500): カメラレベル ≤12、スクリーンゲイン 1 の統一条件で 60 秒間×3 回のキャプチャーを実施した。100 nm 標準ビーズ (NanoSight NTA4088、開始希釈 1:500) でフォーカスを確認した。サンプル希釈は Table 1 に従い、血漿分画① 1:500〜1:3,000、細胞培養上清分画① 1:50〜1:200、組織条件培地 1:500〜1:2,000 (肝臓など高 EVP 産生臓器では 1:2,000 を超える希釈が必要) とした。粒子数が 2×10^8〜2×10^9 particles/mL の範囲に収まるよう希釈を調整した。分画②については 2〜5 μg/mL (血漿) または 1 μg/mL (細胞株・組織) で測定した。
TEM (JEOL JEM 1400): Formvar-carbon コーティング 400 メッシュ銅グリッドに Pelco easiGlow でグロー放電を施し親水化後、0.1 μg/μL 濃度の EVP 分画②を 5 μL アプライして 1 分間吸着させた。1.5% ウラニル酢酸 (uranyl acetate) による 4 段階の負染色後、100 kV で操作した。Veleta 2K×2K CCD (Charge-Coupled Device) カメラで 3 ランダム視野×50,000 倍および 100,000 倍で撮像した。
LC-MS/MS プロテオミクス: 8 M 尿素/50 mM ABC (ammonium bicarbonate) バッファーで変性、DTT (1,4-Dithiothreitol) (10 mM) 還元、iodoacetamide (IAA) (25 mM) アルキル化後、Lys-C (overnight, 室温) とトリプシン (6 h, 室温) の二段階消化を行った。自作 C18 StageTip マイクロ精製チップ (3M C18 抽出ディスクを 16G ニードルで打ち抜き 200 μL チップに積層、Figure 2 参照) で脱塩精製した。Q-Exactive、Q-Exactive HF、Fusion Lumos (Thermo Fisher) と Dionex 3000 または Easy-nLC 1200 を用いて 90 分間のリニアグラジエント (1%→35% B、A: 0.1% ギ酸、B: 80% アセトニトリル/0.1% ギ酸) LC-MS/MS 分析を実施した。Proteome Discoverer 1.4.1.14/Mascot 2.5 で同定 (FDR 1%/file、Percolator) し、human は UniProt HUMAN proteome、mouse は UniProt MOUSE proteome に対してクエリを行った。推奨開始希釈率: 血漿① 1:50、血漿② 1:50 (Table 2)、細胞培養上清② 1:7,500 (最大希釈 1:2,500)。データ解析は R (Limma パッケージ、quantile normalization)、GENE-E、GSEA/MSigDB、MaxLFQ を用いた。
ExoView R100 (NanoView Biosciences): EV-TETRA-C チップ (CD9・CD63・CD81 抗体スポット) に EVP (血漿分画① 10 μL を Solution A で希釈) を 16 時間インキュベーション後、Alexa Fluor 488 (CD9)・555 (CD81)・647 (CD63) 標識抗体 1:600 で蛍光検出 (ExoScan 2.5.5/ExoViewer 2.5.0) した。カスタム抗体 (CETP・S100A9・B2-microglobulin・RhoV 等) は 0.2 μg/mL から事前タイトレーションを推奨した。サイジング閾値は 50〜200 nm とした。mouse IgG (MIgG) をバックグラウンド対照として粒子数を補正した。
ExoELISA: pH 9.4 炭酸水素ナトリウムコーティングバッファーで 96 ウェルプレートを EVP (10〜30 μg/mL) でコーティングし、TNB バッファー (0.1 M Tris-HCl pH 7.5/0.15 M NaCl/0.5% TSA blocking reagent) でブロッキングした。一次抗体は 1:50〜1:200 (TNB バッファーで希釈)、二次抗体は 1:200〜1:500 (TNB バッファー) で使用した。検出は蛍光イメージングシステムまたは HRP (Horse Radish Peroxidase) 基質による比色/化学発光で行った。
ウエスタンブロット: RIPA バッファー + プロテアーゼ/フォスファターゼ阻害剤で EVP 分画②を溶解 (4°C・30 分振盪) した。BCA (Bicinchoninic Acid) アッセイでタンパク定量後、5 μg (細胞株・組織由来 EVP) または 20 μg (血漿由来 EVP) を 4〜20% Tris-Glycine ゲルで泳動 (100 V 30 分 → 150 V 60 分) した。PVDF (Polyvinylidene Difluoride) 膜に転写後、2.5% BSA (Bovine Serum Albumin) でブロッキングした。CD9 (0.1 μg/mL)・Syntenin-1 (0.1 μg/mL) を一次抗体、HRP 標識ヤギ抗マウス IgG (1:10,000) を二次抗体として ECL (Enhanced Chemiluminescence) 検出した。